体内临界尺寸骨缺损的临床前.docx

1、体内临界尺寸骨缺损的临床前体内临界尺寸骨缺损的临床前1范围本标准给出了预期修复或再生骨组织植入物骨形成活性的体内临界尺寸骨缺损评价通则；对骨缺损动物模型的制备、骨缺损部位及范围、缺损类型、植入物的制备和评价提供了相关参数。本标准适用于部分临界尺寸骨缺损模型的制备，以及合理利用临界尺寸骨缺损模型对具有诱导或促进骨生长的骨组织工程医疗产品的测试和评价。2规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB 14925 实验动物 环境及设施GB/T 16886.1 医疗器械生物学

2、评价 第1部分：风险管理过程中的评价与试验中华人民共和国药典（2015版）四部3术语、定义下列术语和定义适用于本文件。3.1骨再生bone regeneration生成在组织学，生物化学和力学性能上类似于天然骨组织的骨形成过程。3.2骨修复bone repair通过细胞增殖和新的细胞外基质合成使创伤骨组织愈合的过程。3.3密质骨compact bone 是一种骨化的结缔组织，其特征为具有骨单位的板层骨。板层骨由高度规则的同心薄板样结构组成。3.4皮质骨cortical bone 骨组织的两个主要类型之一。皮质骨致密，形成骨的表面。3.5临界尺寸缺损critical size defect（CS

3、D）自然发生的或者是人为制造的一种骨缺损，在没有外界干预的情况下不会愈合。在临床上，这个词适用于健康成年人出现缺损后连续观察6个月不愈合的情况。3.6骨干diaphyseal 指的是长骨中段。3.7软骨内骨化endochondral ossification骨形成的两种主要类型之一，软骨基质首先形成，随后被骨组织替换。注1：脊椎动物的大多骨生长都属于软骨内骨化，特别是长骨。注2：骨形成的另一个主要机制为膜内成骨，骨组织直接形成，不需要软骨预先生成；它主要发生在扁骨（颅骨）的形成中。3.8生长板growth plate在长骨的骺区里，是软骨内成骨生长区。1注：在骨骼发育成熟的动物中生长板是融合的

4、。3.9长骨long bone它的长度大于宽度，主要通过骨干的延伸生长。长骨包括股骨、胫骨、腓骨、肱骨、桡骨、尺骨、掌骨、指骨、跖骨、趾骨。3.10骨髓 marrow骨髓腔里填充的红色或黄色的柔软胶状组织，颜色取决于造血组织占优势（红色）还是脂肪组织占优势（黄色）。2注：红骨髓也被称为骨髓组织。3.11基质matrix本标准中，基质可指外源性植入支架或来自宿主的内源性细胞外物质（也称为细胞外基质）。3.12干骺端metaphyseal附属于长骨致密的末端。3.13重塑remodeling指旧骨从骨骼上移走（骨吸收），且新骨增加（骨形成）的伴随终生的过程。3.14残留时间residence ti

5、me材料（合成的或天然的）从植入宿主组织到不能从宿主组织检测到的时间。3.15骨成熟期 skeletal maturity骺板融合的年龄。3注：在啮齿动物中，骨骼发育成熟的动物特征是有成熟的生殖腺。3.16松质骨trabecular bone以骨髓包围针状骨为特征的骨化的骨结缔组织。3.17负重与非负重模型weight-bearing versus non-weight bearing models负重是指作用于患者或实验动物手术腿上的重量，通常以体重的百分比描述。注1：非负重意味着腿不能接触地面（即，支持0%的体重）。注2：完全负重意味着腿在迈出一步的时候可以承受身体100 %的体重。4动物

