动物细胞工程的应用及展望.docx

1、动物细胞工程的应用及展望动物细胞工程的应用及展望学院：生命科学学院班级：20110922姓名：学号：1.什么是动物细胞工程单就“ 细胞工程” 这个名词而言, 日本有称为“ 细胞工学” 的期刊。英文译名为Cell Technology,但Cell Technology 这一名词的含意可以甚广, 不一定能体现它是属于生物工程的范畴。如果套用遗传工程的说法, 细胞工程似应译为cellular Engineering , 这名词虽曾用过, 但原意是指用细胞移植的方法来取代休内机能缺损的细胞, 是否会引起误解, 另一种译法可为Cell Biotechnology , 也许更能表达它的本意。那什么是动物细

2、胞工程呢？动物细胞工程是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的原理方法与技术，按照人们的需要，在细胞水平上进行遗传操作，包括细胞融合、核质移植等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。动物细胞工程所涉及的主要技术是细胞融合, 细胞拆合、染色体导入和基因转移这四个方面, 也就是说它是从细胞水平、核质水平、染色休水平以及基因水平这四个不同层次来改造细胞。那我们就以这四个方面来叙述动物细胞工程的应用与展望。2.动物细胞工程技术2.1.细胞融合技术2.1.1.细胞融合的定义细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下, 两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互

3、接触, 从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合( cell fusion)或细胞杂交( cell hybridization)2.1.2.细胞融合常用的技术1.仙台病毒HVJ诱导法1962年日本的冈田善雄偶然发现了由日本血凝性病毒HVJ或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象+ 冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础, 细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重视。2.聚乙二醇（PEG）法1974 年华裔加拿大籍科学家高国楠（kao）发现peg 可促进不同科属的植物原生质体之间的融合. 后来人们又发现其他诱导方法的效果都不如peg，如磷酸盐。197

4、5年以后，利用peg诱导细胞融合逐渐发展成为一种规范的重要化学融合方法。3.电融合法自1978年Zimmermann等及1979年senda等报道电脉冲诱导细胞融合成功以来Zimmermann 及其同事们做了大量的工作,创立了物理的、实用的Zimmermann电融合法4.激光诱导法合激光诱导法1984 年, Schierenberg 首次报道利用微束激光成功地进行了细胞融合实验, 为细胞融合找到了另一种有效的方法。2.1.3.细胞融合技术的最新进展1.基于微流控芯片的细胞融合技术随着微机电系统mems技术和微加工技术的发展，微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟，加之微通道网络可以整合到生物芯片之

5、上，这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台，利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞.目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术研究的重点领域。优点：基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控，比如转移、定位、变形等，也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞，细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现.缺点：由于在微通道内的腔体容积很小，所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高.2.高通量细胞融合芯片高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在微米范围内（040um）产生的高强度、高梯度辐射电场，使得细胞在特殊辐射电场

6、的作用下产生介电质电泳力，精确处理和刺激预定的目标细胞，从而使目标细胞按照预先设计的方向（可以是任何预先设计好的方向）以预定的速度（可以是不同种的细胞以不同的速度定向）移动，从而按照设计要求准确地、大批量地得到目标细胞配型，集成微电极阵列的微流控系统，可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移.由于在微通道内微电极间距可以做得很小，因此获得同样强度的辐射电场强度只需施加较低电压的交变电场和脉冲即可，不用加载昂贵的高电压发生装置例如, 在20um 的电极对间距施加14 V的脉冲就相应地可以获得7 kV/cm 的高强度场强, 这足以形成细胞融合所需要的电场强度。高通量细胞融合芯片可以与化学诱导融合

7、、电诱导融合等方法相互结合，比如：在细胞融合缓冲液中加入少量的peg可大大提高细胞的融合率.此外，二价阳离子以及蛋白酶对细胞进行预处理，融合率也可大幅提高$ 然而，截至目前各国与此相关的细胞融合实验工作只有几篇文章见诸报端，许多构想也只是在理论层次上的探讨$3.空间细胞融合技术由于地球引力的存在，有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大，异源细胞间的融合得率十分有限. 在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中，由于无法排除地球引力的影响，要提高淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难世纪9 年代以来，人们在空间材料科学的启发下，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术.大量的飞行实验结果表明，

8、在微重力条件下酵母细胞的融合得率有很大的增加，融合得率增加主要是由于降低了重力沉降影响，而杂种细胞的活力增加可能是由细胞排列时间缩短引起的.在取得这些成功实验的基础上，进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能性已经具备.4.离子束细胞融合技术雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体，20世纪80年代中期，中国科学院等离子体物理研究所的余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在，建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系. 在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变. 据此原理，发展了离子束诱导细胞融

