基因工程理原核基因表达调控.docx

1、基因工程理原核基因表达调控中国农业科学院研究生院基因工程原理课程补充讲义（四）吴乃虎（中国科学院遗传与发育生物学研究所）黄美娟（北京大学生命科学学院细胞与遗传学系）2011年6月21日原核基因表达调节方式（1） 操纵子的调节方式（2） 调节子的调节方式（3） 弱化子的调节方式（4） 抗终止子的调节方式（5） 适应性效应的调节方式（6） 正调节和负调节（7） 预程序化环路和快速开关的调节方式（8） 核糖体开关和转译的自我调节方式（9） 甲基化与限制修饰的调节方式原核基因表达调节的分子机理一、 若干基础知识1. 原核基因表达的调节方式 基因表达：细胞通过DNA的转录和RNA的转译等复杂的酶催生化反

2、应，将基因所携带的遗传信息转变为RNA转录本或蛋白质多肽链的过程，叫做基因的表达（gene expression）。 基因表达的调节：基因表达可分为4个不同的阶段，即DNA转录、转录后加工、RNA转译和转译后加工。在基因表达的各个阶段，存在于细胞核或细胞质中的各种不同的调节因子，诸如RNA聚合酶、激活蛋白质（activator）、阻遏蛋白质（repressor）以及转录因子等，都会参与对基因表达的活性及时空特异性进行严格而细致的控制。我们将这类特殊的涉及反式作用因子同基因顺式元件之间的相互作用，叫做基因表达的调节（regulation of gene expression）。（1）操纵子的调节

3、方式 操纵子：系指若干功能相关的基因聚集成簇，形成受同一个启动子控制的单一的转录单位。最早是由法国分子遗传学家F.Jacob和J.Monod发现的，系为原核生物特有的基因转录单位。整个大肠杆菌染色体基因组大约存在着600个以上的不同的操纵子。它是原核基因表达调节的独特方式。 标准的操纵子结构：a l个或数个调节基因； b.312个蛋白质编码基因； c. 1个上游启动子； d. 1个下游终止子。 这4种组分串联排列组成操纵子。其中若干个蛋白质编码基因，被转录成一个多顺反子的mRNA，尔后再转译成各自的编码蛋白质。 结构基因、调节基因和操纵单元结构基因（structural gene）：细胞中基本

4、的组成蛋白质，例如代谢酶类、运输蛋白质和细胞骨架成分等的编码基因，叫做结构基因。调节基因（regulatory gene）：编码用以控制其他基因表达活性的RNA或蛋白质产物的基因，叫做调节基因，它的编码产物叫阻遏蛋白（repressor）。操纵单元（operator）：接受调节基因编码的阻遏蛋白的结合作用，使结构基因转录活性受到抑制的特定DNA区段，叫做操纵单元（operater）或控制元件（control element）。有的作者将“operator“译为“操纵基因”是不妥的！因为它既不会转录出RNA，更不会转译成蛋白质。（2）调节子的调节方式 调节子（regulon）：大肠杆菌基因组中，

5、其表达活性受同一种调节蛋白质调节并对同一种信号作出反应的、一组不连续相邻排列的结构基因或操纵子，叫做调节子。调节子与操纵子不同之处在于，操纵子的结构基因是彼此相邻排列的，而调节子的结构基因则是分散于染色体的不同部位。一个调节子具有多个分布在染色体各个部位的分散的启动子。常见的两个调节子的例子是E.coli利用麦芽糖的基因之调节子和合成精氨酸基因的调节子。其中精氨酸调节子由12个基因组成，它们负责精氨酸的生物合成。（3）适应性效应的调节子适应性效应（adaptive response）：大肠杆菌不仅能够在不同环境条件下生存，而且还能够迅速适应瞬时产生的剧烈的环境变化。大肠杆菌这种新陈代谢类型的快