6、模型4.1概述本部分描述了用于确定动物模型，骨缺损位置和尺寸的选项,详细参见附录A。给出了选择大鼠和兔子模型的考虑。其他动物模型的考虑可参见附录A。使用这些动物模型进行研究时应遵守国家对实验动物护理和使用的管理规定，在实验前要通过实验动物护理和使用机构的检查和批准（必要时可咨询兽医师后制定研究计划）。4.2缺损尺寸大部分人类骨折的部位发生在长骨，因此，在动物模型中一般采用长骨缺损模型来评价骨修复/再生。骨修复的临界尺寸缺损评估常见动物模型参数参见附录A。原则上讲，临界尺寸缺损可位于两个干骺端和骨干的位置。本文件只描述长骨骨干部的缺损。关于缺损尺寸和动物的体重、解剖结构、步态等方面在动物种属之间

7、存在明显差异，因此对骨缺损有动力学、运动范围和力学等方面的影响。这些因素影响骨的构造和结构，在对骨损伤或疾病的反应中发挥了重要作用。使用者应该谨慎考虑动物模型是否适合于植入TEMPs的研究阶段。力学载荷能影响骨修复。在所有力学生物学因素中，间歇静水压力和载荷应力在调节骨发育和维持、以及退化中起重要作用。力学载荷强度或持续时间对植入TEMPs以及周围天然骨的影响依据解剖部位不同而变化。所以，选择评估植入效果的缺损部位时应考虑到力学载荷对植入物性能的影响。建议选择适当的动物种属和解剖部位。要具有足够大的尺寸，能充分研究和优化设想为人使用的植入物配方、设计、尺寸等，特别是在开发产品的后期。较大的动物

8、可能更适于骨缺损修复的研究，特别是在与人相近的解剖部位。较大的骨缺损一般需要一种固定方法来固定植入物，以减少植入物脱位。固定植入物的方法会对周围的宿主组织和修复组织产生不利影响。因此，以不需要固定的TEMPs模型实验结果来预测需要固定的较大动物模型和人的结果时，需要考虑这个因素带来的差异。 对于每个种属，临界尺寸缺损被定义为该动物在不经治疗的情况下，不能修复的最小尺寸。临界缺损尺寸因动物种属不同而不同，当设计植入物尺寸和固定方法时，应认真考虑。作为一个经验法则，骨缺损（由骨切除形成）的长度至少应等于所选骨直径的1.5倍。一些学者建议至少是所选骨直径的2倍。骨切除段的骨膜是否保留会影响骨缺损的愈

9、合。在多数的临界尺寸骨缺损研究中，骨膜都被切除。在报告结果时，应说明骨膜是否切除。每个研究应包括一个空白的缺损对照组，以证实该模型是一个临界尺寸的缺损。如果模型非常成熟，为节省动物数量，宜考虑使用历史数据，而不是实际对照动物，除非这不利于研究的目标。例如，在关键的临床前概念验证研究中，同步对照可能是适当的。通常建议采用单侧缺损模型。尤其对于使用四肢进行负重（尤其是山羊，绵羊和马）动物的负重位置。4.3力学影响因素由于跳跃或跑步而使植入物受极端和高度变化的力学影响，会增加观测结果差异。应仔细考虑使用负重和非负重模型对结果带来的潜在差异。4.4染色体性别由于循环类固醇对软骨和骨的代谢及再生的影响，

10、染色体性别的选择应该加以考虑。不能使用在哺乳期的动物。为了某些目的，采用年龄较大或卵巢切除的雌性（特别是大鼠），可用于模拟骨质疏松的情况。建议在同一组实验中使用相同的性染色体动物，并且需要在报告中说明。研究者应该意识到性别间可能存在差异，需要适当的统计学分析。4.5年龄骨生长过程经历代谢的动态变化和重塑。由于这些生理过程对组织修复的影响，宜使用骨发育成熟的动物。实验组动物的骨骺生长板宜已经融合。如有必要可通过X线平片摄影判断不同种属动物间的骨成熟差异。年长的动物有骨量减少的倾向，并且骨缺损修复能力下降。如果认为特定条件对TEMPs的评估是重要的，应该使用一个相适应的模型。间充质干细胞池、对生长

