铁离子对微生物生长的影响及螯合剂抑菌机理研究毕业作品.docx

1、铁离子对微生物生长的影响及螯合剂抑菌机理研究毕业作品毕-设业-计（20_ _届）铁离子对微生物生长的影响及螯合剂抑菌机理研究所在学院 专业班级 食品质量与安全 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 摘 要：本文通过研究铁对微生物生长的影响，从而进一步研究铁螯合剂的抑菌效果及抑菌机理。根据所测定的脑心浸液培养基及普通营养琼脂培养基中铁的含量，在基本培养中加入不同浓度的铁离子，通过微生物的长势得出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和铜绿假单胞菌四种细菌的适宜铁生长浓度分别为40、60、20、40 mg/L。此外，测定了DTPA等五种不同铁螯合剂对这四种细菌的抑制效果，结果发现这五种

2、铁螯合剂对四种菌有不同程度的抑制，但不能完全抑制，且对阳性菌的抑制效果好于阴性菌。关键词：细菌；抗菌；铁；螯合剂Abstract：The impact of iron on microbial growth was studied, then the antibacterial activity of iron chelators and inhibition mechanism were further studied. The optimum growth concentration of iron of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, B

3、acillus cereus and Pseudomonas aeruginosa were 40, 60, 20, 60mg/L respectively by adding different concentrations of iron into basic culture medium, According to the measured brain heart infusion agar media and the general nutrition content of iron. In addition, tthe inhibitory effect on above four

4、kinds of bacteria of DTPA and other four chelating agents were measured. The growth of four kinds of bacteria had been suppressed, but cant completely inhibition, and the effect on gram-positive bacteria were better than Gram-negative bacteria.Keywords: Bacteria; antibiosis; iron; chelating agent1 引

5、言由细菌、病毒和霉菌等导致的微生物危害，使人们长期以来采用各种方法与各类微生物的危害进行斗争，抗菌一直是人类所关注的课题。近些年来，接连发生“非典”、“禽流感”、“甲流”等各种致病性微生物对人类社会的危害事件，细菌性食物中毒事件也时有发生，越来越引起人们对抗菌课题的关注。而当这些有害菌对传统的抗菌剂产生抗药性时，寻找新的安全有效的抗菌剂已成为亟需解决的重要课题。抗菌剂的研究始于20世纪80年代初。近年来，随着合成技术的发展，人们开发了许多抗菌剂，在医药、食品中得到了广泛的应用。目前，已研制及应用的抗菌剂可归为：天然抗菌剂、有机抗菌剂及无机抗菌剂。天然抗菌剂是人类最早使用的抗菌剂，它是从某些动植

6、物体内提取出的具有抗菌活性的高分子有机物。最常用的天然抗菌剂是壳聚糖及其衍生物，它是一种抗菌谱较广的天然物质，对细菌、酵母菌、真菌等微生物均有不同程度的抑制作用1。壳聚糖具有质子化铵，质子化铵又带有正电荷，因此能与细菌带负电荷的细胞膜作用，干扰细菌细胞膜功能，造成细菌体内细胞质流失，从而抑制细菌生长。分子量小的壳聚糖还可以通过直接进入细菌体内，干扰细菌的正常生理代谢，使之由内部瓦解衰亡。有机抗菌剂是通过化学反应破坏细胞膜，使蛋白质变性、代谢受阻，从而起到杀菌、防腐及防霉等作用。其作用速度快，可操作性好，稳定性强，对微生物的抑制作用具有一定的特异性。季铵盐类是目前国际上使用最广泛的有机抗菌剂，早

7、在1995年Kourai H2等人就发表了关于含有不饱和烷基的季铵盐抗菌剂具有高效、广谱抗菌活性的报道。无机抗菌剂是通过将无机抗菌成分与载体结合而制成，其中，载银抗菌剂抗菌能力最强，故已商品化的抗菌剂多是银系抗菌剂。根据杀菌机理的不同，又可以分为溶出型和光催化型两种。溶出型无机抗菌剂的主要品种包括以沸石、活性炭、羟基磷灰石等为载体的银、铜、锌等金属离子无机抗菌剂。光催化型无机抗菌剂的价格极为低廉，且无毒，主要品种有钛型TiO2、ZnO、SiO2等。铁是微生物生长的必需元素之一。它是电子传递链中铁硫蛋白的氧化还原中心，参与核苷酸前体的还原反应，是必不可少的营养因子。一切生物有机体从细菌到人类，其

