实验方法汇总.docx

1、实验方法汇总可溶性蛋白、SOD、POD、CAT、MDA的测定一、磷酸缓冲液的配制：二、酶液的制备：称取0.51g（FW）放入研钵中，加5毫升PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，12000转冷冻离心20分钟，上清液（酶液）倒入试管中，置于04C下保存待用。三、可溶性蛋白的测定1、试剂的配制:牛血清白蛋白标准液（100g/mL）：精确称取0.0100g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL（4保存）。考马斯亮蓝G-250染色液：取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL 85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。过滤待用。该试剂于常温

2、下可保存1个月。2、标准曲线制作01000g/ml标准曲线的制作取6支10ml具塞试管，按下表取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后，在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD值，并做出标准曲线。表 01000g/ml标准曲线管号1234561000g/ml母液(ml)00.20.40.60.81.0DH2O(ml)1.000.80.60.40.20.0G-250试剂(ml)555555蛋白质含量(g)02004006008001000OD2502、样品测定取2支试管（10ml具塞，作为3个重复），按下表加样：管号空白样品样品样品待测样品(ml)00.080.080.0

3、8DH2O(ml)1.000.920.920.92G-2505555OD5950蛋白质含量03、计算结果样品中蛋白质含量（g/gFW）=其中X为在标准曲线上查得的蛋白质含量，g；V0为提取的总体积，ml；V1为测定蛋白质时所用的体积，ml；W为样品鲜重，g。四、SOD的测定：1、SOD反应液的配制： （1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）（2）130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750M四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；（4）100M EDTA-Na2:取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓

4、冲液定容至1000ml，避光保存；（5）20M核黄素(FD):0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。（取0.0753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml，取10ml稀释至100ml）酶液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：FD：H2O的比例为0.1：1.5：0.3：0.3：0.3：0.3：0.2，按母液顺序配制。2、SOD的测定：取型号相同的四支试管，一支做空白，一支做对照（均不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，遮光保存，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光20分钟，以空白调零，560nm比色。表：SOD反应体系试剂空白（暗处）对照（4000Lux）样品

5、1（4000Lux）样品2（4000Lux）0.05mol/L磷酸缓冲液1.61.61.51.5130mmol/LMet溶液0.30.30.30.3750mol/LNBT溶液0.30.30.30.3100mol/LEDTA-Na20.30.30.30.320mol/L核黄素0.30.30.30.3酶液000.100.10蒸馏水0.20.200.200.20总体积3.03.03.03.0吸光值03、结果计算 SOD总活性（吸光度/gFW）=单位：NBT光还原50%为单位SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度式中：SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋

6、白表示；ACK为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V0为提取酶液的总体积，ml；V1为测定时所用的体积；W为鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/g。五、POD的测定：1、0.1M PH6.0磷酸缓冲液的配制：2、POD反应液的配制：0.1M PH 6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O219微升混合，保存于冰箱中。3、POD的测定：20微升酶液+3毫升反应液于比色皿中，20S后在470nm下开始计数，每隔20s读数一次，共读两次，以每分钟吸光度变化值（A470/minmg pr或A470/ mgFW）表示酶活力的大小

7、。4、结果计算：POD活性（A470/mingFW）=A470V0/V1/W/t式中：A470为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重，g；t为反应时间，min；V0为提取酶液的总体积，ml；V1为测定时所用的体积。六、CAT的测定：1、CAT反应液的配制：0.1MH2O2溶液：0.568毫升30% H2O2定容至100毫升。 0.1MPH7.0磷酸缓冲液： 0.1M的H2O25毫升+0.1M的PH7.0的磷酸缓冲液20毫升（即按1：4的比例）混匀，即为CAT反应液。2.CAT的测定：0.1毫升（或50微升）酶液+2.5毫升反应液，240纳米下比色，每隔1分钟读数1次，共读数3次。3.结果计算：

