分子生物学实验步骤总结超全.docx

1、分子生物学实验步骤总结超全分子生物学实验步骤总结超全 作者: 日期:一 目的基因的获得细菌基因组DNA的提取（1）仪器1）台式高速离心机2）恒温水浴箱3）枪式移液器4）灭菌的EP管和Tip头（2）试剂1）溶液1: 25% 蔗糖 50moL Trs-Hcl,H8. 50mmol/ ETA,H8 50ugml 溶菌酶(现用现配） 10ug/ml RNae）溶液:00ml/L Trs-Hcl,p8. 1% SDS 00ugml 蛋白酶K3）酚:氯仿:异戊醇（25:2:1)4）氯仿:异戊醇（24：）5）3mo/L Na(pH5.2)6）异丙醇或无水乙醇7）70乙醇) T缓冲液：10mmol/ ris-

2、Hl，pH. 1mmol/L EDT，pH0(3)实验步骤1） 5L细菌过夜培养,5000m离心10分钟，去上清液。2）将菌体细胞悬于250uL溶液中，3C水浴保温过夜。3）加250溶液，55C水浴保温4小时。4）加0.9倍体积的酚氯仿异戊醇(25:24：1)，轻轻混匀，于100rpm离心0分钟，转移水相至新的p管，重复步骤4一次。5）向转移的水相中加入0,倍体积的氯仿/异戊醇（2:1)，轻轻混匀,于00rpm离心1分钟,转移水相至新的Ep管,重复步骤5一次。6）向转移的水相中加入1倍体积的3ol/ NaA和0.7倍体积的异丙醇（或25倍体积的无水乙醇）,冰上放置0分钟。7）4000rpm离心

3、20分钟,弃上清，用0.5L70乙醇洗涤沉淀一次,弃上清，沉淀于室温干燥。8）将D沉淀溶解于5u T缓冲液中,20C保存。9）进行NA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。植物DNA的SDS提取法:(一)试验试剂：1）研磨缓冲液：称取.6gNaC，13.5g柠檬酸三钠，37gEDTA-Na分别溶解后合并为一,用.2ml/的N 调至70,并定容至1000m。）0 溶液：称取766gal 和41柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3） SSC溶液:用10 SSC溶液稀释10倍。4）01SC溶液：用1 SC溶液稀释1倍。5）Rnase溶液:用0.1molaCl溶液配制成25mg/m 的酶液，

4、用1mol/LHCl，至5.,使用前经80水浴处理5n（以破坏可能存在的Das）。6)氯仿异戊醇：按24l氯仿和1ml 异戊醇混合。7)5mlL高氯酸钠溶液：称取aClO4H2O 0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至10l。8) DS(十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,然后在7080的水浴中溶解,趁热过滤,冷却之后即将滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下凉干待用。9)1mol/LHCl。10).mol/LNOH。1） 二苯胺乙醛试剂：1.5二苯胺溶于10ml 冰醋酸中，添加1.5ml 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处,使用时加0.m乙醛液浓乙醛：H2=：0(VV

5、）。) 1.olL高酸溶液(HClO4)。3) 0.05maOH。4) DA标准液:取标准DA25m 溶于少量0.05ml/ NaOH中，再用005mol/LaOH定容至5,后用移溶管吸取此液5l 至50 容量瓶中,加50mlmolLlO4，混合冷却后用0.5olHCl4定容至刻度，则得100/l 的标准溶液。（二)实验步骤:1) 称取植物幼嫩组织10剪碎置研钵中，加10ml 预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2) 将匀浆无损转入25m 刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，加上塞子,剧烈振荡3,转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000pm离心min。3

6、) 离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4) 将试管置72水浴中保温3min(不超过mn)，以灭活组织的NA酶,然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温,加ml/L高氯酸钠溶液提取液：高氯酸钠溶液4：1(VV)，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为mol/。5)再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中，振荡1mi,静置后在室温下离心(400rpm）5n，取上清液置小烧杯中。) 用滴管吸95的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7) 然后加入0.5l左右的1

7、 SC，使最终浓度为1 SSC。8） 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9)加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为570g/ml，并在7水浴中保温0min,以除去RNA。0) 加入等体积的氯仿异戊醇混合液，在三角瓶中振荡min，再除去残留蛋白质及所加Rne蛋白,室温下以00rpm离心5min,收集上层水溶液。11)再按、7步骤处理即可得到纯化的A液。2、PCR扩增目的基因(1)器材1) 微量移液器2) 灭菌的Tip头、CR管3) PCR扩增仪4)目的DN（NA模板)5) dNP混合物6) 引物对7)Ta酶8) PCR扩增试剂盒（二)试剂1)10PCR 缓冲液(含Trs-Cl

