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1、组织工程医疗产品第25部分动物源性生物材料DNA残留量测定法组织工程医疗产品 第25部分动物源性生物材料DNA残留量测定法ICS C 中华人民共和国医药行业标准 YY/T XXXX.3,20XX 组织工程医疗产品 第25部分 动物源性生物材料DNA残留量测定法: 荧光染色法 Quantification of Residues DNA in Biological Materials: Fluorescence Method (送审稿) 20XX-XX-XX 发布 20XX-XX-XX 实施 国家食品药品监督管理局 发 布YY/T XXXX.3,20XX 目 次 前言-2 引言-3 1 范围-

2、-4 2 规范性引用文献-4 3 术语、定义及缩略词-4 4 实施标准概要-5 5 意义和使用-6 6 实验方案和技术依据-6 7 试剂和仪器-7 7.1 试剂- 7.2 仪器和器材- 8 试验过程- 8.1蛋白酶K消化- 8.2 DNA纯化- 8.3 DNA含量测定(荧光染色法)- 9 结果计算- 10 结果判定- 11 生物材料残留DNA限量的讨论- 参考文献- 1 YY/T XXXX.3,20XX 前 言 本标准的编写格式贯彻了GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写。本标准为原创标准，无同等或类似的国际标准。 本标准的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不

3、承担识别这些专利的责任。 YY/T 0606组织工程医疗产品系列标准如下: 组织工程医疗产品 第1部分:通用要求 组织工程医疗产品 第2部分:术语 第3部分:通用分类 组织工程医疗产品 组织工程医疗产品 第4部分:皮肤替代品(物)的术语和分类 第5部分:基质及支架的性能和测试 组织工程医疗产品 组织工程医疗产品 第6部分:?型胶原蛋白 组织工程医疗产品 第7部分:壳聚糖 组织工程医疗产品 第8部分:海藻酸钠 组织工程医疗产品 第9部分:透明质酸钠 组织工程医疗产品 第10部分:修复或再生关节软骨的植入物的体内评价 组织工程医疗产品 第11部分:脱钙骨异位骨诱导性组织学评价指南 组织工程医疗产品

4、 第12部分:细胞、组织、器官的加工处理指南 组织工程医疗产品 第13部分:细胞自动计数法 组织工程医疗产品 第14部分:评价基质及支架免疫反应的试验方法-ELISA法 组织工程医疗产品 第15部分:评价基质及支架免疫反应的试验方法-淋巴细胞增殖试验 组织工程医疗产品 第16部分:保存指南 组织工程医疗产品 第17部分:外源性因子评价指南 组织工程医疗产品 第18部分:活细胞或组织的海藻酸盐凝胶固定或微囊指南 组织工程医疗产品 第20部分:评价组织工程支架材料免疫反应的标准试验方法-细胞迁移试验 组织工程医疗产品 第21部分: 供体资质确定指南 组织工程医疗产品 第22部分:人源细胞质量控制指

5、南 组织工程医疗产品 第23部分: 组织操作规范 组织工程医疗产品 第24部分: 鼠胚实验 本部分为组织工程医疗产品 第25部分 (为YY/T XXXX):动物源性生物材料DNA残留量测定法:荧光染色法 本标准由国家食品药品监督管理局提出。 本标准的归口单位为中国食品药品检定研究院。 本标准起草单位:中国食品药品检定研究院。 本标准主要起草人:徐丽明、陈亮、邵安良。 本标准20 年 月 日首次发布。 2 YY/T XXXX.3,20XX 引 言 由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性支架材料被普遍用于外科的创伤修复，肌腱、皮肤、心血管、胃肠及下尿道组织的重建。这些细胞外基质支架材料取材于人和动物的

