载体构建流程.docx

1、载体构建流程一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染

2、的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA表达载体

3、中，是由RNA聚合酶启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3端形成14个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达21ntRNA和50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于

4、RNA聚合酶启动子和45T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有14 个U 3 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体（筛选）。二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细

5、胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 大致的实验流程： 1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存） 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞1，进行病毒包装和生产，收集病毒液； 4. 浓缩、纯化病毒液； 5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)； 6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和W

6、estern 分析实验结果； 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 三、重组质粒构建流程 1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增) 2.回收 A 酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。 B PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试

7、剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。 实验仪器：1、琼脂糖凝胶电泳系统2、紫外观察分析仪3、离心机4、单面刀片5、恒温水浴锅试剂 ：1、DNA回收试剂盒2 2、50TAE3（电泳缓冲液Tris-乙酸）3、ddH2O4、琼脂糖凝胶4步骤：1）使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳（分离DNA作用）5。2）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖。放入1.5ml离心管中。3）按每10

8、0mg琼脂糖加入300600l 溶胶液6的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。4）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体。再将吸附柱放入同一个收集管中。5）在吸附柱中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。6）再在吸附柱中加入500uI漂洗液， 12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。7） 12000rpm 室温空离心1分钟。8）将吸附柱放入一个干净的1.

9、5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20。9）琼脂糖凝胶电泳（鉴定作用）检测回收产物。 注意事项：1）切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛；2）溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。3）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。4） 把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率3连接器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式

10、恒温气浴。 试剂：T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 。操作步骤 ：PCR产物（已纯化回收）与T载体直接连接： （1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在1416C。 （2） 取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）4ml 目的基因 ；1ml T载体 ；0.5ml T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）；1ml 连接酶缓冲液10 x buffer ；3.5 ml dd Water ，总量10ml 体系。 （3）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14C干式恒温仪（或14C水中）中保温过夜（12-16h）。 （4） 连接后的产

11、物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。 4. 转化原理：目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，经过连接后的片段与感受态细胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。 目的：连接上目的基

12、因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒。器材：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。试剂：1.LB固体和液体培养基7 2.含特定抗生素的LB固体培养基3.100mM CaCl2溶液。4.待转化质粒大肠杆菌感受态细胞制备步骤：1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB液体培养基 ，37振荡培养过夜（12h左右），直至对数生长期。2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37振荡培养23h，至OD600值达到0.5-0.6之间。3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。4

13、）4离心10min（4000r/min）5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞，立即冰浴30min7）4离心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞，200ul一份，4保存。 暂且不用的贮存于-70可保存半年。 取其中一份进行转化。质粒DNA的转化1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min2）离心管放到42水浴锅中保温90s（90s一定要精确，不要摇动试管）3）将试管迅速转移到冰浴，冷却1-2min4）每管加800u l LB液体培

14、养基，37培养1h5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在含有适当抗生素的LB固体培养基上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀，室温正置30min6）倒置平皿37，1216h，出现菌落为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的

15、冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。 5抽提质粒（碱裂解法提取质粒DNA)原理： 本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。1）用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA。两种DNA在强碱环境都会变性。2）当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值后，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA分子巨大，难以复性。3）通过离心，大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质沉淀（SDS的作用下）除去，而质粒DNA留在上清中。4）再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤

16、，可得到纯化的质粒DNA。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。试剂：1.溶液: 50mM(mmol/L)葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1MTris-HCl(pH 8.0）12

17、.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4。2.溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置（NaOH作用是使细胞裂解）。3.溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存备用。4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（p

18、H 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4保存备用。5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7. 5TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na22H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4保存备用。8溴化乙锭（EB）：10mg/ml 9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20。 10. 6loading buffer（上样缓冲液）：0.

19、25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。 11. 1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5g/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5TBE），即可上样。仪器：(1)塑料离心管架（30孔）；(2) 10、100、1000L微量加样器；(3) 1.5mL塑料离心管（又称EPPendorf离心管）；(4)低温高速离心机（20 000 rmi

20、n）一台；(5)无菌工作台(6)高压锅，(7)常用玻璃仪器及滴管等。 质粒提取步骤：1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。3.将细菌沉淀重悬于100l预冷的溶液（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，（且不至于沉淀）。4.加200l新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3mi

21、n，使细胞膜裂解（溶液为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。5.加入150l预冷的溶液（醋酸甲AcK），将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。6.加入450l的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4离心12000g 10min。没有用PDS沉淀干净的蛋白质置于下层7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4离心12000g15min。8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4离心8000g7min，弃上清，

