进出口食品中白菖蒲油含量的测定编制说明.docx

1、进出口食品中白菖蒲油含量的测定编制说明进出口食品中白菖蒲油含量的测定编制说明一、任务来源本标准是根据国家认证认可监督管理委员会关于下达2009年出入境检验检疫行业标准制(修)订计划项目的通知（国认科函文件2009212号）文件下达的任务，由中华人民共和国浙江出入境检验检疫局起草完成，计划编号为2009B527。二、编制依据和原则1. 本标准是按照GB/标准化工作导则第一单元：标准的起草与表述规则第一部分：标准的结构和编写的规则、GB/标准编写规则第4部分：化学分析方法及SN/T0001-1995出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定（简称基本规定）的要求编写的。2. 本

2、标准起草人通过查阅相关资料和文献，结合本实验室的条件和原有工作基础，以及本方法的技术特点，通过大量的实验室内回收率、精密度及应用范围等一系列试验验证研究，建立了一个高选择性、高灵敏度测定进出口食品中白菖蒲油含量的液相色谱-荧光检测方法。本标准经五家实验室验证，方法的重复性、相对标准偏差均符合标准要求。三、起草过程2010年5月10月 进行资料查阅、汇总，调查研究，实验方案初步设计，成立起草小组，完成实验前期准备工作。2010年10月12月 选择检测仪器和对液相色谱-荧光法进行测定条件摸索及优化，试验研究样品前处理方法，初步建立食品中白菖蒲油含量检测方法。2011年3月6月 对不同基质样品，进行

3、方法验证实验，整理数据。2011年7月2011年10月 进行实验室间的协同试验和验证工作，完成标准的征求意见稿。2011年11月12月 完成意见汇总的工作，修改征求意见稿，完成送审稿。四、研究背景白菖蒲油（Calamus Oil）是国际市场上重要的精品油之一，由天南星科植物白菖蒲（Acorus Calamus L.）根茎经水蒸气蒸馏取得，为淡黄至淡褐色粘稠状挥发性精油，呈奶油似香气，略带苦辣味。在植物油、矿物油和丙二醇中的溶液中呈乳光，微溶于水，溶于乙醇、乙酸乙酯、乙醚及氯仿中。CAS登记号为8015-79-0。白菖蒲油主要用于调制高级化妆用品，也用于肥皂的加香剂、烟草和白酒的添加剂，特别是在

4、饮料行业中，在创制保健饮料方面有着广阔的前景，例如俄罗斯的伏特加酒就是以白菖蒲油作为添加剂的，东南亚一些岛国用作熏制食品的香料剂。白菖蒲油的主要活性成分为-细辛醚（又称-细辛脑）和-细辛醚（又称-细辛脑）。-细辛醚（- Asarone）和-细辛醚（- Asarone）为同分异构体，化学名称为1,2,4-三甲氧基-5-（1-丙烯基）苯（1,2,4-trimethoxy-5-(1-phenyl)benzene），分子式为C12H16O3，分子量为，CAS号分别为2883-98-9，5273-86-9。结构式见图1。 图1 -细辛醚和-细辛醚的结构图美国食品药物管理局(FDA)在1971年宣称白菖蒲

5、油中的细辛醚具有致癌性。因白菖蒲油可能会对人体带来潜在的健康危害，欧美等国家对其人体摄入量作出了严格限定。由消费者健康保护协会欧洲委员会食品科学委员会发布，2001年12月12日实施的食品科学委员会对调味剂和其它食品配料中含-细辛醚的评价中明确提出-细辛醚日最大可摄取量为115 ，相当于2 g/。美国等国家规定菖蒲及其精油不允许在食用香精中使用。到目前为止，国内还尚未制定关于白菖蒲油在食品中的含量测定标准。为更好地与国际贸易接轨，有效避免国际贸易中的被动应检，维护我国食品出口量的持续增长，同时保证我国进口食品的质量，保障人民身体健康，监控进出口食品中食品添加剂的应用，满足我国食品进出口贸易、检