6、各种组织，如:猪的皮肤、角膜、小肠、尿道及膀胱，牛的皮肤、人的皮肤等。由于细胞膜的表位抗原、同种异体或异种的DNA以及由损1伤而来的小分子物质可能会引起人体广泛的免疫反应，因此动物源性支架材料的脱细胞过程被认为是非常重要的。尽管细胞外基质材料已经被广泛用于临床，但仍然存在由于残留DNA及残留蛋白质等所引起的炎症和免疫反应隐患。因此，动物源性生物材料中，残留DNA定量检测是控制产品质量的重要措施之一。国际上还没有对该类产品的残留DNA检测方法。目前，美国的FDA还没有对动物源性生物材料残留DNA限量的具体规定。我国已经出台了“动物源性医疗器械产品注册申报资料指导原则”(食药监办械函2009519

7、号，二?九年十二月三十日)。对动物源性医疗器械产品注册申报资料的要求中提到，注册申报资料在满足一般性要求的基础上，需要增加涉及控制病毒和/或传染性病原感染以及免疫原性风险方面有关的技术内容。其中要求提供对清除(或降低)动物源性材料免疫原性工艺过程的描述、质量控制指标与验证性实验数据或相关资料。对于动物源性材料带来的免疫原性风险的降低，一般采用在生产工艺中降低其免疫原性的方法，包括脱细胞、去除杂蛋白，以及使蛋白质变性等物理的和/或化学的处理步骤，移走或覆盖抗原决定簇。生产企业需对其降低材料免疫原性的有效性进行验证。其中验证手段之一就是检测残留DNA含量。但是，目前尚无适用于动物源性生物材料残留D

8、NA的定量检测方法。基于生物制剂残留DNA检测方法主要包括DNA探针杂交法及荧光染色法(中国药典2010，附录IX,B 外源性DNA残留量测定法)，其中荧光染色法操作简便、灵敏度高、再现性好，得到广泛使用。然而，? 动物源性生物材料来源于动物或人的组织(主要是基质组织)，经脱细胞等工艺制作而成，大多为固体状态(有的为胶体或液体状态)，不能直接采用上述方法检测;? 基质组织中含有大量的结构蛋白质，影响荧光测定的结果。所以，生物制剂残留DNA检测方法不能直接用于动物源性生物材料残留DNA的定量检测。本标准将阐述适用于动物源性生物材料残留DNA的定量检测方法。 3 YY/T XXXX.3,20XX

9、动物源性生物材料DNA残留量测定法: 荧光染色法(标准草案) 1 范围 1.1 本标准适用于动物源性(包括人源性)生物材料及其衍生物、用于组织工程医疗产品基质或支架的动物源性支架材料。 1.2 本标准所述试验方法用于动物源性生物材料的残留DNA定量检测。待检测样品的DNA残留量在本标准所述方法的检测灵敏度之内的检测结果有效。针对每一特定的样品，试验条件的设定是否合理需要有适当的方法学验证。除本标准所选方法外，可采纳其他等效方法。 1.3 实施本标准的使用者应建立相应的安全和健康条例，并规定管理条例的适用性。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注明日期的

10、引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分。然而，鼓励根据本部分达成协议的各研究方可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T16886.1-201X 医疗器械生物学评价 第1部分:风险管理过程中的评价与试验(ISO10993-1:2009,IDT) GB/T 16886.12-2005医疗器械生物学评价 第12部分:样品制备与参照样品(ISO10993-12:2002,IDT) YY/T 0606.3 组织工程医疗产品 第3部分:通用分类 YY/T 0606.5组织工程医疗产品 第5部分:基质及支架的性能和测试 GA/T

11、 383-2002中华人民共和国公共安全行业行业标准: 法庭科学DNA实验室检验规范 无源植入性医疗器械产品注册申报资料指导原则食药监办械函2009519号，二?九年十二月三十日 动物源性医疗器械产品注册申报资料指导原则(食药监办械函2009519号,二?九年十二月三十日) 中华人民共和国药典2010年版，第三部/附录? B外源性DNA残留量测定法 ISO 22442-1:2007, Medical devices utilizing animal tissues and their derivatives 3 术语、定义及缩略词 3.1 基质 matrix 组织工程医疗产品中作为细胞或生物分