6、捷改变叫做适应性效应，它也是大肠杆菌基因表达的一种重要的调节方式，即适应性效应的调节方式。（4）正调节和负调节方式 调节蛋白质的类型与作用调节基因编码的蛋白质叫做调节蛋白质，包括： 正调节蛋白质，也叫激活物（activator）、活化子、或激活蛋白质。是一类能够同增强子或激活物特异结合区结合的反式作用蛋白质。 负调节蛋白质，也叫阻遏物（repressor）、抑制蛋白质或抑制子。其主要功能是通过同DNA或RNA上的调节序列，即操纵单元的结合作用，阻止操纵子的转录或转译反应。此外，能够对转录和转译作负调节的蛋白质或RNA分子，通常也叫做阻遏物。 正调节与负调节正调节：如果一种调节蛋白质处于激活状态

7、时，能够开动操纵子的表达活性，我们说这种操纵子是受调节蛋白质的正调节。所以说受激活物调节的操纵子是属于正调节的操纵子。因为处于激活状态的激活物，会开动由其控制的操纵子的转录反应。负调节：如果一种调节蛋白质处于激活状态时，能够关闭操纵子的表达活性，我们则称这种操纵子是受调节蛋白质的负调控。所以说受阻遏物调节的操纵子是属于负调节的操纵子，因为激活物的存在阻止了操纵子的转录反应。 阻遏物和激活物对基因转录活性的调节基础转录（本底转录）：在既没有阻遏物，也没有激活物的情况下，RNA聚合酶偶然同启动子结合而启动的转录，叫做基础转录。由于RNA聚合酶单独同启动子结合作用程度微弱，所以启动的基础转录水平低下

8、。阻遏物负调节的机理：一旦阻遏物同操纵单元结合之后，便会阻止RNA聚合酶加入同启动子特定位点结合。这是因为这两个结合位点之间存在着序列重叠的缘故。于是便使得有关基因的转录活性受到抑制，此即为负调节。激活物正调节的机理：激活物以一个表面结合在启动子上游的激活位点上，同时以另一表面与RNA聚合酶结合，进而将其牵引到启动子的结合位点上。结果激活启动子启动高水平的转录作用。文献将这种通过激活物的中介作用，促进RNA聚合酶（或是转录因子）同启动子元件结合的过程，叫做募集（recruitment）。如果细胞中同时存在着阻遏物和激活物时，情况又会怎样的呢？一般说来由于阻遏物的活性优于激活物，因此，基因仍处于

9、抑制状态。（5）预程序化环路和快速开关调节大肠杆菌细胞中组成型基因的表达产物，对所有的细胞在任何环境条件下的生长繁殖都是必须的。相反地，诱导型基因的编码产物，只是在特定生存环境条件下，才是细胞生长的必须品。因此诱导型基因的表达必须受严格的调控，并随着环境的变化交替地出现“开启”与“关闭”的状态。1 预程序化环路机理（preprogrammed circuits mechanism）大肠杆菌细胞按照预先决定的遗传程序，对基因表达进行控制的调节方式，叫做预程序化环路机理。例如病毒感染激活一组基因表达一个或数个基因产物关闭第一组基因表达启动第二组基因表达关闭第二组、启动第三组表达 由于这类基因表达一

10、般都是按照预程序化进行的，而且似乎都是一种环路结构，故特称这种基因表达调节方式为预程序化环路机理。2 快速开关机理（rapid switch mechanism）这是大肠杆菌应答环境变化，而迅速开启和关闭有关基因的表达活性的一种调节方式。这种调节方式对原核生物十分重要，使它们具有极大“可塑性”，能够快速调整新陈代谢反应，保证在多变环境条件下获得最佳的生长及增殖速率。2.原核基因表达的诱导与阻遏组成型基因的表达在整个细胞生命周期中是持续进行的，且不受环境条件变化的影响。诱导型基因表达在细胞生命周期中，存在着诱导与阻遏（抑制）亦即是开启与关闭的循环变化。（1）基因表达活性的诱导 诱导（induct

11、ion）因环境中某种特定物质（诱导物）的存在，而使特定基因表达活性得到开启的过程，叫做诱导。 诱导物（inducer）一类能够通过同调节蛋白质结合而启动基因转录的小分子量物质，或者说是能够引起诱导反应的物质或分子，叫做诱导物。例如乳糖作为诱导物，可以使参与其吸收及代谢活动的一些酶蛋白大量分泌。诱导物可能是酶作用的底物。3 诱导基因（inducible gene）亦叫诱导基因，系指一类表达活性是在环境诱导物作用下而得以启动的基因。4 酶的诱导与酶的激活酶的诱导（enzyme induction）是指在细胞水平上，当培养基中存在着某种必须的底物时，细菌或酵母细胞具备了合成某种特定蛋白酶的能力的生化