6、验检疫和监督管理工作的实际需要，建立进出口食品中白菖蒲油的特征成分细辛醚的分析方法是很有必要的。据文献报道，目前-细辛醚和-细辛醚的检测方法主要集中在高效液相色谱-紫外检测法和气相色谱法，仅限于测定药材和烟草中其含量。国内外尚无针对食品中细辛醚含量检测方法的报道，也尚未建立相关检测标准。本标准对食品中-细辛醚和-细辛醚含量的提取和净化方法进行了研究，对色谱条件进行了优化，建立了液相色谱-荧光色谱法。将样品基质范围扩大至奶粉、绿豆糕、猪肉、熏鱼肉、调味粉、白酒、伏特加酒。方法的灵敏度和准确性能够满足国内外对食品中白菖蒲油有效成分-细辛醚和-细辛醚含量测定的需求。五、本标准分析条件的选择1. 提取

7、、净化条件的选择（1）提取剂的选择-细辛醚和-细辛醚溶于甲醇、乙腈和乙酸乙酯中。本实验采用甲醇、乙腈和乙酸乙酯提取，结果表明三者均有满意的回收率，但经过试验发现乙酸乙酯、甲醇提取的杂质较乙腈多，特别是油状物的杂质，因此本实验选用乙腈作为本方法的提取溶剂。（2）净化条件的选择采用上述条件进行提取后，虽然可以直接进样，并在-细辛醚和-细辛醚色谱峰附近没有干扰，但是未净化提取液中含有大量的杂质，如直接进样会对色谱柱造成污染，增加仪器的维护成本，减少仪器使用寿命，所以需对提取液做进一步净化。根据-细辛醚和-细辛醚的极性大小等理化性质，本标准研究了C18、HLB（waters公司）、弗罗里硅土和Sili

8、ca硅胶四种固相萃取方法的净化效果，在上样液的选择上，分别比较了乙腈、甲醇、甲醇-水混合体系，乙酸乙酯、正己烷；在淋洗溶剂的选择上，分别比较了乙腈，乙酸乙酯，甲醇，乙酸乙酯-正己烷混合体系的回收率和净化效果。经过优化，选择了Silica硅胶固相萃取小柱净化，正己烷作为上样液，乙酸乙酯作为洗脱液的固相萃取净化方法。（3）浓缩条件的选择作为提取剂的乙腈因为量较多，所以采用减压旋转蒸发浓缩，水浴温度控制在45 左右；净化后的洗脱液本试验拟采用上述减压旋转蒸发浓缩和氮吹浓缩方法，但试验表明氮吹浓缩回收率不理想，因此净化后的乙酸乙酯洗脱液也采用减压旋转蒸发浓缩，水浴温度控制在45 左右。2. 仪器的选择

9、根据-细辛醚和-细辛醚在中药材、药品和烟草中含量测定相关的文献报道，归纳整理设计了液相色谱-紫外检测器、气相色谱-FID检测器、气质联用仪和液相色谱-荧光检测器四种方案。试验表明上述四种仪器最低检出限分别为 mg/kg，10 mg/kg， mg/kg， mg/kg，与相关文献报道的相符。根据欧洲委员会食品科学委员会发布实施的食品科学委员会对调味剂和其它食品配料中含-细辛醚的评价对食品中-细辛醚限量的要求(-细辛醚日最大可摄取量为115 )和美国禁止使用白菖蒲油要求，本方法选择用检出限较低的液相色谱-荧光检测器法测定。3仪器条件的优化（1）检测波长的优化对-细辛醚和-细辛醚标准溶液检测波长扫描，

10、固定激发波长257nm，对发射波长进行扫描，得到最大发射波长为365nm，固定发射波长为365nm，对激发波长进行扫描得到最大激发波长为265nm，确定分析得激发波长为265nm，发射波长为365nm。（2）色谱条件的优化试验采用Agilent XCB C18 (250 mm.) mm，5m)和Agilent Extend C18 (250 mm.) mm，5m)色谱柱，甲醇-水，乙腈-水作为流动相的分离效果，结果表明两种色谱柱和两种流动相都能得到满意的效果。考虑甲醇的成本较低，因此本标准选择Agilent XCB C18（5m），250 mm mm(id)色谱柱，甲醇-水（60+40，V/V

11、）作为流动相，30作为参考色谱条件。6、方法的主要技术指标（1）线性范围和测定低限用甲醇配成-细辛醚和-细辛醚浓度分别为 mg/L、 mg /L、 mg/L、 mg/L、 mg/L和 mg/L六个浓度的混合标准标准工作液。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，峰面积法定量。在上述色谱条件下，-细辛醚和-细辛醚的保留时间分别约为12 min和14 min，-细辛醚线性方程Y=+，相关系数为；-细辛醚线性方程Y=+，相关系数为，标准物质的色谱图参见图2。 本方法的-细辛醚和-细辛醚的测定低限（LOQ）均为 mg/kg。空白样品添加谱图见图3图16。（2）方法的回收率和精密度用不含-细辛醚和-细辛