8、生存都需要有铁的参与。铁是地壳中含量居于第四位的元素，虽然含量丰富，但大多数生物机体却不能得到充分供给，因为Fe3+在pH7的条件下溶解度很小，Fe3+的浓度不超过10-18M，而微生物生长的最低浓度约为10-7 -10-5M。嗜铁素是指一类由微生物在低铁条件下合成的小分子量的，能特异地螯合Fe3+的一种螯合因子。它们的合成受铁浓度的调节，它们被分泌到微生物的细胞外或细胞表面作为螯合因子来获取Fe3+或者将铁变为可溶形式以便微生物利用。它与Fe3+的结合能力非常强，并且有特异性，可以从各种水溶性和非水溶性的化合物中夺走Fe3+。嗜铁素通常是在好氧和兼性厌氧微生物中产生，还没有发现在严格厌氧、乳

9、酸杆菌和高等生物中产生3。嗜铁素先与寄主的铁结合形成铁-嗜铁素复合物，这种复合物与细菌外膜上存在的一种特殊受体专门结合，然后将铁释放到菌体内，提供细菌生长繁殖所需要的铁，从而使加重感染或扩散。同时，嗜铁素还可催化生成OH，进一步加重组织损伤，对细菌的生长繁殖实际上起到了辅助作用4。大多数微生物如大肠杆菌、克雷白杆菌、沙门氏菌及假单胞菌等都是通过释放铁螯合物与宿主的铁结合蛋白竞争而获得铁5。有些细菌如链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、溶血性巴斯德氏菌和肺炎支原杆菌不能合成嗜铁素，但它们的菌体膜上表达乳铁蛋白受体，这样也可以直接地和宿主乳铁蛋白结合，从而由宿主含铁蛋白上获取铁6。有些微生物还可以

10、通过合成蛋白水解酶释放到周围环境中，去降解宿主铁结合蛋白，从中获取所需要的铁7。螯合剂在食品和化妆品中具有抑菌作用是近些年才发现的。Tom等人用多种螯合剂对细菌和酵母菌进行抗菌实验发现，EHPG能一直十种不同的葡萄球菌，而DTPA效果较差8。食品中常用的螯合剂有柠檬酸盐、乳酸盐、焦磷酸盐和EDTA等9。铁螯合剂就是其中比较重要的一种，铁螯合剂能够与铁离子形成螯合物，因而降低环境中游离铁的浓度，从而达到抑制细菌生长的作用。Leen10等人于93年就发现具有螯合三价铁功能的HMP能有效抑制大肠杆菌和李斯特氏菌的生长。基于铁螯合剂有效的抗菌作用，在医药、食品等领域得到了广泛的应用。例如已经商品化的二

11、乙烯三胺五乙酸（Dietlylene triamine-penta acetic acid, DTPA）作为一种铁离子螯合剂成功地应用到医疗领域。因此，本文研究了铁对微生物生长的影响，并且对几种抗菌剂的抗菌效果及机理进行研究和探讨。2材料与方法1.1 试验材料与设备2.1.1 菌株大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)由实验室分离得到。2.1.2 主要试剂邻菲罗啉、盐酸羟胺、硫酸亚铁胺、硫酸、盐酸、醋酸钠2.1.3 培

12、养基脑心浸液培养基（BHI） 苏州兴化市联发化工试剂有限公司脑心浸液琼脂培养基（BHI） 苏州兴化市联发化工试剂有限公司基本培养基(g/L)：磷酸氢二钾 6g；磷酸二氢钾 3g；硫酸铵 1g；琥珀酸 4g；水 1000ml。调节PH至7左右，灭菌后加入1.0ml 1M硫酸镁，1.0ml 45mM 氯化钙。2.1.4 主要设备. 快速蒸汽灭菌锅 天津超拓制造生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司无菌操作台 上海精宏实验设备有限公司新型电热恒温鼓风干燥箱 宁波江南仪器厂密封式恒温可调电炉 嘉兴市欣欣仪器设备有限公司Cary 100 紫外/可见光分光光度计 美国瓦里安公司电子天平 余姚市金诺天平仪器有

