BD流式培训PPT.ppt

1、流式细胞仪工作原理及配色方法,BD技术支持 刘志刚18122206501Zhigang_,流式细胞仪应用范围,细胞水平上的检测,胞内,胞外,检测目标有特异性荧光,自发,标记,流式细胞仪检测原理,样本要求：符合检测限的颗粒细胞细胞核细菌单胞藻微粒,流式细胞仪检测原理,检测方法：颗粒列队通过激光,样本,鞘液,激光,光信号转为电信号,流式细胞仪检测原理-检测通道,散射信号与荧光信号前向角散射信号（FSC）反映细胞大小侧向角散射信号（SSC）反映细胞颗粒度荧光信号（FL Signals）（FL1、FL2FLN）反映染色强度,荧光强度（Fluorescence intensity）,流式图类型,单参数/

2、直方图,双参数/散点图,散射信号（FSC/SSC）,正常细胞,死亡/凋亡细胞,细胞碎片,荧光染色,荧光染料种类,荧光染料 激发波长(nm)发射波长(nm)用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE 488 575 免疫荧光 橙色 PerCP 488 670 免疫荧光 红色PI 488 620 DNA染色 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红色APC 633 670 免疫荧光 红色,流式细胞仪检测顺序,信号放大模式,放大器两种放大方式：线性放大（lin）对数放大（log）,光信号,光电倍增管（PMT）,放大器,电信号,线性放大（lin）,按光强度的线性关系输出信号,线性放大（

3、lin）,FSC、SSC、细胞周期检测等,调整电压=调整信号高度=调整信号位置,PMT电压,电压的大小在大多数情况下是由阴性/同型对照的信号位置决定的。在保证对照信号清晰的同时，要考虑给阳性信号留出位置。,电压的确定-直方图,-,+,-,+,电压的确定-散点图,-/-,-/+,+/-,+/+,阈值（Threshold）,任意通道都可以作阈值通常为FSC,CV值,CV值（变异系数）：样品均一度及仪器分辨率的标志,利用微球检测仪器分辨率,Good CV,Bad CV,荧光补偿,荧光染料间的光谱重叠,光谱重叠,荧光重叠的电子补偿-荧光补偿,理想状态,FITC单染,阴性对照,PE单染,FITC/PE双

4、染,荧光补偿,实际情况,FITC单染,阴性对照,PE单染,FITC/PE双染,荧光补偿,补偿效果,FITC单染,阴性对照,PE单染,FITC/PE双染,调整荧光补偿,在单染样本阳性率不足时，利用补偿微球（Comp Beads）用于流式细胞仪多色免疫分析时调整荧光补偿。,包被了非特异性抗体的微球,实验用荧光抗体,补偿受电压变动影响,FITC电压升高,荧光通道电压发生变动，与之相关的荧光补偿必须重新调节,流式实验项目组成,实验模板荧光通道阈值选择参数组合门的设置,仪器条件通道电压阈值荧光补偿,数据文件所有细胞信息,分选原理,BD FACSAria分选原理,电荷式分选,样本,鞘液,废液缸,激光,流动

5、室,收集管,电极偏转板,过程分解,Gate,Drop creation,Moment of Charge,Acoustic Wave,Charging wire,准确的分选所需条件,一、准确的Drop delay值二、稳定的液流稳定的断点三、合适的液流形态准确的充电时机,准确的分选所需条件,一、准确的Drop delay值二、稳定的液流稳定的断点三、合适的液流形态准确的充电时机,Analysis,Drop Delay,laser,Flow cell,nozzle,Drop delay（液滴延迟）,Drop delay即细胞从被检测到被分选所经过的时间差要实现精确分选，则必须得到准确的drop

6、delay值,BD Accudrop技术,Accudrop微球是一种荧光微球，可被红激光激发，是一种可以实时监测到分选纯度的标准品,Accudrop确定液滴延迟,未调整好,已调整好,准确的分选所需条件,一、准确的Drop delay值二、稳定的液流稳定的断点三、合适的液流形态准确的充电时机,稳定的液流,稳定的断点Drop 1,准确的分选所需条件,一、准确的Drop delay值二、稳定的液流稳定的断点三、合适的液流形态准确的充电时机,Drop Creation,DropCharging,Time,Drop Deflected,Drop Deflected,合适的液流形态,准确的充电时机,分选注