8、CAT活性（240/mingFW）=240V0/V1/W七、丙二醛（MDA）的测定1、试剂：10%的三氯乙酸、0.6%的硫代巴比妥酸（配法：称取0.6g硫代巴比妥酸，加入10ml1mol/L的NaOH溶液，加热溶解，再加入11ml 1.0mol/L的HCl溶液，然后转移到100ml容量瓶中，5小时内使用）2、MDA测定体系对照待测1待测2TBA溶液（ml）2.02.02.0磷酸缓冲液0.05M(ml)2.01.01.0酶液0.01.01.0按上表加入各溶液，混匀后于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心（3000，15min）。取上清液测定532、600和450nm波长下的吸光值。3、含量计

9、算，采用双组分光广度计法，根据公式(1)：C1(mol/L)=6.45(D532D600)0.56D450 （1）其中C1为MDA的浓度，D450、D532、D600分别代表450nm、532nm、600nm波长下的吸光值。此外还可以计算出溶液中可溶性糖的浓度C2。C2（mmol/L）=11.71D450 （2）粗纤维含量的测定本标准适用于植物类食品中粗纤维含量的测定。一、原理：在硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶质和半纤维素经水解除去后，再用碱处理，除去蛋白质及脂肪酸，遗留的残渣为粗纤维。如其中含有不溶于酸碱的杂质，可灰化后除去。二、试剂：1.25%硫酸。（取比重1.84的浓硫酸13ml加水

10、稀释至1L）1.25%氢氧化钠溶液、酒精7085%、乙醚三、 实验步骤：1、将磨碎的烘干样品0.5g左右，无损失地倒入具塞三角瓶中。再烘干滤纸。注意温度不要过高，一般在8090度，防止滤纸烘焦影响重量。2、将200ml1.25%的硫酸倒入瓶中，加热至沸腾时再继续30分钟。3、冷却之后，用带有已知重量的滤纸过滤，并用热蒸馏水冲洗三角瓶及漏斗34次，直到滤液用石蕊试纸试验呈中性反应为止。4、用1.25%氢氧化钠溶液将滤纸上的沉淀物完全洗入瓶内，将其加热至沸腾再继续30分钟(操作同上)。5、煮沸后冷却，用酒精冲洗23次直至滤液无色为止。若植物样品含色素多，除用酒精外，还要用乙醚冲洗至无色为止。6、将

11、滤纸和沉淀在75度的烘箱中烘至恒重(用分析天平称重)。四、计算：已知滤纸重量为Wp，滤纸及纤维重量为Wt，则粗纤维重量Wc=WtWp，再换算成百分重量。硝酸还原酶活性测定一、原理：硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它作用于NO3-使还原为NO2-；产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。NO2-含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanilamide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。二、仪器药品： 721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空

12、干燥器、钻孔器、三角烧瓶、移液管、烧杯 0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5 0.2mol/L KNO3：溶解10.11g KNO3于500ml蒸馏水中。 磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。 萘胺试剂：0.2g萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。 NaNO2标准溶液：0.1g NaNO2用蒸馏水溶解成100ml。然后吸取0.5ml，再加蒸馏水稀释成100ml，此溶液每ml含有NaNO2 5g，用时稀释之。 三、操作步骤 1、将新鲜取回的叶片水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2到3次，吸干水分，然后于天平上称取等重的

13、叶子圆片两份，每份约0.20.3g（或每份取30个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应

14、溶液1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，在520nm下进行比色测定。通过标准曲线测得NO2- 的含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO2- g或mol表示之。 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30g3磷酸甘油醛或1，6二磷酸果糖，能显著增加NO2- 的含量。 2、绘制标准曲线 与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。 吸取不同浓度的N

15、aNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5g/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水浴中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标绘制吸光度浓度曲线。表：标准曲线的制作NaNO2浓度（g/mL）543210.5标准母液（mL）1.00.80.60.40.20.1蒸馏水（mL）00.20.40.6.81.0磺胺（mL）222222萘胺222222OD值叶绿素含量测定（张宪政三波长检测法）一、药品： 乙醇：丙酮=1：1混合液（各5ml）二

