抗氧化功能评价方法doc.docx

1、抗氧化功能评价方法doc附件1：抗氧化功能评价方法试验项目、试验原则及结果判定Items, Principles and Result Assessment1 试验项目1.1 动物实验1.1.1 体重1.1.2 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）1.1.3 蛋白质氧化产物：蛋白质羰基1.1.4 抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶1.1.5 抗氧化物质：还原性谷胱甘肽1.2 人体试食试验1.2.1 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）1.2.2 超氧化物歧化酶1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶2 试验原则2.

2、1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3 结果判定3.1 动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。3.2 人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该

3、受试样品具有抗氧化功能的作用。抗氧化功能检验方法Method for the Assessment of Antioxidative Function1 动物实验1.1 实验动物选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，小鼠每组1015只，大鼠812只。1.2 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.3 实验方法1.3.1 老龄动物选用10月龄以上大鼠或8月

4、龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.2 D半乳糖氧化损伤模型1.3.2.1原理D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。1.3.2.2造模方法选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg1.2g/kg BW颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。

5、随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.3 乙醇氧化损伤模型1.3.3.1原理乙醇大量摄入，激活氧分子产生自由基，导致组织细胞过氧化效应及体内还原性谷胱甘肽的耗竭。1.3.3.2造模方法选2530g健康成年小鼠（180220g大鼠），随机分为4个组，1个模型对照组和3个受试样品剂量组，必要时可增设1个空白对照组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，模型对

6、照组给予同体积溶剂，连续灌胃30天，末次灌胃后，模型组对照组和3个剂量组禁食16小时（过夜），然后1次性灌胃给予50%乙醇12ml/kgBW，6小时后取材（空白对照组不作处理，不禁食取材），测血清或肝组织脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.4脂质氧化产物测定1.3.4.1 血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量可采用荧光法和比色法测定，方法任选其一。1.3.4.1.1 荧光法1.3.4.1.1.1 荧光法原理MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧

7、化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。以波长536nm为激发光，在550nm有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。1.3.4.1.1.2 仪器与试剂仪器：荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管试剂： 10mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶4保存12个月），临用前用纯水稀释成1nmol/mL29mmol/L硫代巴比妥酸工作液 硫代巴比妥酸 0.209g EDTA.2H20 25mg 谷胱甘肽（还原型） 1mg用0.02mol/L NaOH 50 mL 溶解（微温助溶，棕色瓶4保存2周）酸水解液

8、0.1mol/L H2SO4 125mL0.1mol/L Na2SO4 125mL加水150mL用 H2SO4 调pH 1.5，加水稀释至500mL正丁醇以上所用玻璃器皿均需经50硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂（选AR级）最好用双蒸水配制。1.3.4.1.1.3 实验步骤1.3.4.1.1.3.1 样品制备全血上清液：取血50l加入0.5mL生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。血清样品：取血0.5mL室温静置10min，2000r/min离心10min，取上清液待测。1.3.4.1.1.3.2 标准曲线制作 将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀

9、释成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分别取0.1mL加入酸水解液 2mL、TBA工作液0.5mL混匀，避光、沸水浴60min流水冷却至室温3mL正丁醇振荡抽提1min3000r/min离心5min取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm， 激发波长536nm，发射波长550nm）以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。1.3.4.1.1.3.3样品测定 试剂空白管样本管标准管10mL具塞离心管0.1mL蒸馏水0.1mL血清*0.1mL标准酸水解液2mL2mL2mLTBA工作液0.5mL0.5mL0.5mL混匀，避光沸水

10、浴60min，流水冷却正丁醇3mL3mL3mL振荡抽提1min，3000r/min 离心5min*全血上清液 0.5mL（空白管加蒸馏水0.5mL，标准管加标准0.1mL、蒸馏水0.4mL）1nmol/mL四乙氧基丙烷（标准）血清0.1mL（或全血上清液0.5mL）加入酸水解液 2mL、TBA工作液0.5mL混匀，避光、沸水浴60min流水冷却至室温3mL正丁醇振荡抽提1min3000r/min离心5min取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm， 激发波长536nm，发射波长550nm）1.3.4.1.1.3.4 计算公式： B-A B-A过氧化脂质含量（nmol/

11、mL血清）CK =11 F-A F-A B-A B-A 1过氧化脂质含量（nmol/mL血液）CK =1 F-A F-A 0.05A：空白管荧光度B：样品荧光度F：四乙氧基丙烷荧光度C：四乙氧基丙烷浓度（1nmol/mL）K：稀释倍数1.3.4.1.2比色法1.3.4.1.2.1比色法原理MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。1.3.4.1.2.2 仪器与试剂仪器：可见光分光光

12、度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。试剂：0.2M乙酸盐缓冲液 pH3.50.2M乙酸溶液 185mL0.2M乙酸钠溶液 15mL1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸钠SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸盐缓冲液 pH7.40.2M磷酸氢二钠 1920mL0.2M 磷酸二氢钾 480mL1.3.4.1.2.3 实验步骤1.3.4.1.2.3.1 样品制备溶血液样品：取血20L加入0.98mL蒸馏水制成2溶血液。1.3.4.1.2.3.2样品测定试剂空白管样品管标准管2溶血液*0.2m