13、限公司AB204-S电子天平 上海台衡仪器仪表有限公司 2.2 试验方法2.2.1 菌种保藏与活化普通营养琼脂斜面挑取一环至5mlBHI培养基中，37下培养24小时活化。菌种短期保藏可采用普通营养琼脂斜面划线，37下培养24小时后置于冰箱中冷藏保存；菌种长期保藏可采用普通营养琼脂斜面环线，37下培养24小时后，加入灭菌后的石蜡油至超过培养基1cm，置于冰箱中冷藏保存。2.2.2铁含量测定2.2.2.1 试剂配制 0.12%的邻菲罗啉水溶液称取0.12g邻菲罗啉置于烧杯中，加入60ml水，加热至80左右使之溶解，移入100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀备用。 10盐酸羟胺溶液称取10g盐酸羟胺(

14、NH2OHHCl)，溶于纯水中，并稀释至100ml。 铁标准贮备液 准确称取0.7020 g硫酸亚铁胺(NH4)Fe(SO4)6H2O，溶于1:1硫酸50 mL中，转移至1 000 mL容量瓶中，加水至标线，摇匀。该溶液为每毫升含铁100g。使用时用水配制成每毫升相当于2g铁。 50%醋酸钠溶液 盐酸2.2.2.2 样品消化称取脑心浸液培养基与营养琼脂培养基各10.0g，置于瓷坩埚中，在小火上炭化后，移入550高温炉中灰化成白色灰烬，取出，加入2ml1:1盐酸，在水浴上蒸干，再加5ml水，加热煮沸后移入100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。2.2.2.3 标准曲线绘制准确吸取0.0、1.0

15、、2.0、3.0、4.0、5.0ml每毫升相当于2g铁的标准溶液，分别移入50ml容量瓶中，各加入5ml水后，加入1ml1:9盐酸溶液、1ml10盐酸羟胺溶液及1ml0.12%的邻菲罗啉溶液，用50%醋酸钠溶液调节至PH35，混匀后用水稀释至50ml，摇匀后置于分光光度计510nm波长进行比色测定。2.2.2.4样品测定准确吸取样品溶液5ml（由于BHI中铁含量较高，事先稀释一倍），移入50ml容量瓶中，各加入5ml水后，加入1ml1:9盐酸溶液、1ml10盐酸羟胺溶液及1ml0.12%的邻菲罗啉溶液，用50%醋酸钠溶液调节至PH35，混匀后用水稀释至50ml摇匀后置于分光光度计510nm波长

16、进行比色测定，以空白为参比，并从标准曲线中查出铁含量。2.2.3 铁依赖实验2.2.3.1试剂的配制 不同含铁量培养基系列一的配制 准确称取硫酸亚铁10g，溶解于1L超纯水中，分别吸取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml至1L为灭菌的基本培养基中，调节PH至7左右，灭菌后加入1.0ml 1M硫酸镁，1.0ml 45mM 氯化钙。 不同含铁量培养基系列二的配制准确称取11.050g、22.099g、33.149g、44.199g脑心浸液培养基至1L未灭菌的基本培养基中，调节PH至7左右，灭菌后加入1.0ml 1M硫酸镁，1.0ml 45mM 氯化钙。配成铁含量为20、40、60、80mg/

17、l的培养基。2.2.3.2 菌悬液制备及铁作用斜面挑取一环到5ml脑心浸液培养基中，37培养24小时。用移液器吸取50L菌悬液至5ml不同铁含量的培养基系列一、系列二中，37培养24小时。2.2.3.3 菌体计数菌体浓度采用比色法测定600nm光密度（OD600），每个OD相当于细胞干重0.359g/l。同时取三个连续的合适的稀释度，吸取50L稀释液加到培养皿中，倒上培养基。并做两个平行。等待培养基干后倒置放到培养箱中培养24小时，第二天平板计数。2.2.4 螯合剂的抑菌作用2.2.4.1 菌悬液的准备斜面菌种挑取一环接种到脑心浸液琼脂斜面上，37培养24小时。然后再挑取一环接种到5mL的脑心

18、浸液培养基上，37再培养24小时。接着，用移液器吸取50L转移一支新的脑心浸液培养基上，放到37的培养箱中培养，直到其终浓度达到106 cfu/mL，大约需要18 20小时。2.2.4.2 螯合作用所有的试样将在1575mm的试管中进行，培养基为脑心浸液培养基，所有的试管中包含80L抗菌剂和20L菌悬液。对照管中只包含20L菌悬液和80L无菌水。37，作用2小时。2.2.4.3 稀释培养与统计取三个连续的合适的稀释度，吸取50L稀释液加到培养皿中，倒上培养基。并做两个平行。等待培养基干后倒置放到培养箱中培养24小时，第二天平板计数。3 结果与讨论3.1 培养基中的铁含量测定结果目前溶液中铁离子

