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1、弓形虫IgG产品注册证号：国食药监械（进）字2008第3400298号 赛润ELISA classic 弓形虫IgG抗体定量检测试剂盒（酶联免疫法）说明书德国维润赛润研发有限公司北京代表处北京建国门北大街8号华润大厦2503B邮编：100005 电话：+86.(0) 10.85 19 20 70传真：+86.(0) 10.85 19 20 71 电子邮件：dialogvirion-网址：http:/www.virion-弓形虫 IgG抗体定量检测试剂盒（酶联免疫法）说明书赛润 ELISA classic 目录1. 名称2. 用途3. 诊断意义4. 说明5. 赛润 ELISA classic -

2、 检测原理6. 试剂盒组成7. .检测所需物质，试剂盒未提供8. 储存和稳定性9. 赛润 ELISA classic的检验步骤9.1注意事项9.2样品准备和储存9.3试剂盒反应试剂的准备9.4检测程序概要9.5检测过程10. 检测结果评估 10.1 4PL单点定量法10.2检验有效性标准10.3计算赛润 ELISA classic弓形虫 IgG（定量）10.4检测结果分析11. 弓形虫IgG抗体的亲和性测定12. 性能特性12.1重复性 12.2 敏感性和特异性 12.3 亲和性测试 13. 有效期14. 警告13.1警告和安全措施 13.2废料处理15. 参考文献16. 制造商名称、地址及联

3、系方式弓形虫IgG 抗体定量检测试剂盒（酶联免疫法）赛润 ELISA classic酶联免疫法测定人体抗体（IgG）- 只限用于体外诊断-1. 名称通用名：弓形虫IgG 试剂盒 (定量) 英文名：Toxoplasma gondii IgG (quant.) 商品名：赛润 ELISA classic弓形虫IgG 抗体定量检测试剂盒（酶联免疫法）汉语拼音：Serion ELISA classic Gongxingchong IgG kangti dingliang jiance shijihe (meilian mianyifa) 产品编号: ESR110G检测评估标准: Dade Behring

4、 BEP III / BEP 2000, DSX, 手动操作 2. 用途用于定性和/或定量检测人血清或血浆中的抗弓形虫抗体。3. 诊断意义赛润 ELISA classic 弓形虫IgG抗体定量检测试剂盒主要用于定性和/或定量检测人血清或血浆中的抗弓形虫抗体，以测定免疫状态，以及确定急性感染。IgG-ELISA试剂盒是用于弓形虫抗体的筛查试验。配合Serion（赛润）弓形虫亲和性试剂（货号：B110AVID）使用可以测定IgG-抗体的亲和性。另外，IgM- ELISA试剂盒适合用于新生儿的筛查，也就是说通过检测新生儿血液的滤纸干血片的IgM抗体来进行诊断。弓形虫是一种真核生物病原体，属于孢子虫纲

5、。这种必须寄生在细胞内的寄生虫散播在世界各地，其孢囊繁殖的特点是能够在有性繁殖（只有在最终宿主猫科动物中才会进行有性繁殖）和无性繁殖之间转化。弓形虫经口进入体内（如食用被污染的食物）后，会穿透肠道进入网状内皮系统，它能通过血液传播，感染宿主体内许多不同的器官和组织。弓形虫在正常人群中的传播与年龄有密切的关系，50岁的人群中血清阳性率接近50%，年龄每增长10岁，弓形虫抗体的血清阳性率就会以10%的幅度增加。环境和营养因素也有很重要的意义，可以对弓形虫的血清阳性率产生显著的影响。弓形虫感染后，大约50%的人没有临床症状，而另外50%的感染者经过1-3周的潜伏期后，只有一些非特异性症状如低烧、疲乏