11、因子的响应性和细胞的代谢活动一般随年龄增长而下降。因此，依赖于自身细胞数量和活性的修复过程，在年长动物中可能会受影响。4.6饮食或并发症在一般情况下，采用正常饲养条件下的健康动物进行研究。然而，也有通过添加氟化物，以及禁止摄入维生素D和/或钙等方法制作具有骨病的动物模型。在考虑伴有影响骨修复的系统性疾病患者治疗时，考虑使用模拟该疾病或条件的非临床模型是适当的。4.7研究期限研究的时间长短取决于TEMPs的开发阶段，使用的动物种属，缺损的大小，植入物的组成和设计。大鼠和兔子的小缺损模型，植入8周12周即可提供植入物停留时间，TEMPs的固定以及修复类型的相关信息。使用较大的动物（狗、绵羊、山羊）

12、，8周12周的研究周期对于获得缺损内植入物的生物相容性，细胞的早期反应，植入物存留状态和条件等信息是有限的。基于组织学观察结果判断成功修复骨缺损和骨重建，需要超过3个月的研究周期。根据不同的研究目的，建议在缺损完全愈合之前对一个或多个组进行评价。当将一种新材料和标准材料（如自体骨）进行比较时，两组之间的差异可能在早期最大，之后随时间延长而消失。一般而言，需要通过统计学分析来比较研究的结果。4.8动物数量每组使用的动物数量需要满足统计学分析的要求。所需动物数量取决于所用动物间的差异、手术治疗的一致性、评价方法的准确性、实验过程中预期的动物损耗率以及分析数据的统计学方法。另一个重要因素可能是研究目

13、的（例如，比较空白缺损组或不同植入物组的可行性和效果）、和治疗的差异性（例如，加入细胞/生长因子，植入物的尺寸）。如果各组模型已经建立完善（源于文献或预实验结果），那么试验所需实验动物的数量可从现有的数据中查询。试验研究表明，利用组织学和力学性能方法评价的试验中，每组6只8只动物是合适的。文献中所记载的每组动物的数目，参见附录B。4.9动物种属大鼠模型4.9.1.1大鼠是开发早期最常用的试验动物，因为其价格低廉，饲养空间较小以及容易饲养。最常使用的模型是股骨缺损模型。4.9.1.2由于股骨是负重部位，其缺损必须通过内固定或外固定使其稳固。由于动物的尺寸偏小，其固定系统一般需要定制。可使用螺钉、

14、克氏针或者环扎术固定板材（聚合物或金属）作为固定系统。4.9.1.3典型的缺损尺寸是5 mm，可使用锯或牙科钻切除骨干中部。在切除中要注意不要损伤坐骨神经，术后腿的废用将延迟缺损的愈合时间。要了解更多细节，请参见附录A。兔子模型4.9.2.1相对于大型动物（狗，绵羊或山羊）来说，兔子作为试验对象是很经济的。4.9.2.2相对于其它骨缺损评价所使用的种属而言，兔子的皮质骨厚度较薄。4.9.2.3由于兔桡骨是管状的，更适宜采用影像学、组织学和力学方法进行评价。4.9.2.4尺骨或桡骨的临界尺寸缺损模型无需固定，因为另一块骨可以起到稳定作用。4.9.2.5典型的缺损尺寸是15 mm20 mm。4注：

15、一些研究中指出15 mm的缺损可能是不够大的。4.9.2.6试验一般选择生长板闭合的成年兔（大约20周龄）。在年轻的动物中，如果手术腿中的完整骨可能过度负重，将导致生长板滑动而被排除出试验组。4.9.2.7如果力学性能测试是结果分析之一，那么兔尺骨模型是有一定风险的，因为桡骨易于附着在缺损部位（融合）。扭转试验的旋转轴很难重复，横截面积也难以测量。5缺损部位5.1本标准重点关注长骨的骨干中部节段性缺损。CSD模型举例参见附录B。5.2建立典型骨干骨缺损模型的骨包括尺骨、桡骨、胫骨、腓骨和股骨。但不是所有动物各部位缺损都有报道。 5.3注意事项也应包括在实施外科手术和固定时的难易程度。5.4临界