9、合技术。此项研究一旦成功，将改变传统的一对一细胞融合的弊端，减少供体细胞导入的染色体范围，使融合更具目的性，大大减少筛选的工作量，将是细胞融合研究的一大进步.5.非对称细胞融合技术非对称细胞融合技术，是利用某种外界因素- 常为：射线，辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核，并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G处理在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体，选择性地使其细胞质失活.然后融合来自这2个原生质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合，或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状。

10、2.2.单克隆抗体技术2.2.1.单克隆抗体原理单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的与单一抗原决定簇结合的抗体。2.2.2.单克隆抗体的应用（一）用作诊断试剂检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。鉴定病原体，准确诊断传染病。用于肿瘤的诊断和分型。激素类单抗用于测定体内激素含量，判断内分泌的功能状态。 （二）用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定簇分子的功能（三）用于疾病的治疗抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗肿瘤单抗用

11、于肿瘤的导向治疗2.2.3.单克隆抗体的最新进展1.嵌合抗体原理：应用基因重组技术，将鼠源性的可变区（，）与人抗体基因的恒定区（，）重组后导入骨髓瘤细胞中表达，分离纯化相应的抗体蛋白。年首次应用上述方法重组制备了抗半抗原磷酸胆碱的全分子人鼠嵌合抗体。目前，嵌合抗体主要有三种应用形式：嵌合、嵌合和嵌合（），但这种抗体仍保留了30%的鼠源性，可诱发人抗鼠反应。2.人源化抗体人源化改造主要是重构抗体和表面重塑抗体。重构抗体分为互补决定区( complementaritydetermining region，CDR) 移植抗体和特异性决定残基( specificity-deter mining res

12、idue，SDR) 移植抗体。原理：重构抗体是将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换3.噬菌体抗体库技术基本原理是用基因工程技术克隆人抗体可变区的全套基因，然后将克隆的基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中，建立噬菌体抗体文库，从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。它是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术，它是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技

13、术。优点： 该技术实现了基因型和表型的转换。获得一个具有上亿个体外方式制得的不同抗体的基因数据库，使从真实的抗原中迅速分离高度相似的同族抗体成为可能。得到的抗体可用于制备完全人源化抗体。缺点：从非免疫抗体库获得的抗体亲和力不高; 免疫抗体库的库容量不足，难以涵盖一些动物抗体的多样性;在淘选过程中会出现高亲和力低拷贝的特异性噬菌体抗体的丢失等。4.核糖体展示技术核糖体展示技术是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的技术。原理：利用聚合酶链反应扩增含目的基因的cDNA 文库，同时引入启动子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/翻译耦联系统作用下，形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物，构成核糖体展示的

14、抗体库，再用相应的抗原对翻译混合物进行筛选并从中分离mRNA，通过反转录-聚合酶链反应富集目的基因，并将目的基因导入表达载体，从而获得抗体。优点：人源基因工程抗体库库容量大、特异性强、亲和力高。5.RNA-多肽融合技术（mRNA 展示技术，体外病毒技术）1997 年Roberts 和Szostak与Nemoto分别独立设计了这种与核糖体展示类似的方法 原理：当mRNA 在体外翻译时，核糖体到达mRNA 和DNA 的结合点并稳定下来，嘌呤霉素进入核糖体的氨酰化位点，并在氨酰转移酶的作用下与所编码的多肽偶联，那么，mRNA-DNA-嘌呤霉素分子文库可在体外翻译，然后将蛋白纯化出来，这个复合体可通过

15、RT-RCR 得到进一步的扩增。6.转基因小鼠制备全人抗体原理：转基因小鼠制备全人抗体转基因小鼠的Ig 基因是用人的相应基因替代，产生对人免疫系统非异种抗体，这种是通过改造小鼠的体液免疫系统，将人Ig 基因微位点转入小鼠，产生能分泌人Ig 的转基因小鼠。优点：省去对抗体分子重构时在基因水平的复杂性，保留了完整的Ig 类别转换和亲和力成熟的自然机理。缺点：基因片段较小，仅30 kb 左右，这种抗体在面对抗原多样性时，其抗体应答显得单薄而不足。2.2.4.单克隆抗体技术的展望自1975 年K hler 等发明的杂交瘤技术问世以来，开创了抗体技术的新时代细胞工程抗体。单抗具有高度均一、生物活性单一和

16、与抗原结合的特异性强等优点。经过30 多年的深入研究，从最初的鼠源单抗过渡至人源化单抗，直到现在的全人单抗，改进了一种又一种的缺陷，为治疗性抗体的应用带来了一次又一次的希望。目前，如何提高抗体的生产效率，同时保持其优良特性，且能同时解决免疫原性这一问题，是该领域的热点和难点，相信随着对抗体效应机制及抗体免疫调节机制研究的不断深入以及分子生物学技术的发展，尤其是鼠抗体人源化技术、抗体库技术、转基因技术的不断成熟，单抗药物在临床上的应用将会更广泛。2.3.核移植技术早在50 年代童第周教授就开始以鱼和两栖类为材料进行核移植试验得到了核质杂种近年来又做了经济鱼类的核质杂种如鲤鱼核和螂鱼质草鱼核和团头

