质粒载体的操作和cDNA文库的构建.docx

1、质粒载体的操作和cDNA文库的构建（一）细菌培养物的生长 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内

2、，其拷贝数持续递增。这样，像pBR类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素g/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适

3、当方法，以取得满意的结果。1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。3)一

4、些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提

5、)可以避免此问题。)目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。(三)质粒DNA的纯化 常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环

6、DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和( 每个碱基对大约结合个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级

7、沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。 质粒DNA的小量制备 （一）细菌的收获和裂解收获）将2ml含相应抗生素的加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30剧烈振摇下培养过夜。）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4。）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。碱裂解法）将细菌沉淀，所得重

8、悬于100l用冰预冷的溶液中，剧烈振荡。溶液50mmol/L葡萄糖25mmol/L TrisCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4。须确使细菌沉淀在溶液中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。）加200l新配制的溶液。溶液0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。）加150l用冰预冷的溶液 溶液

9、5mol/乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上分钟。）用微量离心机于412 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。）可做可不做：加等量酚：氯念， 振荡混匀， 用微量离心机于4 以12000g离心分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。）用倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合， 于室温放置分钟。）用微量离心机于4以12 00

10、0g离心分钟。）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。）用1ml70%乙醇于4洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。i.此法制备的高拷贝数质粒（如f3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物35g。ii如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1l DNA溶液加到另一含l水的微量离心管内，加1l 10限制酶缓冲液和单位所需限制酶， 在适宜温育1

11、2小时。将剩余的DNA贮存于20。iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：煮沸裂解）将细菌沉淀，所得重悬于350lSTET中。STET0.1mol/L NaCL10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)5% Triton X-100）加25l新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。）在

12、上清中加入40l 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420l异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。）用微量离心机于4以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。）加1ml 70乙醇，于4以12 000g离心分钟。10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直

13、至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（25）分钟。11）用50l含无DNA酶的胰RNA酶（20g/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20。注：当从表达内切核酸酶的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶，以后在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。 在上述方案的步骤）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。（二）质粒小量制备的问题与对策 裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：）有些工作

14、者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。质粒的大量制备（一）在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物25mg质粒DNA，而且重

15、复性也很好。）将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（DNA 600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。）将含相应抗生素的500ml 或Terrific肉汤培养基（预加温至37）施放入25ml对数晚期的培养物，于37剧烈振摇培养25小时（摇床转速300转/分），所得培养物的OD 600值约为0.4。）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170g/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒（如pUC质粒）可复制达到很高的拷贝

16、数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。）于37剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。（二）细菌的收获和裂解收获）用合适转头于4以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.

17、0)）按步骤）所述方法离心，以收集细菌细胞。，碱裂解法）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物 来自收获细菌的步骤3 重悬于10ml（18ml）溶液中。溶液50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于。）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。）加20ml(40ml)新配制的溶液。溶液0.2mol/L NaOH(临用前用10mo

18、l/L贮存液现用现稀释）1SDS盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液。溶液5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液对钾是mol/L，对乙酸根是5mol/L。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾SDS蛋白质膜复合物。）用合适转头于4以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将

19、上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液与细菌裂解物混合不充分步骤）。）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4离心，盐也会了生沉淀。）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。10）纯化。四、质粒的纯化（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒）将核酸溶液所得

20、转入15mlorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏， 回收沉淀的核酸。）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。）用500l含无DNA酶的胰RN

21、A酶(20g/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。）加500l含13（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于以12000g离心分钟，以回收质粒。）吸出上清，用400l TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽次。）将水相转到另一微量离心管中，加100l 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒。）吸去上清，加200l处于4以12 000g离心2分钟。）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直

22、到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10）用500l TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释用TE（pH8.0) 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD26050g质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于20。l重组质粒的连接、转化及筛选 编辑本段 回目录质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的

23、载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如互补现象等来鉴别重组子和非重组子。外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也

24、可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。 由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. col

25、i受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 3、带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶的klenow大片段部分填平3凹端,

26、使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与-互补现象筛选相结合的方法。 因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架

27、,不影响其正常功能。E. coli DH5菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。由-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去-

28、互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，-互补产生的Lac+细菌由于含-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去-互补能力，因而不产生-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为-互补现象筛选。 材料、设备及试剂 一、 材料 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5,或JM系列等具有-互

29、补能力的菌株。 二、 设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台， 微量移液枪，eppendorf管。 三、 试剂1、连接反应缓冲液(10)：0.5mol/L TrisCl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500g/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L ATP（过滤灭菌）。 2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液

30、, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20。4、IPTG储液(200mg/ml): 在800l蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22m滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20。 5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇匀后涂板。 6、含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50g/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal储液和4lIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37下放置

31、3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。7、感受态细胞制备试剂。 8、煮沸法快速分离质粒试剂。9、质粒酶及电泳试剂。 操作步骤 一、 连接反应 1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号。 2、将0.1g载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。 3、加蒸馏水至体积为8l,于45保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0。4、加入10T4 DNA ligase buffer 1l, T4 DNA ligase 0.5l, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16保温8-24小时。 同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。二、 E. coli DH5感受态细胞的制备及转化