16、尺寸节段性骨缺损对称模型通常被认为是不可取的，这是出于人道的原因，也可能会对数据的完整性产生影响。6关节的负重和制动应综合考虑动物关节构造、尺寸以及步态来确定合适的制动方法。在术后任何时候均可使用夹板、外固定器和支具来减少关节运动。应确定一个关节恢复正常活动或活动不受限制的时间点。选择固定期应考虑废用性萎缩和其他潜在的消极因素对骨的影响。持续被动运动已被证明对人和动物骨损伤后的再生过程有一定程度的益处。在动物模型中的类似治疗方法由于可行性较差还没有被广泛接受。在术后护理中应考虑到使用支具和夹板会限制手术切口的护理。7实验步骤7.1植入物的准备所有植入动物体内的试验材料应进行无细胞毒性和生物相容

17、性评价。植入物可以是灭菌后在无菌条件下准备，或根据植入物成分和功能可接受的方法在准备完毕后灭菌。如果适用生物负荷测试或无菌测试，应采用相关规范的方法进行。无菌测试可按照中华人民共和国药典（2015版）。可降解生物材料作为体内植入物的生物相容性评价见GB/T 16886.1。7.2缺损制备缺损的制备应采用标准化且可重复的方法。为保证制备骨缺损的一致性，如果可行，可考虑使用模板或其他标尺工具。一项研究中所有动物的骨缺损应该使用相同类型的工具及手术器械。7.3植入物的移植和固定植入物的移植需要按照标准化和可重复的方法操作。应注意确保植入材料周围的骨不过度损坏且植入的植入物与相邻缺损断面相接触。骨缺损

18、应以一个标准的、可重复的方法固定。7.4痊愈和饲养痊愈条件应该旨在减少潜在的应力和过度运动。所有饲养条件都应该符合GB 14925。应经常监测、观察并记录试验动物，确定其健康和身体状况。放养动物的健康状况应该事先经过兽医确认。7.5实验周期使用夹板比标准化的绷带包扎更能减少关节运动和负荷，需要注意的是，在选择治疗周期长度时，应考虑废用性萎缩和潜在的负面因素对骨愈合的影响。如适用，X线照片可用于评估植入物的位置。康复后，大型动物宜在受保护的围栏中至少饲养9天。经过这一时期的动物可以留在受保护的养殖栏内或在群体内自由活动。宜请有资质的兽医定期检查动物，以发现任何异常迹象。根据研究目的应指定取材时间

19、。通常情况下，选择一个早期的时间点（例如，检查植入物对早期愈合的影响），以及一个或两个随后的时间点（次）（例如，当完全愈合或接近完全愈合时），可参考附录B。7.6尸检应根据我国相关规定以人道的方式处死动物。植入部位应与周围的软骨和骨组织一并取材。取材的组织应放置在溶液中，组织学（脱钙石蜡与非脱钙塑料包埋比较）、生物化学或力学性能应与预期观察指标相一致。8评价和结果8.1组织学对于组织学处理程序，可参阅ASTM F561（医疗器械的检索和分析，及相关的组织和体液）。组织学部分用于评估缺损内组织再生或修复的数量和质量。应连续地进行组织学切片并染色，这样才能进行组织质量评价和钙化组织检测。标准的染色

20、剂包括：苏木精和伊红、甲苯胺蓝、改良三色染色等。应考虑脱钙与不脱钙的部分，这可能需要不同的染色方法。8.2显微分析和计分组织切片应利用组织病理学指数进行不良组织反应分析。8.2.2 对骨植入物/组织工程医疗产品性能的评估，计分制被用来确定以下几个方面：骨痂形成，缺损中新骨的形成（矿化/非矿化），骨移植物的再吸收，皮质重塑，骨髓变化，骨结合（远端，近端）。此外，应该评估炎症纤维结缔组织。8.2.3 组织形态计量学分析可被用于测量组织学参数，如厚度、集成、细胞数量和表面质量。8.2.4 不到六个月的时间点不一定反映长期的结果，因为随着时间的变动，生化成分和修复组织也有可能变化。8.2.5 短期组织