17、鱼质的杂种鱼表现了两种鱼的特点2.3.1.核移植的原理核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制。分为胚胎细胞核移植，胚胎干细胞核移植，体细胞核移植。2.3.2.2核移植的最新进展细胞核移植技术是德国发育生物学家Spermann 1于1938 年为解决核质相互关系问题提出把分化的细胞导入去核的卵母细胞中并观察其胚胎发育情况的研究， 同年他还提出将任何时期的细胞核注入去核卵母细胞内然后通过观察其发育能力就可以确定该时期细胞核的发育潜能的设想。但由于当时核移植技术条件的限制，用分化的细胞未能获得成功。直到20 世纪50

18、年代，才有两栖类美洲豹蛙和非洲瓜蟾克隆的报道（Briggs 和King,1952）。随后Gurdon 等用蟾蜍、蝌蚪的肠上皮细胞和体外短期培养的完全分化的体细胞进行核移植分别获得成体蟾蜍和蝌蚪， 证实两栖类已分化细胞的基因组具有结构上的完整性和功能上的全能性。此后，人们转向哺乳动物细胞核移植研究。哺乳动物核移植研究的最初成果在1981 年取得，Illmensee 和Hoppe用鼠内细胞团细胞直接注入去核的合子后，培育出发育正常的3 只小鼠。但这一试验未能被重复出来；1983 年，McGrath 和Solth首次利用显微操作技术和细胞融合技术， 以单细胞期的小鼠胚胎作为供核细胞进行核移植，得到了

19、核移植后代，并建立了重复性很高的核移植操作程序； 1994 年，Collas 和Barrnes 将供核细胞通过卵母细胞内直接注射的方法构建了核移植重构胚胎，并得到了犊牛；这一时期许多研究者对胚胎干细胞和成年动物体细胞的核移植试验也做了大胆尝试，但进展不大。1997 年，在细胞核移植研究历史上发生了一件具有轰动效应的事件， 英国罗斯林研究所的研究人员首次利用成年母绵羊的乳房上皮细胞， 通过细胞核移植技术得到了体细胞克隆羊“Dolly”，“Dolly”的出生以事实向人们证明，完全分化的体细胞不仅可以被逆转， 而且完全可以发育成一个新的个体。从此以后，全世界掀起了体细胞克隆的热潮。1998 年Wak

20、ayama 等利用小鼠卵丘细胞进行体细胞核移植研究获得成功；1999 年Wells 等用牛颗粒细胞进行核移植也获得了成功。至2002 年，Keefer 等9人将91 枚重构胚移植到8 只受体山羊体内，50受孕，生出7 只小山羊，核移植效率明显比以前提高。迄今为止，全世界已有乳腺细胞、卵丘细胞和输卵管上皮细胞、颗粒细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、睾丸支持细胞、胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞等9 种体细胞克隆后代成功诞生。我国的细胞核移植技术研究开始于20 世纪60 年代。1963 年，著名试验胚胎学家童第周利用胚胎细胞克隆技术进行鱼类囊胚细胞核移植研究， 在70 年代获得属间和种间核移植鱼。上个世纪

21、九十年代起，国内学者开始进行哺乳动物克隆研究。1991 年，张涌等利用432 细胞的胚胎克隆了5 只山羊。2000 年，杨向中领导的科研小组，用一头17 岁高龄奶牛耳皮肤细胞进行体细胞核移植研究， 获得了6 头体细胞克隆牛。标志着中国已完全掌握了世界一流的体细胞克隆牛技术，从1997 年到现在短短几年的时间里，在体细胞核移植领域里，人们相继在牛、山羊、猪、猫和兔等多种动物上取得了成功。2.4.2.4基因转移2.4.1.简介基因转移泛指基因或DNA片段在不同生物个体之间的传递，包括横向和纵向两个方向。纵向传递即通过繁殖进行的亲代和子代的基因传递，基因横向传递：水平基因转移（horizontal

22、gene transfer, HGT），又称侧向基因转移（lateral gene transfer, LGT），是指在差异生物个体之间，或单个细胞内部细胞器之间所进行的遗传物质的交流。2.4.2.进展近年来由于分子遗传学的迅速发展。目前已能得到一些真核细胞的克隆化基因, 如日株蛋白基因、T K 基因等, 把这些块因通过显微操作导入小鼠受精卵的原核中, 再植入假孕的子宫, 通过发育得到的个休不但能表达该从因决定的性状, 并能将该基因传给第二代。1 9 8 2年底美国一组科学家成功地将大鼠生长激素基因通过显微注射导入小鼠受精卵内得到了“ 超级小鼠” , 最近他们采用同样的方法将人的长激素基因也成