6、、头痛、肌肉和关节痛；少数病人会出现高烧（至39）和颈部淋巴结肿大。据报道儿童和未成年人感染后有1%的病人还会出现并发症如心肌炎、脑膜炎或肺炎等。患者康复后，弓形虫细胞会在感染组织中持续存在并形成胞囊，能阻挡机体免疫系统的攻击。这就是通常所说的潜伏期，在免疫力正常的宿主体内不被激活。或许由于抗原的存在对机体产生长期的刺激，使机体获得终生免疫力。孕妇弓形虫感染的筛查是有重大意义的。有关研究表明：弓形虫通过胎盘传播在怀孕的各个阶段都有可能发生，但产前传播和感染率的高低与怀孕的不同阶段有密切关系。 1. 第1-3个月 17% （最常见的是流产, 很少对胎儿造成严重伤害） 2. 第4-6个月 24%

7、（会对胎儿造成中级或严重的伤害） 3. 第7-9个月 64% （会对胎儿造成轻度伤害或晚期对胎儿有致命性伤害）初期感染但血清学检测呈阴性的孕妇，通过胎盘传播感染胎儿的风险较低，据报道在德国新生儿的感染率为2-7。因为一次感染以后，弓形虫IgM抗体很可能持续存在数月或者数年，所以很多时候检测出病原体特异性的IgM-抗体，并不意味着存在妊娠相关的弓形虫现行感染。针对带有阳性弓形虫IgM抗体的血清，亲和性测定可以实现新近初期感染的继续鉴定，因为高亲和性弓形虫IgG抗体的前提是更长的既往感染点。仅有1-3%的被感染新生儿会立即出现弓形虫病的临床症状，但在约80%的无症状（被感染的）新生儿中，部分会出现

8、严重后期伤害。赛润ELISA刚地弓形体IgM检测可以有效地对无证状的新生儿进行筛查。该实验通过检测新生儿的滤纸干血片来实现（见赛润新生儿弓形虫检测说明书）。在新生儿体内检测到病毒特异性IgM抗体即表示婴儿已被该种病原体子宫内感染或者急性感染，因为母体的IgM抗体基于其体积过大不可能通过胎盘传输。针对弓形虫感染可对被感染的新生儿进行及时的治疗，以避免继续的后期伤害。直到怀孕前两周感染弓形虫都会形成免疫。在计划怀孕时，在怀孕前进行一次血清学检测是非常有意义的。母亲首发感染发现后直接治疗，可使胎儿被感染的风险降低75%。机体出现自然的或有医疗引发的免疫抑制后，潜伏期感染会被激活。在艾滋病人群中，弓形

9、虫脑炎已成为最关键的、也是最终的致死病因。甚至近期有报道显示：弓形虫感染会随免疫抑制的出现而相继发生。4. 说明本说明书除弓形虫IgG抗体定量检测的内容外，还涉及到IgM抗体的定量检测，以及对结果的分析等。5. 赛润ELISA classic - 检验原理用抗原包被微量板孔，制成固相载体。加患者血清到板孔中，其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。除去多余物质后，加入碱性磷酸酶标记的IgG和IgM抗体，使之与上述免疫复合物反应。洗板，除去多余的结合物，加入底物（对硝基苯磷酸盐）。其与酶结合的免疫复合物反应，产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。6. 试剂盒的组

10、成试验成分IgG试剂盒 IgM试剂盒 数量 / 容积微孔条（此微孔条可拆下单独使用，每条有8孔，共96孔，已经包被了抗原）1个微孔条框架包被的抗原为灭活抗原12 12标准血清（立即可用）人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液；抗HIV抗体、抗乙肝病毒（HBV）表面抗原和抗丙肝病毒（HCV）抗体均为阴性；防腐剂： 0.1%叠氮化钠染色剂：紫红色O22毫升 22毫升阴性对照血清（立即可用）人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液；抗HIV抗体、抗乙肝病毒（HBV）表面抗原和抗丙肝病毒（HCV）抗体均为阴性；防腐剂： 0.1%叠氮化钠染色剂：里沙明绿 V12毫升 12毫升酶标记的抗人IgG, IgM （立即可用）羊抗