22、将沉淀在室温下晾干。9.沉淀溶于20l TE（含RNase A 20g/ml），37水浴30min以降解RNA分子，-20保存备用。6重组质粒克隆的鉴定 1）通过PCR方法鉴定：以重组质粒为模板，PCR产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR扩增后电泳鉴定。 2）酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了7. 质粒DNA的含量及纯度鉴定实验材料：质粒DNA仪器：(1)稳压稳流电泳仪 (2) 可调微量移液器(3)水平电泳槽 （4）紫外分光光度计(5)紫外透射仪等试剂：（1）电泳缓冲液：Tris-硼酸（1TBE）pH8.0。（2）加样缓冲液（6）：0.25%溴酚蓝，40

23、%蔗糖（3) 溴化乙锭（EB）溶液：10mg/ml含量测定：紫外吸收法 溴化乙锭荧光强度法纯度鉴定：紫外吸收法和琼脂糖凝胶电泳测定DNA浓度的方法有两种：紫外光吸收法：核酸在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。溴化乙锭荧光强度法：当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时，会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度，因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。测定质粒DNA

24、纯度的方法琼脂糖凝胶电泳四、慢病毒包装流程4.1实验材料4.1.1、细胞株：293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM8(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。4.2.2、菌株：大肠杆菌菌株DH5。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。4.2.3、病毒载体系统组成a) pGC-LV重组载体（已制备好的）；b) pHelper 1.0；c) pHelper 2.0 DNA溶液的制备（见上面具体步骤）：质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA 的A260/A280在1.82.0之间。4.2.4、试剂 台盼兰、

25、胎牛血清FBS、DMSO、DMEM、胰酶、Lipofectamine 2000 4.2.5、仪器荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜、Plus-20离心超滤装置 4.2病毒包装细胞293T的培养4.2.1、活细胞计数（台盼蓝染色）用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/ml (一般稀释倍数为100倍)，在0.1ml的细胞悬液中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。4.2.2、细胞株的冻存1 取培养23天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成21062107/ml。2 在1 ml细胞冻存管中加入0.

26、5 ml细胞悬液，0.4 ml小牛血清和0.1 ml二甲基亚砜9(或甘油)，混匀后密封。置41小时，-202小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。4.2.3、细胞复苏1 从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。2 迅速放入盛有37水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。3 用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3 ml含10% FBS（胎牛血清）的DMEM培养基，置温箱培养。4 次日更换一次培养液后再继续培养。4.2.4、细胞传代1 弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。2 加入2 ml胰酶消化液

27、，消化1- 2 min直到细胞完全消化下来。3 加入含10%胎牛血清和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。4 混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。4.3 慢病毒包装细胞转染1) 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿，37 、5% CO2培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。2) 转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养

28、基。3) 向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20 g ，pHelper 1.0载体15g，pHelper 2.0载体10 g)，与相应体积的Opti-MEM10混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5分钟。4) 将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100l Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4 ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。5) 把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。6) 混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Li

29、pofectamine 2000稀释液的转染复合物。7) 将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37 , 5% CO2细胞培养箱中培养。8) 培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。9) 每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基25 ml，于37 、5% CO2 培养箱内继续培养48小时。4.4病毒的收获及浓缩1 收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。2 于4 ，4000 g 离心10 min，除去细胞碎片。3 以0.45 m滤

30、器过滤上清液于40 ml超速离心管中。4 把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。5 组合好后，做好平衡，放在转头上。6 在4000 g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。7 离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。8 将过滤杯倒扣在样品收集杯上。9 离心力不超过1000g,时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把离心杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。10 将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80 度长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。4.5 慢病毒滴度测定1) 孔稀释法

31、测定滴度1测定前一天，为测定滴度所需的细胞（英茂盛业公司用的293T细胞：贴壁生长）铺板，96孔板，每个孔加4104个细胞，体积为100 l。2根据病毒的预期滴度，准备710个无菌的Ep管。在每个管中加入90 l的无血清培养基。3取待测定的病毒原液10l加入到第一个管中，混匀后，取10 l加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。4选取所需的细胞孔，吸去90 l培养基，丢弃。加入90 l稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。524小时后，加入完全培养基100 l。小心操作，不要吹起细胞。64天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。说明：第一个Ep管中加入10ul病毒原液，记为1E+1l；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释,所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0l；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1l；依次类推 第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原