7、意事项,选择合适的喷嘴选择分选模式选择合适的震荡频率选择鞘液压力分选常见问题,喷嘴直径,喷嘴规格：70um、85um、100um、140um喷嘴选择要求：直径为样本细胞直径3倍以上,分选模式,Purity-纯度模式，2路分选常用4-Way Purity-4路分选时，避免中间2路纯度受影响Yield-保证回收率，低纯度Single Cell-准确分选计数Initial-Drop Delay设定粗调模式Fine Tune-Drop Delay设定细调模式,分选模式,Purity Mask,Yield Mask,Phase Mask,震荡频率（Frequency）,千赫兹（kHz）：每秒震荡次数。值

8、越高，每秒可形成的液滴数越多。,The Importance of Frequency,纯度与得率,当存在冲突液滴，为保证分选纯度，仪器主动放弃分选。,纯度与得率,分选的纯度和回收率是一对相互制约的参数，不能同时最大化分选的纯度和回收率在选择分选的模式时需要考虑实验的目的来决定纯度和回收率之间的平衡,上样速度与得率,同纯度与得率的关系,得率、纯度、速度的关系,鞘液压力,鞘液压力越大，潜在上样速度越高。但是：高压力对细胞有较大损伤。,鞘液压力越高，所用喷嘴必须越小，否则无法形成液滴,为保证可接受的回收率，上样速度应为震频的五分之一以下,高压力与低压力分选神经元细胞后的比较,FACS Aria分选

9、常见问题,喷嘴问题测试液流角度小Accudrop测试左窗比例低所得细胞数远少于仪器显示数分选纯度低分选所得细胞活性低,液流窗液流图像不正常,喷嘴插入位置不佳O圈位置不佳喷嘴脏,测试液流角度小,确认鞘液桶内是否为电解质液体PBS清洗、调整偏转板潮湿结晶角度不佳,Accudrop测试左窗比例低,摄像机对比度及明亮设置,微球上样速度,侧液流角度偏移,所得细胞数远少于仪器显示数,喷嘴过小、样本粘稠,上样速度过快、细胞粘连,Single Cell模式,正确的样本处理,上样管内不可装培养基，蛋白浓度越低越好，5mM EDTA有助于防止细胞重新聚集。防止DNA释放导致的粘连：100mg/ml DNaseI+

10、5mM MgCl2,分选纯度低,确认喷嘴大小确认Drop Delay无误确认已经开启Sweet Spot确认选择了保证纯度的分选模式排除黏连细胞,利用W信号排除粘连体,选择合适的图,选择合适的阈值,细胞活性低,检测分选前细胞活性PI/台盼蓝收集管内放置合适液体放置培养基降低上样仓温度仪器管道消毒无菌清洗鞘液压力过大降低压力,配色,多色搭配考虑因素,如何合理搭配颜色？仪器因素抗原表达量的差异染料亮度差异染料之间的干扰,仪器因素,仪器配置,抗原表达量,抗原表达量,MFI,抗原表达量差异,强表达,连续表达,弱表达,抗原表达量分类,染料亮度,荧光亮度差异,染料亮度差异,染料亮度分类,新的BV染料-多色

11、搭配首选,BUV唯一可紫外光激发抗体耦合染料,染料亮度对结果的影响=决定性影响,染料之间的干扰,染料之间的干扰,光谱重叠与荧光补偿,荧光补偿是对光谱重叠的校正,补偿时的实际情况,光谱重叠会导致Spread,Spread越大，指示重叠越大，补偿效果越差,A,B,单阳？双阳？,光谱重叠,补偿值与Spread没有必然的关系,光谱重叠,补偿值与Spread没有必然的关系,染料之间的Spread是固定的,光谱重叠对照表,多色搭配考虑因素,如何合理搭配颜色？了解仪器抗原表达量的差异-了解样本染料亮度差异染料之间的干扰,了解染料,配色原则,弱表达搭配亮染料尽量减少光谱重叠共表达不可搭配重叠严重的染料,弱表达

12、搭配亮染料,强表达,弱表达,染料亮度表,CD3CD4,CD25CD127,考虑光谱重叠,颜色较少时不容易有较高重叠,CD3CD4,CD25CD127,6色实验-初试,强表达,弱表达,强表达,发生了什么？,FMO（Fluorescence Minus One）的使用,通过FMO找出影响因素初次做多色实验时，最好用FMO判断配色是否合理。,注意光谱重叠,关注共表达,共表达,共表达,共表达因子之间要减少光谱重叠，并尽量安排由不同激光激发,荧光补偿,补偿太小,补偿太大,补偿正确,Biexponential(双指数)刻度在荧光补偿中的应用,复习：配色原则,弱表达搭配亮染料尽量减少光谱重叠共表达不可搭配重叠严重的染料共表达尽量用不同激光激发,光谱查看器,查找最佳激发光,检查染料是否可多激光激发,查找最佳滤光片,染料之间重叠程度参考,Thank you for your attention,