12、子生长、支持或输送载体的原材料，可以是高分子合成物质，也可以是生物组织的细胞外基质(matrix)来源的生物源性物质。 3.2 支架 scaffold 4 YY/T XXXX.3,20XX 促进替代、修复或再生组织的细胞或生物活性因子迁移、结合或输送的支持物、释放载体或基体。许多有机物(生物源性物质)、无机物及高分子物质都可以用作组织工程医疗产品的支架材料。 3.3 动物源性生物材料 biological materials 来源于生物组织(包括人源组织)的各种基质，经脱细胞而制成的基质材料，可以是固体状态(干燥型或湿润型)、粉末状态、也可以是液体或胶体状态。 3.4 不含DNA分解酶 DNa

13、se-free 经过特殊处理，已证实不含DNA分解酶。本实验实施过程中所用的所有和样品直接接触的离心管、吸头、移液管等器材均需保证不含DNA分解酶，以便防止样本中残留DNA被分解而不能正确地检测到。 3.5 DEPC水 DEPC treated water 用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的微滤(MiliQ)纯净水。经检测证实不含核酸分解酶(RNase、DNase)和蛋白分解酶(proteinase)。DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无核酸分解酶和蛋白分解酶的反应体

14、系。 3.6动物 animal 任何脊椎或无脊椎动物,包括两栖动物、节肢动物(如甲壳纲动物)、鸟、珊瑚、鱼、爬行动物、软体动物和哺乳动物,，不包括人(智人)。 3.7 动物源性医疗器械 biological materials based medical devices 某些医疗器械可能含有动物来源的材料，这些材料是多种多样的，可以构成该器械的主要部件(例如牛/猪源心脏瓣膜、羊肠缝合线、止血材料等)、涂层或者浸渗剂(例如肝素、明胶、胶原等)，也可成为生产过程中所用的辅助材料(例如牛脂等)。 3.8衍生物 derivates 通过制造工艺从动物源性材料中获得的物质。例如:透明质酸、胶原、明胶、单

15、克隆抗体、壳聚糖、白蛋白等。 3.9 化学交联 chemical cross-linking 通过化学方法，如化学键的结合，使化合物呈现稳定状态。动物源性基质材料多采用脱细胞处理和/或结合化学交联方法，达到移走或覆盖表位抗原、DNA及损伤相关的小分子物质，从而减少和控制由这些残留物质引起的免疫原性风险。 4. 实施标准概要 4.1 本方法适用于各种来源于生物组织(包括人源组织)的动物源性生物材料及其衍生物的终产品或中间产品。 4.2 对于由于生产工艺中采取了化学交联等工艺，终产品不能被酶类(蛋白酶K、胰酶等)消化的样品，应使用化学交联等工艺前的半成品。 4.3 如果需要对化学交联后的终产品进行

16、DNA残留量检测，可采用材料浸提液，而省略酶消化步骤，进行后续实验。但是，结果只能反映材料中的DNA残留量和材料表面可能由于污染造成的DNA5 YY/T XXXX.3,20XX 残留，不能代表被检品的实际DNA残留量。此时应对浸提条件作具体规定。 5. 意义和使用 5.1 本标准用于检测各种来源于生物组织(包括人源组织)的动物源性生物材料中残留的DNA量，以评价生产工艺中脱细胞处理是否完全彻底。借此预测由残留DNA引起的免疫原性风险及DNA插入变异的风险。 5.2 通过本标准所述方法对残留DNA的检测，间接地反映细胞残留物(包括细胞质内蛋白质及膜蛋白质)的存在，以评价生产工艺中脱细胞处理是否完

