BDFACSCalibur流式细胞仪操作手册.docx

1、BDFACSCalibur流式细胞仪操作手册BD-FACSCalibur流式细胞仪操作手册LTBD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍表面抗原流式分析有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报.tw/bdb/index.html。如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载 .tw/bdb/10-5-3-1.html 。如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载 .tw/bdb/10-5-4-1.html 。一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关：在BD FACS

2、Calibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例FSC Diode 只收488 nm波长散射光SSC PMT 只收488 nm波长散射光FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。流速控制：LO： 样品流速：12 l /minME

3、D：样品流速：35 l /minHI: 样品流速：60 l /min功能控制：RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。）STANDBY： 无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VEN

4、T TOGGLE之位置。鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。鞘液过滤器：0.22m过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。5. 上样品区：上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针 Sample I

5、njection Tube，将样本输入流动室，还有就是支撑架 Tube Support Arm、和液滴存留系统 Droplet Containment System。进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品

6、时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。1.2 Macintosh计算机与打印机：准备您的细胞样品1.理想样品浓度调至1-10 X 105 cells/ml？一般实验只需0.5 ml的样品。2.细胞样品务必放至BD FALCON 352052 试管中，否则无法上机。3.上机前务必去除样品中之细胞团块，以防止管路堵塞？可使用附滤网BD FALCON试管 (Cat. No.352235) 或35-55 m的尼龙筛网。4.供流式分析的样品是单细胞悬浮液，而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原荧光染色的方法大致有两种：直接免

7、疫荧光、间接免疫荧光染色。研究生可至本公司网站下载染色方法 .tw/bdb/10-5-4-1.html 直接免疫荧光染色Lysed - No - Wash ProcedureLysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27Peripheral Blood Mononuclear Cell ProcedureLeukemia and Lymphoma Procedure 1Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay间接免疫荧光染色滴定抗体浓度常用试剂5.如因特殊因素无法下载上

8、述实验方法，请e-mail：yenchichen.tw或 austin_bdtwn.tw。二、开机、关机标准操作2.1 FACS Calibur 开机1.开启细胞仪电源。2.开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。3.开启计算机。4.确认鞘流液筒有八分满的FACS Flow，确实旋紧 (鞘液筒容量为4L)。5.将废液倒掉，并在废液筒中加入200 ml 家用漂白水 (废液筒容量为4L)。6.将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。7.排除液流管路与过滤器中的气泡。8.取下样品管，执行 PRIME 功能两次。9.使用1ml PBS，HIGH RUN 两分钟。10.可开始分析样品。2.2

9、FACS Calibur 关机关机前必要动作：清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。1.将样品支持架左移，取 2 ml FACSClean（10%Bleach）上样品，让仪器的真空系统抽取约 1 ml 的液体。2.将样品支持架回正，按 HI RUN，然后让 FACSClean 清洗管路10分钟。3.按 Standby，取下样品管，执行 PRIME功能两次。4.取 2 ml dH2O，重复上述步骤1-3。5.注意最后只留约 1 ml dH2O 在试管中。6.按 STANDBY 五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作，以保护雷射光源。）7.倒掉废液，并回填 200 ml漂白水。

10、8.将减压阀放在VENT 漏气位置。将鞘流液筒充填至八分满。9.退出软件“File”“Quit”(如有对话选项，选择“Dont save”)。确认退出计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。10.关闭计算机。“Special”“Shutdown”。三、上机分析流程建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。（1）Negative Control（不加任何抗体）。（2）CD3-FITC（FL1 单染）。（3）CD19-PE（FL2 单染）。（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。3.1 Calibur 开机1. 先开启细胞仪本体再打开计算机。 *秘技1：如

11、顺序相反，仪器和计算机之间无法建立正常通讯，无法执行“connect to cytometer”。 解决之道，两者都关机、然后以正确方式重开。2. 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向调在VENT位置（箭头方向）。3. 仪器会对鞘流液筒打气加压，请确认筒盖确实旋紧。 *秘技2：将减压阀方向调在加压（向前）位置。减压阀如在VENT（箭头方向）位置，按RUN功能键时将显示橙黄色（表示仪器不正常，请检查是否失压），正常为绿色显示。3.2开启CellQuest 软件、编辑实验文件4. 在苹果菜单下点击CELLQuest 启动软件。桌面会出现一Untitled 实验文件