12、转变过程。这种类型的诱导称为酶的诱导。酶的激活（enzyme activation）同酶的诱导不同，两者不可混淆！因为酶的激活是发生在分子水平上，由一种小分子同酶结合之后而导致酶活性增加的过程，但并没有影响到酶的合成速率！（2）基因表达活性的阻遏 阻遏（rpression）亦称为基因表达活性的阻遏，或叫基因表达活性的抑制。它是指因环境中化学因素或其他因素的刺激作用，而导致基因或基因组表达活性关闭的过程。2 被阻遏的基因（repressed gene）或译为被抑制的基因。它是指因环境化学因素或其他因素的刺激作用，其表达活性被关闭的基因。要注意“repressed gene ”（被阻遏的基因）与“

13、repressor gene”（阻遏基因）之间概念的差别！后者是指编码阻遏物的基因。5 去阻遏的基因（derepressed gene）或译消阻遏的基因，或去抑制的基因，是指其表达活性被重新开启而处于表达状态的基因。不论是被阻遏的基因，还是去阻遏的基因，它们所描述的都是基因的表达状态，而非基因的编码属性！阻遏与诱导作用一样，都是发生在基因的转录水平上。6 阻遏作用与反馈抑制阻遏作用的结果是关闭了相关基因的表达活性，使酶或蛋白质的合成终止。而反馈抑制（feedback inhibition）指的是生物合成途径中，一种终产物反过来与该途径的头一种酶分子发生结合作用，从而导致酶活性被抑制的生化过程。

14、需特别指出，反馈抑制的仅仅是酶的活性，而不影响酶的合成。因此它与阻遏作用属于不同的概念。（3）诱导物与辅阻遏物 效应物（effector）也叫做效应物分子（effector molecular），是一类通过同蛋白质特定位点的结合作用，从而调节蛋白质分子活性的小分子。一般是诸如氨基酸和糖类等小分子量代谢物。它们是通过与阻遏物结合成复合物的方式，使后者的性质发生改变来发挥作用。 效应物的类型诱导型操纵子中的效应物分子，叫做诱导物。而阻遏型操纵子中的效应物分子，则叫做辅阻遏物。3 辅助阻遏物（corepressor）系指一类有助于促进阻遏物同启动子中操纵单元紧密结合的小分子量的代谢物分子。它能够通过

15、同调节蛋白质的结合作用，阻止转录反应。例如在阻遏型的色氨酸操纵子中，辅助阻遏物色氨酸，便是通过与阻遏物-色氨酸阻遏蛋白（trp repressor protein,TrpR）形成复合物的方式，使后者的构型发生变化，而能同操纵单元结合，从而关闭色氨酸操纵子结构基因的表达活性。3. 顺式作用元件与反式作用因子（1）顺式与顺式作用元件 顺式（in cis）在分子遗传学中所谓顺式，是用来描述位于同一条染色体或DNA分子上的两个基因，或两个遗传标记之间的状态或关系的一种术语。例如启动子的组成元件，对它所控制的下游基因而言，两者即为顺式关系。2 顺式作用元件（cis-acting element）简称顺式

16、元件（cis element），有时也叫做顺式作用控制序列（cis acting control sequence）。系指与受其控制的效应基因，位于同一条染色体或DNA分子上的转录控制区的遗传元件。例如启动子中与转录因子蛋白质结合的序列元件，便叫做顺式作用元件，它可以影响该启动子控制的基因或同一条染色体（DNA）上另一个基因的表达活性。顺式作用元件除了常见的增强子、启动子以及操纵单元之外，还有能够对外界环境因素的作用作出反应的遗传元件，诸如光效应元件和脱落酸效应元件等；以及参与控制效应基因之时空特异性表达活性的遗传元件，包括组织特异性元件和发育阶段特异性元件等。3 顺式作用（cis actin