13、L40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸盐缓冲液 1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.6mL0.6mL混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。*若用血清，样品管0.15mL，标准管0.15mL。1.3.4.1.2.3.3计算 B A B A 过氧化脂质含量（nmol/mL2%溶血液）CK = 401 F A F A B A B A 过氧化脂质含量（nmol/mL血清）CK = 401 F A F AA: 空白管吸光度B：样品

14、吸光度F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）K：稀释倍数1.3.4.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定1.3.4.2.1 原理 见1.3.4.1.2.11.3.4.2.2 仪器与试剂仪器：可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器试剂：见1.3.4.1.2.21.3.4.2.3 实验步骤1.3.4.2.3.1 样品制备组织匀浆样品：取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入0.2M磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10组织匀浆（W/V

15、），3000r/min离心510min，取上清液待测。1.3.4.2.3.2样品测定试剂空白管样品管标准管10组织匀浆0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸盐缓冲液 1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.7mL0.7mL混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行1.3.4.2.3.3计算 B - A B- A 1过氧化脂质含量 CK = 40 （nmol/mg组织） F - A F - A 0.210%1000A: 空白

16、管吸光度B：样品管吸光度F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）K：稀释倍数1.3.4.3 血清中8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）测定1.3.4.3.1原理8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）是体内脂质氧化应激反应稳定而具有特异性的标志物，其含量能间接反应因机体内自由基的产生而导致组织细胞的脂质过氧化程度。1.3.4.3.2仪器与试剂 仪器：酶标仪、生化培养箱、微量振荡器、微量加样器、洗板机 试剂：8-Isoprostane KIA Kit (酶联免疫试剂盒) 8-Isoprostane EIA 抗体血清、8-Isoprostane

17、AChE示踪物、8-Isoprostane EIA标准品、EIA缓冲液、洗涤缓冲液、吐温20、鼠抗-兔IgG抗体、EIA示踪染色剂、EIA抗体血清染色剂、Ellmans试剂1.3.4.3.3实验步骤1.3.4.3.3.1样品制备小鼠眼内眦静脉丛取血，3000r/min离心10min。取上清液，用EIA 缓冲液稀释15倍备用。1.3.4.3.3.2样品测定按试剂盒说明操作。8-表氢氧异前列腺素标准孔浓度分别为：500 pg/mL、200 pg/mL、80 pg/mL、32 pg/mL、12.8 pg/mL、5.1 pg/mL、2.0 pg/mL、0.8pg/mL步骤试剂空白TANSBB0标准/样

18、品1.加试剂EIA 缓冲液-100L50L-标准/样品-50LAChE示踪物-50L50L50L抗体血清-50L50L2.培养用封板膜盖好酶标板，并在4避光条件下培养18小时3.清洗清洗所有反应孔五次4.加试剂AChE示踪物-5L-Ellmans200L200L200L200L200L5.培养用封板膜盖好酶标板，并在常温避光条件下培养45-90分钟6.读数在波长412nm处测量各孔吸光度（B0在 0.3-1.0 A.U范围） 标准或样品孔吸光度 NSB孔吸光度 %B/B0= 100 B0孔吸光度 NSB孔吸光度以标准物的浓度的对数（log）为横坐标，%B/B0为纵坐标绘制标准曲线，亦可将数据转

19、换成logit(B/B0)或lnB/B0/(1-B/B0)做为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。将样品的%B/B0值，代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中的8-表氢氧异前列腺素浓度。1.3.5蛋白质氧化产物测定H2O2或O2自由基对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。羟自由基也可直接作用于肽链，使肽链断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰基。羰基化蛋白极易相互交联、聚集为大分子从而降低或失去原有蛋白质的功能，蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质损伤的程度。蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，它随着年龄的增长而增加。 1.3.5.1血清中蛋

20、白质羰基测定1.3.5.1.1原理被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，2，4二硝基苯腙为红棕色的沉淀，将沉淀用盐酸胍溶解后即可在分光光度计上读取370 nm下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。1.3.5.1.2仪器与试剂仪器：紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。 试剂：10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼(DNPH) 99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml 2 mol/L HCL 溶解，4避光保存。 2 mol/L HCL 200 g/L 三氯乙酸（TCA） 6 mol/L 盐酸胍

21、 无水乙醇乙酸乙酯混合应用液 将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1：1的比例配置成混合溶液，现用现配。1.3.5.1.3操作步骤试剂测定管对照管血清（血浆）0.1ml0.1ml10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼0.4ml2 mol/L HCL0.4ml涡旋混匀1分钟，37准确避光反应30分钟200 g/L 三氯乙酸0.5ml0.5ml涡旋混匀1分钟，以4下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.0ml1.0ml涡旋混匀1分钟，以4下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.0ml1.0ml涡旋混匀1分钟，以4

22、下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.0ml1.0ml涡旋混匀1分钟，以4下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.0ml1.0ml涡旋混匀1分钟，以4下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀6 mol/L 盐酸胍1.25ml1.25ml混匀后，37准确水浴15分钟涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处比色，6 mol/L 盐酸胍试剂调零，测定OD值。用双缩脲法测定血清（或血浆）蛋白质含量。注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.