12、，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。5. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框。6. 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition (收取) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。在颜色方框中点击Multicolor Gating（收取样品时，门内细胞将出现颜色）。点击OK。此时实验文件会出现FSC/SSC散点图。7. 说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中，横坐标X轴为为荧光

13、1强度的相对值，单位是道数，纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024；第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。8. 从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024，Y轴：FL2-H 1024。点

14、击OK，FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。9. 在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。建立仪器和计算机之间通讯10. 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer，此时会出现Acquisition Control 对话方框。如果无法选择Connect to Cytometer，参考秘技 #1。如果没见到Acquisition Control 对话，可到屏幕上方Windows菜单中选择Show Acquisition Control。仪器设置

15、文件注意：实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件（Instrument settings），含信号器高压（Detector/ Amps），阈值（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps - Threshold - Compensation。11. 检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SS

16、C为LIN（线性放大），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。12. 从Cytometer菜单中选择Threshold，出现 Threshold 窗口在Threshold 窗口：确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。13. 从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白区。3.3 上样品、设置仪器14. 使仪器处于High RUN，支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认Acquisition Control 窗口中 Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据)，点击Acquire。 调节FSC/SSC探测器

17、（电压）15. 观察FSC/SSC图的变化。FSC电压(Voltage)预设为E00，可调节 Amp Gain 从1.009.99 使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击Acquisition Control 窗口中的Pause。Gating 圈选细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射与侧方散射的二维位图，即散射光图谱（Scatter Plot），来

18、圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。16. 在工具板中选择多边形的Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1 区域（如下图）。分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。如果要删除R1区域，您可以在工具列中点选Gates Region list ，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。17. 选取希望Gate的FL1/FL2散点图，从Plots菜单中选择Format dot plot。在出现的对话方框内，将No Gate 改选 G1=R1。点击O

19、K。 调节FL1、FL2的探测器（电压）18. 点击Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中调节FL1、FL2的电压，使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之100-101处。19. 在Threshold 窗口，适当地提高FSC阈值52，以去除碎片或低阶噪音。唯需注意不要切掉主要细胞族群。 20. 点击Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去阴性对照管，关闭Detector/Amps、Threshold窗口，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。调节荧光补偿说明：最适化的最后

20、一步是调节光谱重迭。（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是2色样本，必要时需调节FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色样本，必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿）。21. High RUN，换上单染CD3-FITC管。点击Acquisition Control窗口中的Acquire。调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。补偿调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。调节完毕，点击Acquisition Control窗口中的Pause。22. 移去单染CD3，换上单染CD19-PE管。点击Acquisit

21、ion Control窗口中的Restart。调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。调节完毕，点击Acquisition Control窗口中的Pause。23. 最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机，点击Acquisition Control窗口中的Restart，确定三群细胞工整垂直。当您已完成2色荧光之光谱重迭时，点击Acquisition Control窗口中的Pause、Abort。24. 移去样本管，换上dH2O管，让仪器暂且处于Standby状态。关闭Compensation窗口。您已完成2色荧光之最适化。3.4收集实验数据决定储存细胞总

22、数25. 预设之储存细胞总数为10000。如需修改，从Acquire菜单中选择Acquisition & Storage，并在出现的窗口功，确认Collection Criteria从10000 of All，再点击OK。 26. 找个档案匣准备储存数据。从Acquire 菜单中选择Parameter Description，出现Parameter Description对话方框。点击Folder，并在随后出现之对话方框，选择Your Folder或新建活页夹，点击此对话方框的Select Your Folder。27. 命名即将储存之文件名：点击Parameter Description对话

23、方框的File，出现文件名编辑窗口。在Custom Prefix中：输入文件名20031231，点击此对话方框的OK。日期为最常用之文件名系统。28. Optional：如有需要，可选择或在P1-P5后的空格中输入相关参数名。如P1：Size, P2：Granularity, P3：CD3 FITC。输入参数名会存入实验档案中，显示在图谱上。计数器Counters29. 从Acquire 菜单中选择Counters. 窗口会显示样品分析速率、与总数进度。收集实验数据30. 你可以开始收集实验数据了。HIGH RUN，将第一管样品放到检测区，在Acquisition Control窗口中，将 S