11、人IgG, IgM（多克隆），标记碱性磷酸酶后在蛋白稳定剂中储存。防腐剂: 0.01%g甲基异噻唑啉酮0.01%溴化硝基二垩烷13毫升 13毫升浓缩洗液（可稀释至1000毫升）氯化钠溶液，含吐温20和30mM Tris 防腐剂： 0.1%叠氮化钠133.3毫升 133.3毫升稀释缓冲液磷酸盐缓冲液，内含蛋白和吐温20防腐剂： 0.1%叠氮化钠0.01克/升的溴酚蓝钠盐250毫升 250毫升终止液1.2N 氢氧化钠15毫升 15毫升底物（立即可用）邻硝基苯磷酸盐，不含其它溶剂的缓冲液防腐剂： 0.1%的叠氮化钠（未开封瓶子中的底物可能会轻微变黄，但不会影响其质量）13毫升 13毫升带有标准曲线和

12、评估表的质量控制文件（抗体以IU/毫升或U/毫升计量）1 17. 其它检测所需物质- 普通实验室所需的仪器装置- IgM检测：另需赛润含对照抗原的类风湿因子Rf吸附剂（Rf吸附剂对照抗原；产品编号T200/20ml）- 分光光度计，波长405纳米，建议参考波长范围620纳米- 690纳米（例如 650纳米）- 37温箱- 湿盒- 蒸馏水。8. 储存及稳定性试剂储存稳定性微孔条(包被抗原)开封后放在2-8装有干燥剂的密封铝箔袋中。4星期对照血清 / 标准血清开封后保存于2-8。有效期内；24个月酶标记抗体立即可用的溶液于2-8储存。避免污染（使用无菌枪尖）。有效期内28个月稀释缓冲液开启后于2-

13、8储存。有絮状沉淀时丢掉未开封24个月有效期内36个月洗涤液浓缩液开封后保存于2-8。工作液在2-8。工作液在室温下。盛过工作液的瓶子应按常规方法清洗，并丢弃混浊溶液。有效期内2星期1星期底物2-8储存，避光。避免污染（使用无菌枪尖）。当溶液变为黄色时应予以丢弃（水作空白，吸光度大于0.25时）。有效期内24个月终止液开封后保存于室温下。有效期内9. 赛润 ELISA classic的检验步骤9.1注意事项只有全部使用赛润 ELISA classic试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。尤其是标准血清，对照血清以及酶标记物，必须使用试剂盒配备的，不要使用其它

14、批号产品。稀释缓冲液，洗液，终止液和底物溶液可用于所有赛润 ELISA classic试剂盒。针对每一个免疫球蛋白种类都有三个不同的酶标记物浓度：低、中、高。酶标记物的分级通过以下的标志在标签上显示：比如： IgG+ 低浓度IgG酶标记物IgG+ 中浓度IgG酶标记物IgG+ 高浓度IgG酶标记物为了保证我们试剂盒的惯常质量，在极少数情况下需要使用特殊酶标记物。这些试剂盒中的酶标记物会有一个特殊批号并且不用“+”标志。因此，这些特殊酶标记物是不可以和其它酶标记物交换使用的。 请您每次都注意标签上的标注！ ELISA classic试剂盒内所有试剂均必须正确地存放。应在未开封的情况下，保存于2-

15、8，并在有效期（见标签说明）内使用。详细的稳定性和储存资料在“8. 储存及稳定性”内将加以详述。每一种试剂都是经过校准以保证最佳的检测结果。这些试剂如果经过稀释或改动都会导致检测的敏感性的降低。在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。如果铝袋破损或者已开启装有干燥剂的铝袋而未以夹子封紧的，则不要继续使用微孔条。请从标记处剪开密封袋。开始试验前，将所有试剂置于室温。从试剂管中吸取试剂的时候，应注意使用无菌技术以防污染。为避免假阳性结果，吸加酶结合物时，吸头应确保不接触孔壁或喷洒于小孔的外面，

16、注意不要盖错瓶盖或管盖。试验中试剂的充分混合，对于检测结果的重复性至关重要。在取用对照品和酶标记物之前应摇动容器使其充分混匀，加样前，使用单向振动器充分混匀稀释过的标本。小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 对照血清，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。只有严格遵守赛润ELISA classic试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。如果实验中未严格遵守控制质量控制认证文件上的有效性特异准则，则试验结果无效。洗涤不充分将影响试验结果：应该小心进行洗涤。洗涤步骤应遵守相

