基因工程的基础知识与基本技术.pptx

1、基因工程基础知识与基本技术,基因工程基础知识基因工程的基本技术,基因工程基础知识,1 基因及基因的结构特点什么是基因？基因是编码蛋白质或RNA分子遗传信息 的基本遗传单位。,根据这个概念，一个基因不仅含编码蛋白质肽链 或RNA分子的核酸序列,还包括保证转录所必需 的调控序列及位于编码区上游5端的启动子非 编码序列、内含子（intron）和位于编码区下游 3端的终止子非编码序列。前者的编码区是基因功能发挥的结构基因（或功 能基因），而后者起调控启动，终止的非编码区 属于调控基因。,基因学说的发展,1953年，Watson与Crick创立DNA双螺旋 结构模型ATGC,既然DNA分子是基因的载体，

2、那么是否 每一段DNA都是基因呢？,1.1 基因的结构特点,共同特点,组成,基,因都是由基因结构序列和调节序列基因包括：启动子、增强子、终,调节,止子等3尾巴,5帽子,终止子结构,原核生物基因的结构特点,原核生物的绝大多数DNA分子都用于编码蛋白质(生 物化学，P505）；功能相关的RNA和蛋白质基因多集中在基因组的一个或几个特定部位，形成功能单位或转录单元(生物化学，P466）；尽管重叠基因的DNA序列大致相同，但基因重叠部位 一个碱基的变化变可以影响后续肽链，编码完全不同 的蛋白质,多顺反子：编码多个蛋白质的mRNA多顺反子是一组相邻或相互重叠基因的转录产 物，这样的一组基因被称为一个操纵

3、子SD序列：起始密码子的上游7-12bp处的一段 序列，在与16S核糖体的结合过程中起作用,原核生物基因的转录机制：,DNA模板的识别转录的起始 转录的延伸 转录的终止,s 因子序列特异性识别DNA模板,s因子,RNA聚合酶核心酶,原核基因转录的起始,原核基因转录的延伸,原核基因转录的终止,真核生物基因的不连续性：外显子、内 含子、连接区,真核生物基因 的转录、加工,中心法则,基因工程的基本操作技术及原理,核酸的凝胶电泳PCR技术分子杂交基因突变技术,我是快乐的小猪,1 电泳技术,生物大分子在电场作用下在凝胶中的运动。琼脂糖电泳DNA、RNA的分离、分析,聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA的分析与纯化,

4、蛋白质及小分子质量的,SDS-PAGE,2-D电泳,普通琼脂糖电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,RNA,蛋白,差异显示图谱,D,1.1 电泳迁移率与生物大分子属性的关系分子的大小所带电荷的多少构型或形状的差异,DNA的琼脂糖凝胶电泳,不同大小的DNA需要不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。,琼脂糖浓度与DNA分离范围,琼脂糖浓度/%线状DNA大小/kb,0.50.730-112-0.8,1.01.21.510-0.57-0.4 3-0.2,2.02-0.05,不同构型DNA的移动速度次序为：,共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA,1.2 电泳迁移率同凝胶及浓度的关系,凝胶类型：琼脂糖凝胶、聚丙烯

5、酰胺凝胶浓度：高、低,天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电 荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由 于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗 现象。,1.3 电泳迁移率与电场的关系,在一定电场中，电压越高，电泳速度越快；随着电压的升高，不同长度的DNA流动泳动 的增加程度不同，因而凝胶的有效分离范围 反而下降,分子生物学实验室核酸电泳系统,琼脂糖电泳,样品配制与加样DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲 液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示

6、染料，,含有10%-15%蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，使样品集中。,1.4 染料,EB:溴化乙锭,Goldview,SYBR Green I,分子生物学实验室凝胶成像系统,染色和拍照常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外 光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或 用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数 据分析。,2 PCR(polymerase chain reaction)技术,PCR技术产生背景1958年，DNA聚合酶（polymerase)分离1976年，Chien分离出热稳定的聚合酶1983年，Mullis建立了PCR的反应过程，并获得 了诺贝尔奖1986年，分离出适用于PCR

7、的Taq热稳定聚合酶人工合成寡核苷酸方法的发展与成熟,2.1PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,变性,变性不完全：导致PCR失败，未完全变性的双链DNA会很 快复性，减少DNA产量；变性时间过长或温度过高：导致聚合酶活性下降，扩增效 率降低Taq酶活性的半衰期为：92.5度130 min;95度40 min;97度5min,退火引物退火的温度和所需时间取决于引物的碱基组成、引 物的长度，引物与模板的匹配程度及引物的浓度。退火温度越高，所得产物的特异性也越高实际使用的退火温度双扩增引物的Tm值低5-10度,退火温度的选择,两条引物间的Tm值相差小于5，最好1。退火温度以

8、两条引物中Tm值较低的为准，并 且低5-10 Tm=（A+T）X2+（C+G）X4退火温度=Tm-(5-10)A T C G指引物与模板直接配对的部分，外加碱基不算Tm=69.3+0.41*(G+C)/N*100-650/N,延伸延伸反应通常在72度进行，接近Taq酶的最适温度75度。在一般反应体系中，Taq酶每分钟可以合成约2kb长的 DNA片段。在能完成DNA合成的前提下应尽量缩短延伸时间，减 少Taq酶活性的损失。,循环次数当其他参数确定后，循环次数主要取决于模板DNA的 浓度。一般来说，循环次数2535轮已足够。循环次数过多，会使PCR产物严重出错，非特异性产物增加。,2.1 PCR反