17、g）顺式元件通常是不编码蛋白质产物的，它们一般都是位于基因编码序列的两侧末端，或是间隔子序列的内部，并且只能对与其位于同一条染色体或DNA分子上的效应基因发生作用。我们称这种作用方式为顺式作用。4 顺式作用蛋白质（cis-acting protein）当然也有一些特殊的顺式元件（事实上是基因）能够编码蛋白质产物。此类蛋白质具独特的性质，只能够对其编码基因位于同一条DNA分子上的顺式元件发生作用。我们称这样的蛋白质为顺式作用蛋白质。（2）反式与反式作用因子 反式（in trans）在分子遗传学中所谓反式，是用来描述位于不同染色体或DNA分子上的两个基因或两个遗传标记之间，以及蛋白质因子与DNA分

18、子之间的状态或关系的一种术语。例如特异性的转录因子（蛋白质）与其结合的DNA元件而言，两者即为反式关系。2 反式作用因子（trans-acting factor）反式作用因子，亦称反式作用蛋白质或反式因子，系特指由反式作用基因（trans-acting gene）编码的、能够同特定的顺式元件结合，进而调节效应基因转录反应的扩散性分子（diffusible molecular）。这类蛋白质是顺式元件以外的，另一条染色体或DNA分子上的基因编码的。主要的包括激活蛋白质和阻遏蛋白质两大类。反式作用因子通过与顺式元件、RNA聚合酶以及通用转录因子等结合形成转录起始复合物，从而激活或抑制效应基因的转录活

19、性。3 反式作用（trans-acting）位于独立的另一条染色体或DNA分子上的遗传单元，诸如阻遏基因或转录因子编码基因，通过产生一种能够间隔距离地发生作用的扩散性物质（如转录因子、激活物或阻遏物等），而干扰或调节位于另一条染色体或DNA分子上的其他基因的表达活性。这样的作用方式，叫做反式作用。4. 转录与复制的比较 基因的转录与复制的过程，无论在生物化学还是酶学方面都是十分相似的。它们二者都是在各自特有的核酸酶，即RNA聚合酶和DNA聚合酶的催化下，合成出一条与DNA模板链互补的新的多核苷酸链。尽管如此，基因的转录（RNA合成）和基因的复制（DNA合成）之间，仍然存在着如下几个方面的差别：

20、（1）对引物需求有别在基因复制中，需要同时存在模板链和引物，DNA聚合酶才能启动DNA新链的合成。而基因的转录则不同，它不需要引物，RNA聚合酶便能启动RNA新链的合成。（2）使用的底物不一样由于DNA和RNA分子的核苷酸组成成分不同，因此基因复制与转录所用的底物也不一样：前者是用脱氧核糖核苷三磷酸：dATP、dGTP、dTTP、dCTP； 后者是用核糖核苷三磷酸：ATP、GTP、TTP和CTP。（3）与模板的结合状态有异基因的复制是按照半保留方式进行的，在新生成的两条子代DNA分子中，新生链和模板链始终是结合在一起的。而基因的转录则不同，新合成的RNA链最终是要从模板上解离下来的。（4）精确

21、性程度差异悬殊在基因的转录过程中，错误参入RNA链的核苷酸频率是104也就是说每参入10，000个核苷酸，就会出现一个错误（万分之一错误率）。而在基因的复制过程中，核苷酸错误参入频率是107，也就是说每参入10，000，000个核苷酸，仅出现一次错误（千万分之一错误率）。这也就是说DNA复制的精确度是超过转录的1000倍！（5）涉及范围不同基因复制往往是整个基因组从头至尾逐步进行，涉及范围包括整个基因组中的所有的DNA和基因。而基因转录则不同，它所涉及的范围要比复制小得多，通常是一个基因或一个操纵子。二、 RNA编辑对原核基因表达的调节作用1. RNA编辑（RNA editing）概述（1）R