24、etup 改成 Setup，此时CellQuest会自动显示 Your Folder：20031231.001为资料文件名。点击“Acquire” 便可启动样品之分析测定与数据储存。当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据文件20031231.001，并会以“嘟”声告知，CellQuest会自动升幂附加档名成20031231.002。等待下一指示。31. 你可以换上下一管样品，点击“Acquire” 启动样品之分析测定与数据储存。可继续分析直到所有检品都分析完毕。3.5实验数据之储存与备份：32. 不建议长期使用硬盘储存数据数据，可考虑以烧光盘（如配有 CD-RW）、口袋硬盘（Flash D

25、rive）来备份大量实验数据，以免占用原有硬盘的内存，影响数据处理速度。可将备份后之数据，拿到另一苹果计算机或个人PC进行离机分析。33. 确认所有档案皆己备份后，以鼠标圈选欲删除数据，将其拖拉至Trash筒。退出软件34. 检品分析完毕后，记得从屏幕上方 File 指令栏选择 Save As，储存实验文件，以备日后使用，不需每次重新编辑。35. 从屏幕上方 Cytometer 指令栏，选择Instrument Setting，出现Instrument Setting窗口。点系print打印此次实验条件，可贴入实验笔记留底，再点击Save以储存此一实验的仪器条件，供日后再使用。点系SAVE后会

26、出现文件保存对话方框，选择文件目录及文件名（例：Your Folder：/Your Setting1），点击Save。点击Done。36. 检品分析完毕后，用鼠标从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取Disconnect to Cytometer 以断绝计算机与仪器间之联机。之后如不分析数据，您可退出软件“File”“Quit”(遇有选项永远选择“Dont save”)，进行关机程序。 管路清洗37. 以2 ml 10 漂白水取代样品，将样品架置于左位以外管吸除约1 ml，再将样品架置于中位 HI RUN 十分钟。改用 2 ml DI water。重复上述程序，样品架上留约 1 ml DI

27、 water 。按STANDBY五分钟。关主机、关计算机四、数据分析FCS list mode数据文件： 说明：FCS list mode数据文件是流式细胞仪的标准格式档案（FCS2.0）。该文件含有从流式细胞仪收取的平均10,000个细胞数的资料，含有46个参数。一般软件无法打开list mode数据文件，需藉助如CellQuest, WinList, WinMDI, 等Flow 分析软件，才可开启、绘图、并进行分析统计。4.1 开启一CellQuest实验文件1. 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出现一Untitled 实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放

28、大。4.2散点图之统计分析（双色）2. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，然后拖动对角线至适当大小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot对话框。3. 在Dot Plot方框中，Plot Source应预设为Analysis，可点击 Select File 钮，并用随后之方框来开启预存之 Sample Files，它们的路径位于Mac HD：BD Applications：CellQuest Folder：Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录，找到档案后，点击 Open来开启 NORM001 档案。X 与 Y 参数项会出现默认值FSC-H 256 与

29、SSC-H 256，在Color方框中点击Multicolor Gating，确认无误之后，点击 OK 便完成了一个 NORM001 的 FSC /SSC散点图。4. 工具板中选择多角形区隔工具，将Cursor 移至FSC/SSC散点图上，并沿着淋巴球聚落周边画出范围，连点击两次可关闭该区域。你已完成 R1区域的界定，我们将以此区域来圈选淋巴细胞。(如果要删除R1区域，您可以在工具列中点选Gates Region list，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。)5. 从Plots菜单中选择Dot Plot可复制一个同样大小的散点图，屏幕上会出现一 Dot Plot 对话方框。点击X Parameter 钮来显示 NORM001 档案中所有的参数项 (FSC, SSC, FL1, FL2) 将 X 参数项改成FL1-H 256 Gamma-1，Y 参数项改成FL2-H 256 Gamma-2。从Gate输入栏中将 NoGate 改成G1= R1。6. 点击 OK 便完成了一个以 G1 圈选的 FL1/ FL2 散点图，可