8、 100mml/; gC215mmol/、KCl500mmol/L, pH83,0%明胶) 2) 脱氧核苷三磷酸dNPs：配成 10m dAP,TP，dGP，dCT各10mM,用NOH溶液调节至.3。）3)氯仿-异戊醇:配成24:的比例，室温避光保存。 4) 酚：氯仿：异戊醇=25：2:1 ) M NaA 、ddH2O6) 无水乙醇:7%乙醇 ) TE缓冲液（三）实验步骤)在0.2m薄壁反应管中加入下列成份:（混匀) ddH2O: 补至终体积(2l） 1PCR缓冲液 1/0总体积 .0m dNTPs1l /l TaDNA聚合酶 0.l 引物混合液(0 po /l /引物) l DNA模板 .6

9、l 混匀后,在台式离心机上瞬时离心0秒。2)在设定好的PC仪上反应 5C,5min;95C，1mi;56C,min；72C,2mn。反应轮。3）反应结束后，将反应管在72C充分延伸10分钟，再将反应管冷却至C。 取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳(实验三）,确认是否有目的的PR产物。如果PR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物,可以通过纯化得到改善。纯化继续）6)。 ）转至15ml离心管，向管中加5l酚，2氯仿异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。 5）吸取上层液,转至另一已加5l 3M aAc的1.5m的离心管，加150l无水乙醇,-0C过夜。 6）离心10000rpm,1分钟，弃上清

10、,加0.5ml 70乙醇，00rp离心,5分钟。弃上清，烤箱中干（60C)，溶于20l TE。(四）技术要点 1)PR各组份的配制与加样量要特别注意。 ()引物浓度：0mol 足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强,扩增非 特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。（2) 引物的配制：厂家提供的引物一般是干粉状态并标明O值,1 OD约含33g。开盖前先将干粉离心至管底,加双蒸水至浓度g/l，再取部分稀释至10 pmol。引物浓度计算公式:1ol=(310-4g) ，n是引物的碱基数（3) Mg2：使用浓度一般在.mM,要求模板不含高浓度EDA和诸如硫酸基团类的负电荷基团， Mg+浓度升高可

11、导致错配率升高和非特异性扩增。 (4)模板NA：浓度不可过高，质粒DNA 2g即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释100010000倍作为模板使用。 （5) TqDNA聚合酶:一般用量5U/100l。酶量过大易导致扩增非特异序列，Ta酶具有末端转移酶活性,常在3端加A。 2)扩增轮数与退火温度扩增轮数：一般0轮以内就可使模板扩增1倍，超过30轮，错配率升高。 退火温度计算公式：m值=（GC4+AT2）43、琼脂糖凝胶电泳的检测(一)仪器1）琼脂糖凝胶电泳系统(天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tp头、水平电泳槽、电泳仪）2）凝胶成像仪(二)试剂及材料 目的DA、

12、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDA、E、DNA纯化试剂 盒1)TE电泳缓冲液浓储存液 50:242g ri;57.ml冰乙酸;10l 0.5ol/EDTA（PH8.) 定容至一升。使用液 1:4.4g Trs；1.15l冰乙酸；2l 0.5 m/L EDTA(PH8.0) 定容至一升。 2）样本液缓冲液: 60%蔗糖;0%溴酚蓝(三)实验步骤）将有机玻璃内槽洗净、晾干,放置于水平制胶器中,插好梳子,在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。2）0.8%琼脂凝胶板的配制：取.6g琼脂糖加8ml TAE(1)，20ml水,微波炉加热融化分钟,将其冷却至5C-5C,加入储存液1ul,小心混匀

13、,缓慢倒入制胶槽中。(根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度)。 3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板,放入电泳槽，加入TE（1），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。 )样品按照0:1的比例加入样本液,在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。 5）接通电泳槽与电泳仪的电源,维持稳压1-5V/m（按照两极之间距离计算)，电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断,当移动到距凝胶前沿1-2m出停止电泳。）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。（四 ）技术要点 1)选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定NA的大小,小片段DNA应用高浓度凝胶，

14、大片段则用低浓度凝胶，在%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与00bp的双链线状NA一致。 不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性A大小范围见下表1。 表 不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围凝胶浓度(%)分离DA的有效范围（kb)0.3 60506 201 .810.8 .0 70.512 60.41.5 0.2 .0 .12)电泳中注意防止凝胶发热。3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5/cm(电极间的最小路径)。随着电压的增加,琼脂 糖凝胶的有效分离范围缩小。 )溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。 四、目的DNA的回收纯化(一）仪器1)琼脂糖凝胶电泳系统)凝胶成像仪3）离心机