16、、方法：1、提取 称取0.05g左右或用打孔器打0.1dm2叶圆片,放入试管中(最好用密封的刻度试管),加10ml提取液,密封,写好处理编号,置于试管架上,在黑暗条件下浸提24-36小时(至叶片脱色变白).2、比色测定 (1)调杯误差 把比色杯编号,清洗干净,干燥后待用;杯中加入空白提取液,以1号杯在663nm处调零,然后记录其它3个杯在此波长下的OD值;然后波长转到645nm下,以1号杯调零再记录其它三个杯的数值;最后转到440nm下重复上述步骤.(2)测样品 1号杯空白液保留,其它三个比色杯倒出液体,控干,倒入少量待测液润洗(润洗液倒入入废液缸中),再次倒入待测液体,三个杯均装好后,进行比

17、色测定.(注意测定一个波长后在转到另一个波长时要重新调零),记录测定OD值.3、计算:所得的OD值代入以下公式求得溶液色素浓度(mg/L)Chla=12.7D6632.59D645Chlb=22.9D6454.67D663Chla+b=20.3D645+8.04D663Ca2=(1000D4403.27Chla104Chlb)/229得到结果代入下式中得到单位叶面积重或面积叶绿素含量叶绿素含量(mg/g)=CV/A1000 或叶绿素含量(mg/dm2)= CV/A100C:测定液中叶绿素浓度(mg/L)V:提取液总体积(ml)A:叶鲜重(g)或叶面积(dm2)蒽酮法可溶性糖含量的测定一、试剂：

18、标准葡萄糖母液：在电子天平上称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水中，定容至500ml，则得每ml含糖量为200ug的标准溶液。蒽酮试剂：称取1g蒽酮结晶粉末，溶解于1000ml稀硫酸溶液中即得。稀硫酸溶液由760ml浓硫酸（比重1.84）稀释成1000ml而成二、方法步骤1、标准曲线的制作。取标准糖溶液将其稀释成一系列不同浓度的溶液各10毫升，浓度分别为每毫升含糖0、25、50、75、100、120、150、200微克。将试管编号，依次将每管中加入1毫升上述葡萄糖标准溶液及5毫升的蒽酮试剂，震荡使之完全混合，在沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后在分光光度计波长620纳米下比色，测定各溶

19、液的光密度，以光密度为纵坐标，糖溶液浓度为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。2.测定样品的可溶性糖含量称取重量3g的新鲜植物叶子，于研钵中仔细研磨，研磨时加乙醚少许，倒入烧杯中，用热水（70oC）洗涤研钵，洗涤液并入烧杯中，再加入蒸馏水约3040ml。将烧杯放在水浴锅上加热，保持温度7080oC半小时，冷却后一滴一滴地加入饱和中性醋酸铅以除去混合液中的蛋白质，直至不再形成白色沉淀为止，然后将此混合物连同残渣一并洗水100ml容量瓶中，加水至刻度，充分摇荡，用漏斗过滤到三角烧瓶中，瓶中事先放有少量（约0.20.4g）的草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再行过滤，所得透明滤液即

20、为可溶性糖提取液。取1ml这种糖提取液，加入5ml蒽酮试剂，混匀后立即置于沸水中，煮沸10分钟，取出冷却后比色。五、计算根据光密度值从标准曲线上查出相应的糖含量，按下列公式计算出样品的含糖量： 可溶性糖含量% =100% A为植物样品稀释后的体积（ml）C为提取液的含糖量（g/ml）W为植物组织鲜重量（g）绿原酸含量测定(紫外分光光度法)1、标准曲线的绘制:精密称取绿原酸标准样品?mg（0.25mmol），用95%乙醇溶解，转移到250ml容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混匀。此溶液浓度为1mol/mL。精密吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL到25ml容量瓶中，加95%乙醇到刻度