17、关洗涤器（平底孔，孔直径7毫米，深10.9毫米）指导手册进行，所有的孔内均应加入相同体积的洗涤缓冲液。洗涤结束时，应将微孔板倒扣于纸巾上并轻轻敲打，以确保所有孔内均无洗涤缓冲液。避免产生泡沫！如果使用自动洗板机，注意正确操作。9.2检验前的准备工作和储存避免使用高血脂、溶血或黄疸的标本，尽管在我们的检测中没有发现有副影响。明显被污染的标本（血清或血浆）不能用于检测。依照标准实验室方法采集血清或血浆标本(EDTA、 柠檬酸盐、 肝素抗凝)标本不应加热灭活。9.2.1样品准备赛润 ELISA classic 弓形虫 IgG开始试验前，患者的待测样品必须以稀释缓冲液稀释如下（V1+V2）：V1+V2

18、=1+100 加 10微升 患者待测样品 于 1000微升 稀释缓冲液稀释后及加入微孔板前，样品必须充分混匀。赛润 ELISA classic 弓形虫 IgM类风湿因子的干扰的排除类风湿因子抗体是IgM型的自身抗体，可与IgG免疫复合物结合。非特异性类风湿因子抗体的存在将导致IgM检测的假阳性结果。另外，也存在弱结合的病原体特异性IgM抗体被强结合的IgG抗体取代的可能性。在这种情况下，IgM的检测将得到假阴性的结果。因此，在进行IgM检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理。特别类风湿因子Rf吸附剂（产品编号T200, 20ml）不仅包含抗人IgG抗体，还含有一定量的对照抗原。对照抗原同时能

19、与类风湿因子及可识别宿主细胞膜成份的抗体结合。因此，无须再进行微量孔包被对照抗原的平行试验。在进行以下SERION ELISA classic IgM检测时，此类RF吸附剂需作为附加试剂另行购买:巨细胞，单纯疱疹病毒，麻疹，腮腺炎，风疹病毒，弓形虫，带状疱疹病毒首先应该使用稀释缓冲液(V2)对类风湿因子吸附剂(Rf-吸附剂/对照抗原)(V1)进行如下稀释：V1+V2=1+4 加 200微升 Rf-吸附剂/对照抗原 于 800微升 稀释缓冲液中然后将患者的待测样品(V1)在此Rf-稀释缓冲液(V3)中进行稀释：V1+V3=1+100 加 10微升 患者待测样品 于 1000微升 Rf-稀释缓冲液

20、中 9.2.2样品储存密封的患者样品可在冰箱中2-8保存7天。 -20可保存更久。避免样品反复冻融。已稀释的样品可在2-8 下保存一星期。9.3 试剂盒反应试剂的准备9.3.1 微孔条微孔条排列于板中，并与干燥剂一同封于铝袋内。未使用的微孔条重新放入铝袋，密封好，确保铝袋的密封性。9.3.2 对照血清 / 标准血清对照和标准血清可直接使用，不必进一步稀释每次试验或是试验体系，无论检测用的微孔板数目多少，均应包括空白对照孔，阴性对照孔和标准血清孔，且标准血清应加两孔。不要用RF吸附剂处理对照血清！9.3.3 抗人 IgG或IgM抗体，用 AP标记（备用）禁止将不同试剂盒的酶标抗体混合使用。同一试

21、剂盒才能达到最佳检测效果。为了避免酶标记物的污染（请使用时先一次性取出实验所需量置于一容器中，避免反复从试剂瓶中吸取试剂。）9.3.4 洗液以1：30稀释浓缩洗涤缓冲液（V1）至终体积V2。例如：浓缩缓冲液（V1）终体积（V2）33.3毫升1000毫升1.0毫升30毫升9.3.5 样品的稀释缓冲液（即用）9.3.6 底物（即用）必须以无菌枪尖吸取底物溶液！9.3.7 终止液（即用）9.4 检测程序概要样品稀释液（患者样本）1+100将稀释的样本，和立即可用的对照血清 / 标准血清，加到微量孔内（100微升）孵育60分钟 / 37 湿盒中 洗涤加入已立即可用的酶标记抗体溶液（100微升）再孵育3