15、4)单面刀片5)恒温水浴锅(二)试剂)D回收试剂盒2）5TAE3）ddO(三)实验步骤）在紫外灯下切分含NA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖.放入1.ml离心管中。2) 按每10m琼脂糖加入30000l 溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul),置5水浴10分钟,使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。3)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，1000r室温离心1分钟,倒掉收集管中的液体.再将吸附柱放入同一个收集管中。4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 200rp 室温离心3秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。)再在吸附柱中加入0uI漂洗液， 120

16、0pm 室温离心15秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。6) 100m 室温空离心1分钟。)将吸附柱放入一个干净的15ml的离心管中，在吸附膜中央加入0ul洗脱缓冲液，室温静置分钟后, 12000rm 室温离心1分钟(为提高回收效率可再洗脱一次)，将1.5l离心管（DN)贮存于20。五、限制性内切酶消化、产物回收及连接重组(一）仪器及材料1）回收得到的目的DNA2）BamHI、HidIII、T4 DNA连接酶、 DNA回收试剂盒3)U1AT 质粒、双蒸水、0酶切通用缓冲液K4)EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机 表1 常用酶切缓冲液配方 缓冲液名称 配 方 贮存温度（）

17、1010M Tri-l,7.00M MgCl10 m DTT-20 0M 100M Tris-H,pH5100mM MgC10 mMDT 500M NaC -200 50M ris-HCl,pH.510mMgCl210 M DTT 10mMNaCl-0 10K 200M ris-HC,8.51 M MgCl210 mM DT 100mMKl -20 0T(BS-Free)30M Tr-c,pH.9 10m gA 5M DTT 660m KAc 200.1%SA20 0.1 Triion- -20 (二)实验步骤）在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系:酶切反应体系(20u体系）管号 核酸

18、 0酶切通用缓冲液K ddH2 BmHI ndII 1 1ul目的A 2l 0u 2l 1ul 2 0upU18A质粒 2ul 5ul 2ul 1ul2)37保温三小时。3)酶切产物的纯化回收，每00ul溶液加入700u溶胶液,其余的操作步骤详见实验四4)载体与目的DNA的连接。在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系（20ul）:目的DNA pU18CAT质粒 10连接缓冲液 4DA连接酶 ddH2 X u ul ul 1ul ul目的NA和pU18CAT质粒的相对浓度约为1：31:05)4水浴保温过夜。6、大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化 (1)仪器1小型高速离心机2恒温摇床

19、3恒温培养箱420冰箱5恒温水浴器 6超净工作台7高压灭菌锅(二)材料1氨苄青霉素2.大肠杆菌D5a.连接产物4离心管5枪头、微量移液器试管、培养皿、三角瓶(三）试剂LB培养基（根据需要确定配制的量): 1g/L 胰蛋白胨，5/L酵母提取物，0g/L NaC,加水至1000l，高压灭菌,保存在室温。氨苄青霉素： 用去离子水配成10m/ml的储存液,过滤除菌,20分装保存。 卡那霉素:用去离子水配成10/ml的储存液,过滤除菌，-2分装保存 无抗生素L琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）:1g/ 胰蛋白胨，gl酵母提取物，0g/ NaCl,15l 琼脂粉，加水至100m，高压灭菌;铺平板,冷

20、却后在37培养2小时,保存在室温。 含有抗生素琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）: 10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物,1g/l NCl,15/l 琼脂粉,加水至0l，高压灭菌;当培养基降温至左右，加入终浓度为00g/ml 的氨苄青霉素或5l卡那霉素，并铺平板,冷却后在37培养24小时，保存在室温。 0. CaCl2(根据需要确定配制的量):1.099克溶解在00ml灭菌水中,02m滤器过滤除菌。氯化钙分子量为：10.99。 50%甘油: l甘油加入0m水,混匀，高压灭菌。 其他: DH大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干,接菌环,加250l B液体培养基的00ml灭菌锥形瓶一个，灭菌5和5

21、00 L离心管若干,灭菌刻度吸管若干,冰盒，移液器,灭菌移液器吸头，灭菌Ependorf管等。(四)实验步骤)以接菌环从-70保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时； 2)挑取单菌落接种于5mL无抗生素B培养基中,37振荡培养过夜；）按照1:100接种菌液至20 LB培养基中，剧烈振荡培养1.5-2小时左右，至D600达0.4-6;4)将菌液冰浴0分钟，转移至预冷的500 mL离心管中，4,000 rm离心10 分钟；5）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于0 L预冷的1 CaCl2中，冰浴0分钟， rpm离心10分钟; 6）弃尽上清。以5 m（菌液体积的5%）预冷的 M CCl