17、全彻底。借此预测残留细胞抗原蛋白引起的免疫原性风险。 5.3 应充分考虑本标准中方法的适用性和灵敏度。如果被检样品的残留DNA量很低，DNA纯化后的含量少于本方法的检出限时，应考虑使用其他方法(如实时定量PCR法)。 5.4 在实施本标准推荐的实验前，应考虑GB/T 16886.1或管理部门所推荐的方法(文件)所提示的信息，同时参考国内外研究的最新进展。 6. 实验方案和技术依据 本试验方法所采用的实验方案包括三个步骤:(1)动物源性生物材料的蛋白酶K消化(适用于固体或胶体状材料);(2)消化后样品的DNA纯化(磁珠吸附法);(3)纯化后样品的DNA残留量测定(荧光染色法)。试验样品除供试品之

18、外，需同步设定回收率试验样品(使用标准品Lambda DNA)。 技术依据:实验方案的设计依据下列参考文献，1)Badylak SF, et al. 2008, Seminars in 12Immunology 20:109-116;2)Thomas W, et al. J Surg Res, 2009,152(1): 135-139;3)饶春明3等，药物分析杂志, 2005,25(12):1417,1419; 4)中国药典2010版，第三部，附录IX,B 外源性DNA残留量测定法。 注:因动物源性生物材料以胶原纤维等结构蛋白为主要组成成分，其对荧光染色法DNA测定有较强的干扰作用，因此本试验

19、方法设定对供试品DNA做进一步纯化以排除干扰，保证精密度和回收率试验均符合要求。每次测定均应从一开始的蛋白酶K消化步骤起增加回收率实验，并用回收率方程对测定结果进行校正。 7(试剂和仪器 7.1 试剂 1(蛋白酶K消化用试剂:蛋白酶K(-20?保存，避免反复冻存和融化)，蛋白酶K缓冲液。 2(DNA纯化用试剂:磁珠(4?保存)、裂解液、DNA结合液、漂洗液、溶出液(室温保存)。 注:? 可选择使用核酸精制试剂盒。本标准验证实验所用试剂盒为“PrepSEQTM Nucleic Acid Extraction Kit(PN 4400799, ABI)”。其组成为:Lysis Buffer, Mag

20、netic particles, Binding Solution, Wash Buffer Concentrate, Elution Buffer, Proteinase K Buffer, Proteinase K ? 可选用其它同等效果的试剂盒，也可采用传统的酚氯仿抽提/乙醇沉淀法，但需要验证其回收6 YY/T XXXX.3,20XX 率、灵敏度及可重复性，确保能够满足实验的要求。 3(荧光染色法检测试剂:PicoGreen染料 本标准验证实验所用试剂盒为“Quant-IT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits”(P7589，Invitrogen)。内含试剂:

21、Quant-IT PicoGreen dsDNA reagent (component A); 20 x TE (component B); Lambda DNA standard (component C). 4. 其他试剂:回收率试验用标准品Lambda DNA、DEPC water、3% BSA。 7.2 仪器和器材 ? 磁力架 ? 96孔板(黑色) ? 荧光酶标仪 ? DNase-free无菌离心管;吸头 ? 冷冻离心机 ? 震荡器 ? 漩涡混悬器 ? 高精度天平(0.00001g) 8 试验过程 注明:以下试验过程中必须采取防止DNAase污染的措施，如:戴手套操作、使用没有DNAa

22、se污染的专用实验台和实验用具及仪器。 8.1 蛋白酶K消化 8.1.1 供试品的准备 ? 干燥型样品:取供试品(?100 g)，精确称重并记录，放进1.5 mL DNase-free无菌离心管内，用无菌眼科剪将样品剪裁成适当大小，加DEPC水至180L，于4?冰箱内放置12,24小时，使样品充分水和、软化。 2? 湿润型样品:取供试品(1 cm)，放于1.5 mL DNase-free无菌离心管内,13000 rpm/min离心10 min，去除液体部分。另取与上述同样大小的样品，分别放于1.5 mL DNase-free无菌离心管内, 13000 rpm/min离心10 min，去除液体部