21、，混匀，此为标准系列溶液。在330nm处测定吸光度，以绿原酸标准品的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并求出相应的回归方程。2、样品中绿原酸含量的测定（1）提取液的制备：准确称取干物质0.2g左右，置于10ml容量瓶中，量取约10ml95%的乙醇溶解样品，并置于85的恒温水浴箱中，4h。放置、冷却至室温，过滤。（2）含量测定：吸取1ml过滤液用95乙醇定容至10ml容量瓶，待用。以95%的乙醇作空白，在330nm处测定吸光度，由标准曲线计算出待测样品液浓度。绿原酸标准液（mL）0.10.20.40.60.81.0绿原酸浓度（mol/L）0.40.81.62.43.24.0吸光值3.

22、绿原酸含量计算：绿原酸含量C5M/干物质重C:由标准曲线查得的浓度-萘胺氧化法测定根系活力一、试剂-萘胺溶液：称取12.5g-萘胺，先用2mL左右的95乙醇溶解，然后加水定容到250mL，成为50g/mL的溶液。0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲液1%对氨基苯磺酸：将1g对氨基苯磺酸溶解于100mL30醋酸溶液中。亚硝酸钠溶液：称10mg亚硝酸钠溶于100mL水中。二、实验步骤1、-萘胺的氧化：挖出蒲公英植株，并用水洗净根系上的泥土，剪下根系，再用水洗，待洗净后用滤纸吸去根表面的水分，称取1-2g放在100mL三角瓶中。然后加50g/mL的-萘胺溶液与磷酸缓冲液等量混合液50mL，轻轻振荡，

23、并用玻棒将根全部浸入溶液中，静置10min，吸取2mL溶液测定-萘胺含量，作为实验开始时的数值。再将三角烧瓶加塞，放在25恒温箱中，经一定时间后，再进行测定。另外，还要用另一支三角烧瓶盛同样数量的溶液，但不放根，作为-萘胺自动氧化的空白，也同样测定，求它自动氧化量的数值。2、-萘胺含量的测定：吸取2mL待测液，加入10mL蒸馏水，再在其中加入1对氨基苯磺酸1mL和亚硝酸钠溶液1mL，室温放置5min待混合液变为红色，再用蒸馏水定容到25mL。在20-60min内510nm处比色，读取OD，在标准曲线上查得相应的-萘胺浓度。从实验开始10min时的数值送去自动氧化的数值，即为溶液中所有的-萘胺的

24、量。被氧化的-萘胺的量以g/gh表示。因此，还应将根系烘干称其干重。3、绘制-萘胺的标准曲线：取浓度为50g/mL的-萘胺溶液，配制成浓度为50、45、40、35、30、25、20、15、10、5g/mL的系列溶液，各取2mL放入试管中，加蒸馏水10mL，1对氨基苯磺酸溶液1mL和亚硝酸钠溶液1mL，室温放置5min待混合液变为红色，再用去离子水定容到25mL。在20-60 min内510nm处比色，读取OD。然后以OD510作为纵坐标，-萘胺浓度为横坐标，绘制标准曲线。还原型VC含量的测定一、试剂5%的钼酸铵溶液：(w/v)准确称取钼酸铵5.000g，加适量水溶解后定容至100ml)； 5%

25、的硫酸溶液(v/v);草酸EDTA溶液：(草酸0.05mol/L、EDTA0.2mmol/L，准确称取含结晶水的草酸6.3000g，EDTA0.0584g，充分溶解定容至1000ml);偏磷酸-醋酸溶液(摇动溶解3g片状偏磷酸于8ml醋酸中，稀释至100ml用滤纸过滤，取滤液备用)。标准VC溶液：准确称取60g真空干燥2h的VC0.0500g，用上述配好的草酸-EDTA溶液定容于50ml的容量瓶中，使标准溶液浓度达到1mg/ml。二、实验步骤1、还原性VC含量的测定：称取蒲公英鲜叶5g，匀浆后用草酸EDTA溶液定容至10mL容量瓶，过滤，吸取上清液待用。吸取2mL提取液于50mL容量瓶中，然后