22、2溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的0%甘油水溶液,混匀后按每支5L在冰上分装，-80保存； 注:以上操作全部在无菌条件下进行。 7)取连接产物2l（在实际操作中，经常需要取全部连接产物)置于冰上; 8)从80冰箱取管感受态细菌（每管5l),在冰上融化; 9)将连接产物加入感受态细菌中，混匀,放置冰上23分钟；同时做两个对照管受体菌对照:50l感受态细胞2l无菌水 质粒对照：501 M Cal2溶液2l连接产物0）42加热0秒,迅速置于冰上1-2分钟； 11）每管加入40010l的无抗生素液体B培养基,在3摇床缓慢摇荡206分钟;12)用1000rp离心10秒，弃去大部分上清，留下约50并

23、用移液器吹吸重悬细菌; 13)取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性(根据质粒所携带抗生素抗性基因而定)的B琼脂糖平板上,倒置于37培养箱培养12小时以上，出现菌落。(五）技术要点.加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5； 242热激时,必须要保证温度的准确性; 3.涂布L平板的菌液量应该根据经验确定。如果连接效率很高,而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；反之，可以增加,甚至全部菌液涂布平板。判断的标准：在L平板上生长密度合适的单菌落; 4涂布平板之后，在7培养的时间不超过12-小时，否则可能产生卫星菌落；5.防止其它质粒污染;.防止其它细菌污染。 7、质粒DA的提取及重

24、组子的鉴定(1)仪器1恒温培养箱2恒温摇床3小型高速离心机4高压灭菌锅 5分光光度计（2）试剂及材料1.转化重组子 .缓冲液A:0mM葡萄糖;10mEDA;25mM Tis-Cl，pH8。3.碱溶液：0.2MNaH；%SD, PH12.5。 4.乙酸缓冲液：3 NAC;2M乙酸,H4.8(盐酸调H）。5TE缓冲液:10m Tris-HCl，p80；1mM DTA。 .A酶溶液:mg/mRN酶 ,用TE配制,100C煮0分钟,灭活NA酶。缓慢冷却至室温,10r/in离心5n,上清于2C保存。 7.LB培养基: 10g胰蛋白胨,5g酵母粉,5g NaC加水至100ml，用1M NaO调pH至7.5

25、，高压灭菌。 氨苄青霉素：用去离子水配成10mg/ml的储存液，过滤除菌，-2分装保存。 9.A培养基： 在B培养基中加入终浓度10/ml的氨苄青霉素。1异丙醇 11.酚氯仿异戊醇:25:4：1 270%乙醇1.3M Nac （3）实验步骤) 从转化平皿上挑一克隆接种到液体培养基中,震荡培养，待细菌浓度增至OD600=11时,收获细菌。菌液转到1.5lpedr管中,离心8000rpm，2分钟，弃上清。 2）加100l缓冲液A，充分混悬细菌。 3）加200l碱溶液,裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮,开盖后能拉出丝状粘稠液体。 4）加150l乙酸缓冲液，反复倒转管5次,混匀,冰浴1分钟。 5)离

26、心10000rpm,5分钟，将上清转移至另一Eppendorf管中。 6)加等体积的酚氯仿-异戊醇(2:2：1)混匀，离心1000rpm，1分钟。 )吸上层水相至另一Eppendof管中,加等体积的氯仿混匀，离心10000pm,1分钟。 8)吸上层水相至另一Eppendf管中，加6倍体积的异丙醇,混匀，室温或-2C,10分钟。）离心1000rm,0分钟，弃上清,加入ml70乙醇。勿混匀,离心00rpm,5分钟,重复加入1m 70%乙醇一次,弃上清,干燥箱中干燥。 0)干燥后,加入30 TE(含NA酶A 10ul,0g/l)，使质粒溶解，-20C保存备用。1) 取一个灭菌的管,依次加入下列试剂 10限制酶缓冲液2.0u、重组质粒5.0ul、ddH2O11.0ul、限制性内切酶2.0ul总体积为2.l。12）将上述试剂轻轻混匀,稍加离心，集中溶液，37C水浴保温4小时。酶切结束时,加入.5mmlL EDTA(P8.0）使终浓度达10mol/L，以终止反应。13）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析详见实验三。(四）技术要点1)每一步都要充分混匀，为获得高产量DNA,第一步需使菌体完全重悬。2)加入碱溶液后,反复混匀使细菌充分裂解,但需要轻柔