9、应程序,PCR反应的温度循环周期,在实际操作 过程中，会 增加预变性 3-5 min,2.2 PCR反应成分,（1）引物DNA聚合酶需要一小段双链DNA来启动新链的合成。所谓PCR扩增引物，是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段，其长度在1530个核苷酸之间。上游引物，是与基因的5端互补的寡核苷酸，用于扩 增编码链；下游引物，是与基因的3端相同的寡核苷酸，用于扩 增DNA模板链。,两引物在模板DNA上结合之间的距离决定了扩 增区段的长度。实验表明，1kb之内是理想的扩增长度；2kb是 有效的扩增长度；3kb以上则难上有效的扩增。,设计引物的基本原则,引物长度：15-30

10、 b，指模版与引物相配对的 碱基数；应随机排列，避免同一碱基串联。e.g.引物长度为8个核苷酸：4865 536 bp43 000个可能 17个核苷酸：41717 179 869 184 bp超过5倍人类基因组DNA长度：3109 bp,可以在5端加适量的保护碱基或酶切位点序 列原因：5端的无关序列不会影响引物特异序列的 退火引物的3末端和模板的碱基要完全配对,设计引物的基本原则,防止引物对间及引物内的同源性，尤 其是3端不能出现碱基同源，3最好 不出现碱基A,设计引物的基本原则,GC的合理含量与Tm值的范围目的：ATGGGAAGC TGC TGT TA CTC CGCACTTCG GAC-C

11、TCCTAAGA CAC TCT CTA CAG-3上游序列：ATGGGAAGCTGC TGT TACCTC G+C含量=？%下游序列：CTG TAG AGA GTGTCT TAG GAG-3 G+C含量=？%,诱变寡核苷酸引物的设计,设计原则：与靶DNA的适当链互补，与靶的其它区域不能错 误杂交足够的长度与靶序列特异结合，1-2个碱基改变的 引物要求至少25bp长3.3.错配碱基位于中央位置，使每侧有10-15bp与模 板链完全配对。有效引入多于3个核苷酸突变时，要求引物在诱变点的每侧有30个核苷酸与模板互补4.4.5端与模板完全互补，从上游引物起始的DNA 合成不会取代诱变寡核苷酸,DNA

12、聚合酶的53 外切核酸酶活性是造成上游DNA合成取代5核苷酸 的原因,诱变寡核苷酸引物3区域有10-15bp与模板链完全 配对，形成足够稳定的杂交分子，有效地从诱变寡 核苷酸引物3端引发DNA的合成无回文、重复或自身互补序列，否则，形成二级结 构，与靶序列杂交率降低，导致得不到突变体必要时可在诱变寡核苷酸上加上新的酶切位点，或消除靠近诱变点的已有酶切位点，便于诱变后通 过限制酶消化筛选侯选突变子,引物的设计软件：Oligo 6,Premier Primer,DNAstar,FastPCR etc.其他概念：简并引物，嵌套引物,PCR反应成分,(2)Taq酶(3)反应缓冲液10-50 mM Tr

13、is-HCl，50 mM KCl，2.5 mM MgCl2(4)dNTPs:dATP,dTTP(dUTP),dGTP,dCTP(5)模板：DNA,RNA,cDNA等,5,Primer 15Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,5,5,55,5,5,5,5,一、基本工作原理,Cycle 3,5,5,55,5,5,5,5,55,55,55,55,2530 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。,几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术（二）实时PCR技术（三）梯度PCR技术,反转录 PCR(Reversetrans

14、cription PCR，RT-PCR),反转录PCR：mRNA-cDNA-PCR抽提RNA反转录合成cDNAPCR 扩增,AAAAAAA-3,AAAAAAA-3 TTTTTTT-5,mRNA,cDNA,TTTTTTT-5,cDNAPCRRT-PCR,反转录酶+dNTPs,RT-PCR检测LOX基因表达情况,LOX-3,LOX-5,M1 2 3 4 5 6,M1 2 3 4 5 6,1:0 3d,2:0 16w,3:6 3d,4:6 16w,5:20 0d,6:20 15d,18S rRNA,实时荧光定量PCR,PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端

15、分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭 荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧 光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶 的5端3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而 荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增 一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现 了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,实时PCR技术原理,梯度PCR,利用梯度PCR仪对解链、退火及延伸设置温度梯 度，适用于摸索试验条件时，多次试验可在一 台仪器上完成，既节省试验时间，提高效率，又节省试验成本。,梯度PCR,锚定PCR不对称PCR反向PCR多重PCR(

16、例如:RAPD)着色PCR,3分子杂交印迹技术,核酸分子杂交在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链 分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在异源的分子之间形成杂化双链.。,一、分子杂交与印迹技术的原理,复性,RNA,DNA,印迹技术经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子都 是在杂交之前通过毛细管作用被转移到 滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原 位地“复印”上去的，这一过程称为“印迹”。,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术(Southern blotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体 的分析。（二）RNA印迹技术(Northern blotting)用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,斑点杂交(dot blotting)原位杂交(in situ hybridization)DNA芯片技术(DNA chip)RNA芯片技术(RNA chip)蛋白质芯片(RNA chip),三、印迹技术的特点,灵敏度高特异性强,三