26、加入8mL草酸-EDTA溶液。再加入1.00ml偏磷酸-醋酸溶液和5%的硫酸溶液2.0ml，摇匀后加入4.00ml钼酸铵，用蒸馏水定容到50mL。以蒸馏水代替提取液作空白在705nm处测定吸光度。2、标准曲线制作：分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准液于10mL容量瓶中，用草酸-EDTA溶液定容到10mL。转入50mL容量瓶中，再加入1.00ml偏磷酸-醋酸溶液和5%的硫酸溶液2.0ml，摇匀后加入4.00ml钼酸铵，用蒸馏水定容到50mL。以蒸馏水代替提取液作空白，15min后在705nm处测定吸光度。VC标准液（mL）00.10.20.40.60.81.0VC浓度

27、（g/mL）0248161820草酸-EDTA溶液（mL）109.99.89.69.49.29.0偏磷酸-醋酸溶液（mL）1.01.01.01.01.01.01.05%的硫酸溶液（mL）2.02.02.02.02.02.02.0钼酸铵（mL）4.04.04.04.04.04.04.0蒸馏水（mL）33333333333333吸光值三、结果计算还原型VC含量（g/g）CV1/(WV)C:由标准曲线查得的VC含量(g)；V1：测定用样品液体积(mL)；W：样品鲜重（g）；V：样品液定容总体积（mL）。硝态氮（硝酸盐）含量的测定一、试剂：（1）500mg/L：硝态氮标准溶液：精确称取烘至恒重的KNO

28、30.7221g溶于蒸馏水中，定容至200ml。（2）5水杨酸-硫酸溶液：称取5g水杨酸溶于100ml比重为1.84的浓硫酸中，搅拌溶解后，贮于棕色瓶中，置冰箱保存一周有效。（3）8氢氧化钠溶液：8g氢氧化钠溶于1ml蒸馏水。二、方法：1、标准曲线的制作：（1）吸取500mg/L硝态氮标准溶液1、2、3、4、6、8、10、12ml分别放入50ml容量瓶中，用无离子水定容至刻度，使之成为10、20、30、40、60、80、100、120ml/L的系列标准溶液。（2）分别吸取上述系列标准溶液0.1ml于试管中，以0.1ml蒸馏水代替标准溶液作空白。再分别加入0.4ml5%水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在

29、室温下放置20min后再加入8NaOH溶液9.5ml，摇匀冷却至室温。（3）以空白作参比，在410nm波长下测定光密度。绘制标准曲线。2、样品中硝酸盐的测定（1）取样品鲜重2g左右，放入20ml刻度试管中，加入10ml无离子水，置于沸水浴中提取30min。到时间后取出，用自来水冷却，定容至刻度。（2）样品液的测定：吸取样品液0.1ml于试管中，然后加入5水杨酸-硫酸溶液0.4ml，混匀后置室温下20min，再慢慢加入9.5ml8NaOH溶液，待冷却至室温后，以空白作参比，在410nm波长下测其光密度。在标准曲线上查得硝态氮浓度，再用以下公式计算其含量。三、结果计算：硝态氮含量DV/WD：从标准曲线上查得的硝态氮浓度；V：样品液总量；W：样品鲜重。电导率测定方法1清洗用具：由于电导率仪对溶液中的电解质含量变化极为灵敏，所以实验开始前必须首先清洁实验用具。玻璃用具和打孔器先用去污粉(或洗液)清洗，再分别用自来水、无离子水冲洗数遍，然后放入(或倒置在)洗净且垫有洁净滤纸的瓷盘中，并用盖子或洁净纱布盖好。2材料准备：本实验选取颜色、大小、