19、的测定方法有原子吸收法，极谱法，重铬酸钾法，容量法，分光光度法等。其中分光光度法测定铁的方法较多，有的用双波长法测定溶液中铁离子及其它离子含量，有的选用不同显色剂测定铁离子含量如硫氢酸钾-结晶紫、邻二氮菲等11。本文选用显色剂邻二氮菲的分光光度法测定脑心浸液培养基及普通营养琼脂培养基中铁的含量。邻二氮菲又称邻菲啰啉，是一种显色剂，它与Fe2+在pH2.0-6.0溶液中形成橙红色配合物，该络合物在PH值为3-4.5时最为稳定( 避光情况下可稳定半年)，普通实验条件下8h内溶液的吸光度没有变化12。邻菲罗啉能与某些金属离子形成有色络合物而干扰测定。但在乙酸乙酸胺的缓冲溶液中，不大于铁浓度10倍的铜

20、、锌、钴、铬及小于2 mgL的镍，不会干扰测定13。本实验条件相对容易控制，显色后溶液的稳定性好，方法简单易行。测定结果如表1所示，铁标准曲线如图1所示。表1 邻菲啰啉法测定微量铁试验的结果Table 1 The of results Phenanthroline Method for the Determination of iron test 溶液铁标准溶液样品1样品2量取体积/ml01234555铁标液浓度/（g/ml)0.000.400.801.201.602.00x1x2吸光度/A0.00000.00630.01590.02670.03330.04410.03890.0009注：其中

21、样品1为脑心浸液培养基，样品2为营养琼脂培养基。图1 邻菲啰啉法测定微量铁标准曲线Figure 1 The standard curve Phenanthroline Method for the Determination of iron 由图1可以得出吸光度与浓度的线性方程为：y=0.0215x，相关系数r=0.9927，按方程计算得出x1=3.62 g/ml，x2=0.21 g/ml，样品中铁的含量按式1计算XFe（mg/kg）=m/W 式1式中：m为从标准曲线中查得的铁的质量（g）；W为测定时用品的质量（g）。求得脑心浸液培养基中XFe =1.8150100/5=1810.00 mg/

22、kg。同理求得营养琼脂培养中XFe=20.93 mg/kg。3.2 四种菌的适宜铁浓度铁是微生物生长必需的微量元素之一。细胞内许多的蛋白质，特别是一些酶类，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、核糖核苷酸还原酶等，都是含铁蛋白质，铁及其相关的化合物是相当重的酶辅基14。从呼吸链到核糖核苷酸的生物合成等细胞内一系列重要的代谢活动都与铁离子有关。铁在微生物生长过程中作用主要有：构成有机化合物，合成菌体组分；作为酶的组成成分，维持酶的活性；参与能量的储存于转运；调节细胞的渗透压；与微生物生长繁殖和致病作用密切相关15。通过该实验了解不同的铁浓度对微生物生长的影响。3.2.1 适宜铁浓度分析在基本

23、培养基中加入直接加入硫酸亚铁来培养菌的，用分光光度法测OD值以及稀释到平板法，四种菌均不生长。而在基本培养基中加入不同量的脑心浸液培养基，测其OD值结果梯度不明显，分析其原因可能是随着脑心浸液培养基加入量的增加，培养基颜色会逐渐增加，并且会逐渐浑浊，因而影响实验结果的测定。图2所示为四种菌在基本培养基中加入不同量的脑心浸液培养基用稀释到平板法所测得的结果，其中X轴表示，根据加入的脑心浸液培养基含量计算得出加入铁的含量脑心浸液培养基中铁含量为1810.00mg/kg，由邻菲啰啉法测得），Y轴表示菌落数。图2 四种菌最适铁生长浓度结果曲线Figure 2 The curve of four bac

24、terias most suitable concentration of iron 从上图可知，蜡样芽孢杆菌的最适铁生长浓度为20mg/L，大肠杆菌的最适铁生长浓度为40mg/L，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的最适铁生长浓度为60mg/L，且四种菌的最适铁浓度条件下，其生长情况均不如在纯脑心浸液培养基中好，大肠杆菌的情况尤为明显。同时，我们也可以看到，当铁含量达到一定浓度之后，随着铁加入量的增加，螯合剂对于这四种菌的促进作用并不增长。查阅文献也发现，通过在培养基中添加一定量的铁盐，可提高酵母体内铁元素的含量，并且提高酵母活性，但超过一定的范围反而对酵母的生长有抑制作用16。3.2.2 加入铁