22、0分钟 / 37 湿盒中 洗涤加入底物溶液（100微升）再孵育30分钟 / 37 湿盒中加入终止液（100微升）在405 纳米处读数9.5 检测过程 9.5.1将检测所需数目的微孔条放到微孔板框上并准备好一张草签。9.5.2在微量孔内分别加入100微升的已稀释样本或立即可用的对照血清。留一个孔为底物空白使用，例如：定量的IgG / IgM微量孔孔A1孔B1孔C1孔D1孔E1底物空白阴性对照标准血清标准血清 标本 1.9.5.3将样品放于湿盒内37（1）孵育60分钟（5分钟）。9.5.4孵育后以洗液缓冲液洗涤板孔（使用自动洗板机或手工洗板）：- 吸去或甩去洗液- 每孔内加入300微升洗液- 吸去

23、或甩去洗液- 重付息涤过程3次（共4次！）- 将微孔板翻转过来在纸巾上拍打，使微孔中不再含有液体9.5.5加入酶标记抗体。于适当孔内（底物空白除外）加入100微升 IgG / IgM酶标记抗体9.5.6湿盒内37（1）孵育30分钟（ 1分钟）。9.5.7孵育后，以洗液清洗板孔（洗涤见上）9.5.8加入底物于每孔内加入100微升底物溶液（包括底物空白孔）9.5.9湿盒内37（1）孵育30分钟（ 1分钟）。 注意：根据各实验室条件的特殊性，有必要对孵育时间进行调整。9.5.10终止反应每孔内加入100微升终止液，轻微振荡微孔板以混合溶液。9.5.11读取消光度以底物空白为空白对照液， 60分钟内读

24、取405纳米的OD值，建议参考波长范围为620纳米-690纳米（例如650纳米）。10. 检测结果评估赛润 ELISA classic弓形虫 IgG/IgM抗体（定量）检测10.1 4PL单点定量法通过利用非线性方程，可以保证根据消光信号的定量数值精确计算出抗体活性，该方程可在不对OD值进行转换的情况下调整S型曲线。用赛润 ELISA classic试剂检测，抗体浓度可通过逻辑对数模型（4PL, 4个参数）来计算，该模型对浓度曲线有很精确的适用性。计算公式如下：OD = A + D - A1 + eB(C-ln conc.)参数A、B、C和 D能够反映曲线的精确形状。1. 下端渐进线 参数A2

25、. 曲线斜率 参数B3. 转折点 参数C4. 上端渐进线 参数D标准曲线是由德国维润赛润研发有限公司（维尔茨堡市）在严格条件下经过多次试验制定的。使用者无需花费大量的时间和使用昂贵的仪器来制作标准曲线。每一个试剂盒内均附有专用的标准曲线和评估表用来计算抗体浓度。如有需要也可取得相关的评估软件。为了校正正常试验偏差和建立试验对照，每轮试验均需使用标准血清作为对照。该对照血清的有效范围参考值是由厂商的质量控制部门确定的，在此范围内可保证抗体浓度测定的正确性。标准血清不一定是阳性对照，且在某些ELISA试验中标准血清数值可能是临界值或阴性结果。10.2有效性标准-底物空白的OD 20 IU/ml临界

26、值结果: 10-20 IU/ml阴性结果: 350 IU/ml临界值结果: 300-350 IU/ml阴性结果: 300 IU/ml针对临界值结果的样品，应在1-2 周后对相应的病人再进行取样，重新检测。10.3.2 利用SERION easy base 4PL软件/SERION评估软件进行自动评估输入四个参数和标准血清参考值之后，联机软件就会计算出抗体活性。如果标准血清的消光值超出有效范围，SERION easy base 4PL软件就会出现如下信息：“标准已超出允许范围”和 / 或“标准差异大于20%”。SERION 评估软件只用英语显示：Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24. Standard value differ more than 20% in following groups: Group 1-24.” （“以下组样品标准值超出范围：组1-24。以下组样品标准值差异大于20%：组1-24。” ）在这种情况下，