12、醚的奶粉、绿豆糕、猪肉、鱼肉、调味粉、白酒、伏特加样品进行添加回收和精密度试验，各基质空白和添加测定低限水平的液相色谱见图3图16。添加回收率和精密度结果见表1、表2。方法的回收率和精密度符合SN/T 0005-1996出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定对回收率和精密度的要求。（3）本方法的验证结果本方法经上海局动植物与食品检验检疫技术中心、宁波局检验检疫技术中心、海南局检验检疫技术中心、义乌局综合技术中心、农业部水稻及制品质量监督检验测试中心等五个实验室进行室间重复性验证。样品添加 mg/kg， mg/kg， mg/kg，测定结果见表3。图2 -细辛醚和-细辛醚标

13、准品液相色谱图 图3 伏特加空白样品的液相色谱图 图4 伏特加样品加标的液相色谱图（ mg/kg）图5 白酒空白样品的液相色谱图 图6 白酒样品加标的液相色谱图（ mg/kg）图7 猪肉空白样品的液相色谱图 图8 猪肉样品加标的液相色谱图（ mg/kg）图9 奶粉空白样品的液相色谱图 图10 奶粉样品加标的液相色谱图（ mg/kg）图11 熏鱼肉空白样品的液相色谱图 图12 熏鱼肉样品加标的液相色谱图（ mg/kg） 图13 绿豆糕空白样品的液相色谱图 图14 绿豆糕样品加标的液相色谱图（ mg/kg）图15 调味粉空白样品的液相色谱图 图16 调味粉样品加标的液相色谱图（ mg/kg）表1

14、实验室内样品的-细辛醚添加回收率及精密度（n=6） 伏特加添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值.RSD ( %)白酒添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %) 猪肉添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %) 绿豆糕添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %)熏鱼肉添加水平 mg/kg mg/kg m

15、g/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %) 奶粉添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %)调味粉添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %) 表2 实验室内样品的-细辛醚添加回收率及精密度（n=6） 伏特加添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %)白酒添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测

16、定值回收率%123456平均值RSD ( %) 猪肉添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %) 绿豆糕添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %)熏鱼肉添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %) 奶粉添加水平 mg/kg mg/kg mg/kg测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %)调味粉添加水平 mg/kg mg/kg mg/k

17、g测定值回收率%测定值回收率%测定值回收率%123456平均值RSD ( %) 样品-细辛醚添加水平( mg/kg )验证单位平均回收率(%)RSD( %) 1 2 34 5调味粉伏特加100102熏鱼肉 表3 实验室间样品的添加回收率及精密度结果（-细辛醚） 表4 实验室间样品的添加回收率及精密度结果（-细辛醚）样品-细辛醚添加水平( mg/kg )验证单位平均回收率(%)RSD( %) 1 2 34 5调味粉伏特加熏鱼肉七、参考文献：(1)YC/T 361-2010 烟用添加剂 -细辛醚的测定 气相色谱-质谱联用法(2)吴闯.反相高效液相色谱法测定人血清中细辛脑浓度.中国药房, 2005,

18、l6(2)(3)张婷，崔颖，徐平声.高效液相色谱法测定细辛脑注射液的含量及有关物质.广东药学院学报,2006,22(5)(4)柯雪红,方永奇.RPHPLC测定石菖蒲、水菖蒲药材中-细辛醚、-细辛醚的含量.中国中药杂志,2004,29(3)(5)魏立平,昊玫涵.用气相色谱法同时测定石菖蒲挥发油中-细辛醚和-细辛醚的含量.解放军药学学报,2005,21(1)(6)Curro P, Micali G, Lanuzza Of Beta-Asarone, Safrole, Isosafrole and Anethole In Alcoholic Drinks by High-Performance Li

19、quid-Chromatography. Journal of Chromatography, 1987, 404(1): 273-278(7)Lander V, Worner M, Kirchenmayer C, Wintoch H, Schreier of Solid-Phase Extraction for Rapid Sample Preparation in the Determination of Food Constituents .2. Asarone, Quinine, Coumarin, and Quassine in Spirits. Zeitschrift fur Lebensmittel-Untersuchung Und-Forschun, 1990,190(5): 410-413