21、学评估，可用于筛选和优化。长期的评估，应根据组织学和力学测量结果。8.3X线照片在研究正在进行和结束时，X线照片是用来评价实验周期内新骨形成的数量和质量的重要手段。通常情况下，X线片应采取两个正交平面，以便评估时适当地校准和形成准三维视图。X线照片显示的愈合可能是标志着一个研究可以结束的决定性因素之一。它应该与其他指标结合使用，例如，临床体征能够完全负重。涉及骨痂形成，桥接或结合（近端，远端），移植物外观和改建的各种影像学评分系统已经公布。评分系统应在实验说明中明确指定。在画面中包含一个金属片有助于X线片的标准化。不能透过射线的植入物和固定材料可能影响从X线片评估愈合的能力。8.4计算机断层扫

22、描:近年来，计算机断层扫描（CT）已经成为一种有用的工具，用于观察所采集标本骨再生的三维成像，以及在体监测骨再生的修复过程。CT图像用来评估骨痂和骨（矿化组织）区域。同样也可用来纠正计算和解释力学测试结果。CT分析最大的挑战是调整合适的阈值，保证骨缺损中能够分辨新形成的骨和支架材料。8.5修复组织的力学测试通常需要将骨切开之后进行力学测试。当发现尺骨和桡骨有融合时分离需要小心。样品制备可能将其部分嵌入树脂块里，保证适当的放置在固定装置中。长骨一般地宜一直测试到骨折。典型的测试方法包括3-或4-点弯曲和抗扭强度测试。需考虑到并记录测试速度。通过典型压力曲线可以计算出强度（最大扭矩），硬度， 折断

23、的最大能量。如果能从扭力测试中得到折断时的角度更好。建议监测和记录裂缝或折断发生处（在新形成的骨组织中或者骨缺损处之外的原生骨）。9分析统计分析应计算单个群组的平均值和标准偏差，每个分级样本的总分。通过费歇尔恰当概率试验，平方检验，Kruskal-Wallis试验（方差的单向非参数分析）来分析各组得分差异。附录A（资料性附录）骨修复的临界尺寸缺陷评估常见动物模型参数A.1概述常见的动物模型除了大鼠、兔子之外，还有狗、羊等。大动物模型可能更有利于骨修复的评价。使用大动物模型的评价参见A.2、A.3、A.4。表A.1 给出了骨修复的临界尺寸缺陷评估常见动物模型参数。A.2狗模型犬科，如中型尺寸（约

24、10 kg15 kg）的杂种动物，猎犬等都已经被用于临界尺寸的骨缺损修复模型。已有研究认为犬科长骨包括尺骨、桡骨和股骨有助于骨缺损修复的评价。A.3绵羊模型在临界尺寸长骨缺损修复研究中，绵羊是在大型动物中较常用的骨修复模型。绵羊最常用的部位是跖骨和胫骨的中间部分。在绵羊胫骨部分，典型的缺损尺寸约是2 cm到5 cm，而在跖骨部分，约是2.5 cm。绵羊的缺损模型应是单侧的骨缺损，双侧的骨缺损强烈建议不要使用。A.4山羊模型与绵羊相比，山羊一般对人更友好，因此更容易操作。山羊应该通过血液测试筛选，排除患羊脑炎的个体。 推荐使用山羊胫骨单侧的临界尺寸缺损模型，不推荐使用双侧的骨缺损模型。 表A.1

25、骨修复临界尺寸缺陷评估的常见动物模型参数物种常见类型成人等效的年龄常用缺损部位典型的临界缺陷尺寸（mm）固定的方法典型的结束时间点评价鼠A（鼠）斯普拉格-杜勒鼠，无胸腺裸鼠，菲舍尔，大鼠，刘易斯6个月F5 mm10 mm聚乙烯/用克氏针聚缩醛板/螺丝8周24 周组织学，X线片/Faxitron，生物力学兔A（天兔）新西兰，白色9个月R，U20 mm无（桡骨或尺骨保持不变）8周12周组织学，X线片，抗扭强度狗B（犬）小猎犬，猎犬，杂种1年2年R, U, F21 mm25 mm前修复，板/螺丝12周24周组织学，X线片，抗扭强度山羊B（公山羊）瑞士山2年3年T26 mm35 mm前修复26周组织学