23、5.1.4计算公式 测定管OD-对照管OD蛋白质羰基含量 = 125105（nmol/mgprot） 22比色光径（cm）样本蛋白浓度（mg/L）1.3.5.2组织中蛋白质羰基测定1.3.5.2.1原理见1.3.5.1.11.3.5.2.2 仪器与试剂仪器：紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、天平、匀浆器、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。 试剂： 10 mmol/L HEPES缓冲液 pH7.42.38克N-2-羟乙基哌嗪-2-乙磺酸（HEPES）溶入1000ml双蒸馏水，用lN NaOH 调pH至7.4，4保存。 100 g/L 硫酸链霉素 1g硫酸链霉素，溶入

24、10ml双蒸馏水，4避光保存。10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼(DNPH) 99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml 2 mol/L HCL 溶解，4避光保存。 2 mol/L HCL 200 g/L 三氯乙酸（TCA） 6 mol/L 盐酸胍 无水乙醇乙酸乙酯混合应用液 将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1：1的比例配置成混合溶液，现用现配。1.3.5.2.3 实验步骤1.3.5.2.3.1样品处理取0.1g组织，在冰的生理盐水中漂洗，以去掉表面的血迹。加人0.9ml的冰的10 mmol/L HEPES缓冲液(pH7.4)，制成10 的匀浆。将匀浆液以3000r/min的转速，离心10 min

25、，保留上清。取100gL的硫酸链霉素溶液50l，加入上清液450l（v/v,1:9），室温放置10 min后，以11000r/min的转速，离心10 min，取上清液待测。1.3.5.2.3.2操作步骤试剂测定管对照管组织匀浆上清液0.1ml0.1ml10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼0.4ml2 mol/L HCL0.4ml涡旋混匀1分钟，37准确避光反应30分钟200 g/L 三氯乙酸0.5ml0.5ml涡旋混匀1分钟，以4下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.0ml1.0ml涡旋混匀1分钟，以4下，以12000r/min离心10min，

26、弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.0ml1.0ml涡旋混匀1分钟，以4下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.0ml1.0ml涡旋混匀1分钟，以4下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.0ml1.0ml涡旋混匀1分钟，以4下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀6 mol/L 盐酸胍1.25ml1.25ml混匀后，37准确水浴15分钟涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处比色，6 mol/L 盐酸胍试剂调零，测定OD值。用双缩脲法

27、测定匀浆上清液蛋白质含量。注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。1.3.5.2.3.3计算公式 测定管OD-对照管OD蛋白质羰基含量 = 125105（nmol/mgprot） 22比色光径（cm）样本蛋白浓度（mg/L）1.3.5.3 注意事项1.3.5.3.1 加入硫酸链霉素：在匀浆上清液中加人硫酸链霉素溶液的作用是沉淀核酸。核酸中的一些碱基如鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基，如不去除核酸，这些碱基就会与DNPH结合，并反应生成有色物质，这些物质会增加最后溶液的吸光度，使结果偏大 。1.3.5.3.2 DHPH的溶解：DNPH不溶于水，只能溶于稀酸和稀碱等溶液，因此，用2

28、molL HC1来溶解DNPH。设对照管是为了避免HC1与反应液中一些物质反应生成对比色有影响的物质。1.3.5.3.3 反应体系应避光：当蛋白质溶液中加人DNPH进行反应时，反应体系需置于黑暗中，因为DNPH不稳定，见光会分解。如果反应体系遇到光，DNPH分解，体系中会有剩余的没有变成蛋白质腙衍生物，对反应比色有影响。1.3.5.3.4 去除未与蛋白质结合的DNPH：由于DNPH在370nm左右有强烈的光吸收，因而用乙醇和乙酸乙脂混合物反复洗涤沉淀，去掉未与蛋白质结合的DNPH，否则，会增加吸光值。1.3.6 抗氧化酶活力测定SOD催化超氧阴离子自由基（O2）生成H2O2，再由其它抗氧化酶如

29、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除O2对细胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化，酶活性与生物年龄的增长成反比。消除自由基的能力与酶活性成正比。1.3.6.1 血或组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定1.3.6.1.1 原理O2氧化羟胺的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O2后形成的亚硝酸盐减少。1.3.6.1.2仪器与试剂仪器 可见光分光光度计、酶标仪、离心机、恒温水浴、匀浆器试剂 65mM磷酸盐缓冲液（PBS） pH7.810mmol/L盐酸羟胺 盐酸羟胺6.95mg，加PBS至10mL7.5mmol/L黄嘌呤 黄嘌呤11.41mg，加0.1M NaOH 2.5mL溶解，加PBS至10mL0.2g/L黄嘌呤氧化酶