23、功地移植到小鼠并得到了表达。该项工作为基础研究及遗传育种开辟 一条新途径。基因转移技术可用以研究基因组织特异性表达和特异生长阶段表达的分子基础, 可以引起正常基因产物的过量生产; 相反, 也可以阻断一个基因的表达, 可以辨认基因, 查明该基因对哺乳动物发育是否必需。基因转移的直接意义在于通过改变或去除某一个基因, 研究蛋白质和基因间的关系, 利用转基因动物进行蛋白质、酶类、激素等的生产。随着基因整合表达和调节的深入研究, 外源基因转移技术必将给动物生产带来一场革命。2.5.细胞培养2.5.1.细胞培养的原理：细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适

24、温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。2.5.2.最新应用研究进展：随着细胞培养技术的不断发展和完善，20世纪50年代进入繁盛阶段，细胞培养逐渐被基础研究与应用领域所应用，特别是在医学领域得到迅速的发展。目前，细胞培养技术已经涉及到生物学、农业、环境保护等领域。1.在病毒学中的应用培养细胞为病毒的增殖提供了场所，细胞是分离病毒的基质，体外培养细胞无抗体及非特异颉颃物质的影响，而且对病毒的敏感性较体内细胞高，可采用离心感染法或提取病毒核酸进行感染，并以细胞打孔器协助感染扩大病毒感染的宿主范围，使病毒感染指标容易观察，光学

25、显微镜下就可见到包涵体、细胞融合等现象，同时也便于用分子病毒学技术进行检测。2.在肿瘤学中的应用肿瘤是机体在致癌因子的作用下，组织中的细胞失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。目前对于各种癌症还没有有效的药物来治疗，肿瘤研究的首要任务是明确致癌机制。细胞培养技术使研究人员能够清楚地认识正常细胞、癌前病变细胞、生命有限的肿瘤细胞以及完全转化或永生化的肿瘤细胞的生物学特征，这些逐级进化的细胞是体外研究多阶段致癌机制的基础。3.在药理学中的应用细胞培养在药理学中的应用比较广泛。通过培养细胞的生长曲线可计数细胞增长的绝对指数，从而可以直观地了解细胞生长与死亡的动态变化，一般用于检

26、测各种药物对细胞生长的影响。利用培养细胞的放射自显技术，研究细胞的物质代谢、动态变化和细胞周期等，对于药物作用机制的研究有重要作用4.在动物生产中的应用细胞培养作为细胞生物学乃至生物学研究的重要技术，在生物领域中占有重要地位。动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，发展至今已成生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法，目前这项技术也广泛应用于动物生产的研究。3.对动物细胞工程的展望从目前的研究进展来看动物细胞工程的前景是光明的值得提出的是它是建立在生物资源的可循环性L即节约能源又有利于保持自然条件然而对它也应有个清醒而正确的估价目前除少数产却如某些单抗以外大多数项目离表现明显的经济效益和社会效益还

27、有很长一段跪离其中涉及两个主要问题, 一是大量基础性的研究和开发卜作有待进亡了二是如何将实验室中的成果转为生产力这方面必须有工程技术人员的协同工作才能完成就前者而言在克隆化基因导入受精卵发育成新品种方面有单个基因分离从因的定位而不是随机的整合问题就卵细胞发生的细胞工程而言还有卵的休外成熟休外受精体外发育等问题在生产人的单抗方而还有休外致敏的问题因为对人不能像对小鼠那样去免疫以取得抗原特异的B 淋巴细胞在用病毒感染细胞以建成永久的细胞系方面还有如何保持其原有的分化机能的问题还有其它种种的问题总之动物细胞工程提出许多丛础研究课题需要大家努力去解决综上所述从细胞核质染色体以及从因这四个不同水平来改造

28、细胞为人类服务的细胞工程虽然目前尚在开始阶段肯定会在今后的几十年中作出巨大的贡献4.参考文献1 于生兰,储彬,徐加兵,欧阳臻. 单克隆抗体技术在中药研究中的应用J. 时珍国医国药,2013,08:2049-2050.2叶敏. 动物细胞工程的现状和展望J. 细胞生物学杂志,1984,04:185-188.3唐红,周平,张宾,王立民,郭延华,代蓉,管峰,石国庆. 动物细胞工程在动物生物技术中的应用J. 新疆农垦科技,2011,06:25-29.4 赵慧娟,臧学丽,谢蕙明,杨贺,刘诗音. 单克隆抗体的应用现状及前景J. 吉林农业,2013,02:59-60.5张淑雅,蒙钟经. 细胞工程概论J. 科技

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