22、NA编辑定义在有些基因的转录后加工过程中，会有大量的尿嘧啶核苷酸（Us）加入到前体mRNA（pre-mRNA）的核苷酸序列中去，或是从pre-mRNA的核苷酸序列中删除下来，甚至还会 发生核苷酸碱基的取代反应。如此碱基饰变的结果，使得RNA转录本的核苷酸序列与其对应的DNA链的核苷酸编码序列并不完全匹配。由此饰变的mRNA所转译的蛋白质多肽链的氨基酸序列结构，便与按照其基因的核苷酸序列推导出来的有所差别。这种在RNA转录本成熟、修饰过程中发生的核苷酸的加入、删除或取代的现象，叫做RNA编辑（RNA editing）。(2)RNA编辑的普遍性RNA编辑，首先在布鲁斯锥虫（Trypanosoma

23、brucei）线粒体之细胞色素氧化酶亚基编码基因（cox）转录过程中发现的。目前拥有资料显示，RNA编辑这种转录后加工形式，在生物界中是广泛存在的。诸如多头绒泡菌线粒体、高等植物叶绿体和线粒体，以及哺乳动物特定细胞核等编码基因的转录加工过程中，也相继发现了RNA编辑现象。但毫无疑问，RNA编辑主要是在细胞器基因组编码的原核基因所具有的、控制基因表达活性的一种特殊的调节机理。（3）RNA编辑的特点 与可变剪辑及反式剪辑不同，RNA编辑可以在基因转录之后使pre-mRNA分子的核苷酸序列发生碱基的加入、删除或取代等不同形式的变化，从而改变了基因原来携带的遗传信息的编码结构，表达出新型的蛋白质多肽链

24、。2. RNA编辑的分子机理（1）引导RNA参与的mRNA编辑模型 引导RNA（guide RNA,gRNA） 1990年，Larry Simposon及其同事在研究锥虫RNA编辑作用时发现，有一类分子长度为5080个核苷酸的小分子量的RNA分子，可以通过与pre-mRNA的杂交作用，指导RNA编辑，故特称为引导RNA。 引导RNA的分子结构a. 在gRNA5，-末端有一段锚定区。它以特殊的G-U碱基配对的方式，与pre-mRNA 编辑序列互补。因此，锚定区能够促使gRNA分子与pre-mRNA分子上的编辑区序列结合。b.在gRNA分子中间部位有一个编辑区。它负责确定在被编辑的pre-mRNA

25、分子的核苷酸序列中，插入尿嘧啶核苷酸的位置。c. 在gRNA的3，-末端，还有一段转录后加入的，由大约15个非编码的尿嘧啶核苷酸组成的poly（U）序列。其功能可能是把gRNA连接到pre-mRNA编辑区5，上游富含嘌呤碱基的核苷酸序列上。 gRNA参与的编辑模型（a）插入模型（图略）第一步，核酸内切酶在gRNA引导下，从将要插入U的位点切割pre-mRNA序列。第二步，在TUTase（末端尿苷酰转移酶）的催化作用下，将UTP提供的尿嘧啶核苷酸转移到pre-mRNA左侧片段的3，-末端。这个转移进来的U同gRNA分子中的A碱基配对。第三步，在RNA连接酶催化下，pre-mRNA分子切口两侧的5

26、，-P和3，-OH之间形成磷酸二酯键。从而从断裂的片段连连起来，最终使U碱基加入到编辑的RNA分子中去。 （b） 删除模型（图略去） 第一步，核酸内切酶在gRNA引导下，从将被删除的U残基的3，一侧，切割pre-mRNA序列。第二步，3，核酸外切酶从pre-mRNA左侧片段的3，末端，移去一个尿嘧啶核苷酸（UMP）。此时pre-mRNA分子中的N碱基同gre-mRNA分子上的N，碱基之间发生碱基配对。第三步，RNA连接酶催化pre-mRNA两个片段的5，-P和3，-OH之间形成磷酸二酯键。从而使两个片段连接起来，于是完成了从pre-mRNA分子中删除一个U碱基的编辑过程。（2）脱氨基作用引导的