23、分后以开盖状态放在安全柜内，令其室温内自然干燥24小时，干燥程度的判定标准为-，然后精确称重并记录，用于样品干重单位重量内DNA残留量的计算。 注明:在室温湿度较大，自然干燥24小时不能使样品充分干燥时，可将样品放在37?干燥箱内直至干燥为止。 ? 胶体型样品:精确量取供试品100 L，放于1.5 mL DNase-free无菌离心管内，可直接进行下一步实验。 注:胶体型样品:以单位体积的残留DNA含量表示最终结果。 ? 骨质类样品:对于诸如同种异体骨等骨植入物样品应参照GA/T 3832002中华人民共和国公共安全7 YY/T XXXX.3,20XX 行业行业标准-法庭科学DNA实验室检验规

24、范，对供试品进行脱钙处理。待脱钙完全，组织变软后再进行蛋白酶K消化处理。 注:? 每份样品设平行样三份，最终测定结果取其平均值; ? 可以根据委托方的要求，取不同批号或同一批号的样品3份，用以评价不同批次或同一批次内的工艺稳定性。 将上述供试品剪成尽量小的碎片后，加蛋白酶K缓冲液(10 x Proteinase K buffer)20L，蛋白酶K (20 mg/mL)10L，加DEPC水至最终反应体积为210L。 注:液态状样品不需要蛋白酶K消化，可直接进行后续的DNA纯化试验。 8.1.2回收率样品的准备 取DNA标准品(Lambda DNA standard)400ng、200ng、100

25、ng、50ng、25ng、0ng, 用DEPC水稀释至100L，分别加在1.5 mL DNase-free无菌离心管内，添加蛋白消化酶K缓冲液20L，蛋白酶K(20 mg/mL) 10L，3% BSA 80L(目的是保证与供试品反应系统相同)，至最终反应体积为210L。 注明:标准品DNA样品系列浓度的设定应根据待检测样品DNA含量的大致范围(参照生产厂家的自检信息或预试验结果)，保证待检测样品DNA含量在回收率曲线样品DNA添加量的范围之内。 8.1.3蛋白酶K消化 将上述供试品和回收率样品分别混匀后放在56?水浴槽内消化，至待检测样品完全消化,无肉眼可见颗粒样物为止(消化所需时间因样品不同

26、而异)。 注:以上反应条件及反应体积可依据样品特点进行优化、调整。 8.2 DNA纯化 依据所选择的方法及使用的试剂盒所附的操作方法进行DNA纯化。 TMTM举例:使用PrepSEQ核酸提取试剂盒(PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit)进行DNA纯化 ? 在上述各样品中分别加入裂解液400L，震荡10秒钟使样品充分混匀，室温放置10min，使样品完全溶解(最多可放置1-2小时，直至样品完全溶解)。 ? 取出装有磁珠的离心管，以“最大速度”震荡10秒钟混匀后，取30L磁珠液分别加入上述各样品内，“低速”震荡10秒钟混匀。 ? 加入400L结合液(异丙醇)，震荡5

27、秒钟。 ? 室温下震荡(1000 rpm/min)孵育10分钟。 ? 再次低速震荡10秒钟后，将内装样品的离心管放在磁力架上，收集结合有DNA的磁珠，去除上清液。 ? 漂洗DNA:加入300L洗液，低速震荡10秒钟后，将内装样品的离心管放在磁力架上，收集结合有DNA的磁珠，去除上清液。 ? 重复步骤?:漂洗DNA，至少2次。 ? 使结合有DNA的磁珠在室温下干燥5分钟。 ? 溶出DNA:加入50L溶出液，中速震荡5分钟，于70度水浴槽内孵育5分钟，中速震荡2秒钟后，将内装样品的离心管放在磁力架上，分离DNA。 8 YY/T XXXX.3,20XX ? 转移上清部分(含有纯化DNA)至新的1.5 mL DNase-free无菌离心管内，标记为纯化后DNA。 ? 重复溶出DNA:加入50