26、，X线片，压缩强度羊B（绵羊）美利奴羊，前阿尔卑斯，其他2年3年T, M25 mm50 mm前修复，板/螺丝，髓内钉16周24周组织学，X线片，扭转或压缩强度注：A：小动物；B：大型动物；F：股骨；T：胫骨；R：桡骨；U：尺骨；M：跖骨。附录B（资料性附录）CSD模型举例B.1大鼠股骨节段CSD型号示例参见表B.1。表B.1大鼠股骨节段CSD型号示例类别Yasko等Chen等Oakes等Tsuchida等Vogelin等Jager等Betz等引用JBJS-A,74(5),659670, 1992J Orthop Res,20(1):14250,2002ClinOrthop RelRes, 41

27、3:281290, 2003J OrthopRes,21(1):4453, 2003JSBS-A,87(6):132331,2005Biomed Technik,50(5):137142,2005JSBS-A,88A(2):355365,2006类型斯普拉格-杜勒鼠斯普拉格-杜勒鼠无胸腺或者裸体天生的费舍尔344;布朗挪威Lewis大鼠，无胸腺rnu裸大鼠斯普拉格-杜勒鼠性染色体雄性雄性未指定雄性，雌性雄性N/A雄性年龄成年未报道未报道未报道3个月成年成年体重325350 g351468 g未报道90240 g34510.4 g未报道400425 g组的大小（n）1518 (3+3+12)（共

28、90）684 组(10+10+15+15)7(pilot);12(pilot);4224+12+12缺损尺寸5 mm6 mm8 mm6 mm10 mm4 mm5 mm骨膜切除？未报道未报道是N/A2组使用骨膜瓣;否则切除超过20mm是是单侧/双侧单侧单侧双侧单侧N/A单侧单侧固定聚乙烯板，克氏针聚乙烯板;克氏针，钢丝环扎板/ K线/ 钢丝环扎聚乙烯板;克氏针板（6孔，1.5 毫米）/螺丝IM钉（不推荐使用）;外固定支架外固定支架植入材料RhBMP-2+失活的鼠DBMOP-1+胶原蛋白以透明质酸钠或甘油为载体的人源脱钙骨基质浆料Allogen. Mesench. SCOPLA-HY无腺病毒携带r

29、hBMP-2基因植入物体积10mg（重组）未报道未报道N/A(直径10 mm *3.7mm)N/AN/A持续时间9周9周16周24周8周10周56天（8周）X线片1、2、3、4、5、6、9周2、4、9周4、8、16周2、4、6、8周4、8周每周每周X线平片分级（定量）0-5级 （5= 100 愈合）(BioQuantworkstation)05 (5 = 100%治愈)5分制无无3类 （愈合，形成，没有形成）组织学未脱钙的，脱钙（多重染色）福尔马林，脱水，包埋;75-100m切片（苏木素/伊红）非脱钙（甲苯胺蓝）（甲醛）脱钙，5m切片（苏木）(Goldner-Masson三色染色)无（甲醛）软化水（苏木素，伊红，番红O-快绿）生物力学测试是N/A否（“报在别处“）N/AN/AN/A5弧度/分钟空白对照组未报道在10周：12/12 新骨形成不足936肢; 16周中没有愈合 未报道全部空白缺损其他评估动态的放射性同位素 骨显像未报道未报道pQCT形态计量学N/A形态计量学，microCT，双X-射线骨密度B.2兔前臂节段CSD型号示例参见表B.2.表B.2兔前臂节段CSD型号示例尺骨类别Cook等Bostrom等Smith等引用JBJS A, 76(6):82738, 1