27、RNA编辑模型 脱氨酶（deaminase） 能够从有关的氨基酸分子中移去氨基的一种酶。 脱氨基作用（deamination） 在脱氨酶的催化作用下，从DNA分子的胞嘧啶或腺嘌呤残基中，移走氨基（-NH2）的过程，叫做脱氨基作用。 胞嘧啶核苷酸脱氨基作用： -NH2胞嘧啶核苷酸- 尿嘧啶核苷酸 腺嘌呤核苷酸脱氨基作用：-NH2腺嘌呤核苷酸- 次黄嘌呤核苷酸3. RNA编辑的主要类型及其生物学意义（1）RNA编辑的主要类型： 尿嘧啶核苷酸加入或删除引起的RNA编辑；单核苷酸取代造成的RNA编辑； 胞嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸或腺嘌呤核苷酸加入导致的RNA编辑。（2）RNA编辑与基因表达的调节 移码

28、突变的校正 RNA编辑被认为是一种最奇特的基因表达的调节方式。例如基因移码突变的校正，便是生命有机体通过RNA编辑这种方式，实现对基因表达进行调节的一种典型事例。基因移码突变的分子本质是，在基因的编码序列中，插入或缺失了不等于3倍数的核苷酸碱基。此种突变破坏了基因的读码框结构，致使转译出失去功能活性的异常的蛋白质。RNA编辑由于能够通过插入核苷酸的途径校正基因的移码突变，故可使之恢复成为原来具有的野生型的读码框结构，从而重新呈现出正常的表达活性。由此可见，RNA编转所具有的校正移码突变的功能，为生命有机体应对不利突变，提供了一种有用的调节机理。 遗传信息的扩充 由于RNA编辑能够在pre-mR

29、NA分子中删除掉原有的起始密码子，或是在此密码子的5，-上游重新形成起始密码子；也能够在原有终止密码子5，-上游重新形成新的终止密码子。由这样编辑的mRNA所转译出来的蛋白质多肽链，无论在氨基酸序列结构还是生物学功能上，都是与按照基因的DNA核苷酸编码序列推导出来的蛋白质多肽链有所不同。因此，RNA编辑可以使基因携带的遗传信息得到有效的扩充，是生命有机体控制mRNA转译的一种特殊的调节方式。（3）RNA编辑与中心法则1 中心法则这是F.Crick于1958年提出的，描述DNA、RNA和蛋白质三者之间遗传信息传递的一般路线。根据这个法则，遗传信息的流向是：DNARNA蛋白质2 反转录的发现197

30、0年，H.M.Temin和D.Baltimore发现在特殊情况下，遗传信息可以从RNA反向传递到DNA，这是对中心法则的一个重要的补充。3 DNA、RNA和蛋白质三者的共线性关系转录后加工的mRNA分子核苷酸序列，仅仅是相应于DNA分子的核苷酸编码序列，并根据其密码子顺序依次转译成蛋白质多肽链的氨基酸顺序。所以说DNA、RNA和蛋白质多肽链三者之间，存在着共线性的关系。虽然说，后来发现的断裂基因的pre-mRNA的可变剪辑，可使同一种基因在生命有机体的不同发育阶段和不同组织类型的细胞中，表达出一组彼此相关的不同的蛋白质异形体。但在这个过程中基因的实际编码序列并没有发生量的改变，它仍然严格遵循中

31、心法则。4 RNA编辑与基因编码信息的改变发生在转录后的RNA编辑，使得基因的遗传信息在mRNA水平上发生了量的变化。因此，我们无法根据中心法则，通过基因测序所得的核苷酸序列结构，来推导其蛋白质的氨基酸顺序。因此说，RNA编辑是继1970年发现mRNA反转录现象之后，对中心法则又一个重要的补充。与其他类型的转录后加工相比，RNA编辑显然具有重要的生物学意义。共线性（Colinearity）的概念- 在分子生物学和分子遗传学中，所谓共线性包括如下4种不同的情况：其一是指位于同一条染色体DNA分子或是同一条DNA分子上，不同基因的位置排列关系。这种情况有时特称为同线性（Synteny）。其二是指不同物种的相关染色体DNA分子之间，基因排列顺序的一致性。其三是指位于DNA分子与其转录本RNA分子之间，核苷酸碱基排列顺序的一致性。其四是指位于DNA分子或mRNA分子上遗传密码子的排列顺序，与相应的蛋白质多肽链上氨基酸排列顺序之间的一致性。同线性（Synteny）的概念-位于同一条染色体分子或是同一条DNA分子上不同基因的排列关系，叫做同线性