25、离子价态选择说明细胞内许多氧化还原酶都是以二价铁为辅基。细菌在摄取利用环境中的Fe3+时，也是先将其还原成Fe2+之后再释放，尽管这是一个消耗能量的过程14。朱才庆17等人在葡萄糖为碳源的M 培养基中添加FeCl3或FeSO4，发现无论是Fe2+ 还是Fe3+都能使DH5和DA19细胞生长改善，菌体得率增加，但是添加Fe2+效果比Fe3+明显。因此在本次实验过程当中选择在基本培养基中直接加入FeSO4，然而结果发现，其培养效果很差，四种细菌均不能正常生长。现推测，可能是由于基本培养基中用磷酸盐作为缓冲液，Fe2+加入后会形成沉淀，细菌几乎不能利用，因而最终不能生长。而在基本培养中加入脑心浸液培

26、养基，其中含有的铁多为生物结合态，不容易与磷酸盐形成沉淀，并能直接被微生物所利用。在前面的实验中，已经测出脑心浸液培养中铁的含量，因此可以根据加入的脑心浸液培养基量来确定微生物的最适铁生长浓度。3.3 培养基的选择从上文可以看出，脑心浸液培养基中铁含量达到1810mg/kg，含量十分丰富，而普通营养琼脂培养基中铁含量仅为20.93 mg/kg，含量较少。同时我也对这两种培养基的培养能力作了一个比较，分别从细菌浓度为107菌悬液中吸取50l菌液至5ml的牛肉膏蛋白胨培养基和脑心浸液培养基，37下培养24h后，选取三个连续的适宜的稀释度，吸取50L稀释液加到培养皿中，倒上培养基。并做两个平行。等待

27、培养基干后倒置放到培养箱中培养24小时，第二天平板计数。结果如图4所示：图4 普通营养琼脂和脑心浸液培养基培养能力比较Figure 4 ordinary nutrient agar and brain heart infusion culture medium capacity compare从上图我们可以明显看出普通营养琼脂的培养能力远远不如脑心浸液培养基的培养能力。由此看来，脑心浸液培养基因其富含铁而适宜细菌生长，因此铁螯合实验选择用脑心浸液培养基来培养菌。3.4 螯合剂的抑制效果大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的抑制曲线结果如下图所示：表2-1 四种抗菌剂对大肠杆菌抑

28、制率%Table 2-1 The rate of inhibition of four antimicrobial agents on Escherichia coli抗菌剂浓度(g/ml)5001000150020002500SXF0.040.060.090.120.16CPD020.040.060.110.180.24TZ-270.030.060.100.130.28TZ-580.030.060.080.100.29DTPA0.060.090.100.180.56注：大肠杆菌原菌液浓度为3.24106CFU表2-2 四种螯合剂对金黄色葡萄球菌抑制率%Table 2-2 The rate o

29、f inhibition of four antimicrobial agents on Staphylococcus aureus抗菌剂浓度(g/ml)5001000150020002500SXF0.030.050.080.230.29CPD020.020.040.130.170.26TZ-270.020.060.090.150.29TZ-580.010.040.060.140.29DTPA0.100.200.510.650.83注：金黄色葡萄球菌原菌液浓度为3.79106CFU表2-3 四种螯合剂对蜡样芽孢杆菌抑制率%Table 2-3 The rate of inhibition of

30、four antimicrobial agents on Bacillus cereus抗菌剂浓度(g/ml)5001000150020002500SXF0.040.050.230.270.33CPD020.030.040.090.260.32TZ-270.040.040.090.280.34TZ-580.030.040.100.290.35DTPA0.080.100.170.530.79注：蜡样芽孢杆菌原菌液浓度为3.66106CFU表2-4四种螯合剂对铜绿假单胞菌抑制率%Table 2-4 The rate of inhibition of four antimicrobial agents on Pseudomonas aeruginosa抗菌剂浓度(g/ml)5001000150020002500SXF0.030.070.100.130.21CPD020.030.060.120.180.26TZ-270.030.050.100.130.32TZ-580.020.050.060.100.28DTPA0.040.070.100.170.65注：铜绿假单胞菌原菌液浓度为3.5