综合化学生物学实验教案.docx

1、综合化学生物学实验教案化学生物学综合实验教案（部分）一、树型金银花组培快繁技术的研究实验一 组培室设备参观及器皿的洗涤和灭菌一、目的要求：1通过参观，了解组织培养室的几个主要组成部分和各部分应有的基本设备以及有关仪器的用途与功能。2通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。二、材料用具：高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、双筒解剖镜、酸度测定仪、空调机、控温仪、百分之一与万分之一天平、电炉、玻璃器皿（试管、三角瓶、移液管、漏斗、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒酒精灯），以及镊子、解剖刀、解剖针、手术剪，肥皂、洗衣粉、重铬酸钾、浓硫酸等。三、说明：在进行各类具体的组培实验前，首先了解组培室的

2、结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。四、方法和步骤：首先在老师带领下参观组培室，并听取讲解，然后配制洗液，称取工业用重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸（或废硫酸）配好的溶液呈红色，铬酸洗液是一种强氧化剂，去污能力强，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蜡等则用此液无效，铬酸洗液可反复使用，直到溶液

3、呈青褐色为止。此溶液腐蚀性强，洗涤时需注意。每人清洗部分玻璃器皿，方法：清水洗净泡入洗衣粉水溶液中进行洗刷清水反复冲洗蒸馏水淋一遍烘干备用。然后清洗部分较脏的玻璃器皿，方法：采用先碱后酸，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净晾干侵入酪酸洗液，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定清水反复冲洗干净蒸馏水淋洗一遍烘干备用。带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。对器皿和用具进行高压灭菌，即用手提式高压灭菌锅，在1.2个大气压下保持1520分钟。解剖刀、手术剪、解剖针、镊子等用具 在接种前还要用百分之七十的酒

4、精棉球擦一下，再用酒精灯的火焰灭菌，冷却后即可应用。五、作业：试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？ 实验二 母液的制备及培养基的配制、灭菌一、 目的要求：通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。二、 材料用具：高压灭菌锅、冰箱、普通及精密天平、电炉、铝锅、玻璃器皿（烧杯、量微、容量瓶、移液管、试剂瓶、三角瓶、漏斗），化学试剂(CaCl22H2O，KNO3，MgSO47H2O，NH4NO3，KH2PO4，Na2EDTA，FeSO47H2O，MgSO44H2O，Zn SO47H2O，H3BO3，KI，NaMoO42H2O，CuSO45H2

5、O，CoCl26H2O，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，若干种生长调节物质及天然复合物，HCL,NaOH,酒精)，以及称量纸、药匙、玻璃棒、精密度纸，瓶盖用纸，线绳或橡皮筋、铅笔、标签纸。三、 说明：植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择或发展出一个符合试验材料需要的适宜培养基。大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等。四、 方法和步骤：（一） 母液的制备母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素

6、、微量元素、维生素和铁盐等。配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO2-4,Ca2+,Mg2+和PO3-4一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。现以Murashige和Skoog(1962)培养基为例叙述如下：根据各种药品的特点，母液可配成4种。表1 MS培养基母液的配制成分规定用量/mg.L-1扩大倍数称取量/ mg母液定溶体积/ml配1LMS培养

7、基吸取量/ml母液大量元素 KNO3 NH4NO3 MgSO47H2O KH2PO4 CaCl22H2O母液微量元数 MnSO44H2O ZnSO47H2O H3BO3KI Na2MoO42H2O CuSO45H2O CoCl26H2O母液铁盐 Na2-EDTA FeSO47H2O母液有机物质 甘氨酸 Vit.B1 Vit.B6 肌醇烟酸1900165037017044022.38.66.20.830.250.0250.02537.327.82.00.10.51000.520202020201000100010001000100010001000100100100100100100100380

8、0033000740034008800223008600620083025025253730278020010501000050100010001000100050110101 大量元素和微量元素母液的配制 按规定用量,称取所需的各种药品，在配制时为减少工作量，可以把几种药品（如大量元素或微量元素）配在同一母液中（见表1）.但由于各种药品的混合，可能发生反应，生成沉淀物，以致母液失效.为避免类似现象发生，在大量元素、微量元素和维生素及氨基酸的母液配制时，可采用如下2种做法加以解决：将要配在同一母液的大量元素、微量元素和维生素及氨基酸等化合物，按“表1”所列药品的先后顺序溶解药品，待前一种药品完

9、全溶解后再加入后一种化学药品，以此类推；使每种成份分别完全溶解，再把它们彼此混合.2 铁盐母液的配制铁盐的成份含硫酸亚铁（FeSO47H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）。这两种化合物的溶解和混合较为严格，必须按如下方法配制，否则将会产生沉淀.该方法是：分别溶解FeSO47H2O和 Na2-EDTA，加热并不断搅拌，使之完全溶解，冷却，将2种溶液混合，调PH至5.5，用蒸溜水加至所需容积，棕色瓶保存于冰箱之中.3 植物生长调节物质母液的配制 植物生长调节物质是培养基的重要组分之一，一般是植物激素类物质，如生长素类的IAA、IBA、NAA、2,4-D，赤霉素类的GA3，细胞分裂素类的K

10、T和6-BA、ZT等.由于大多数生长调节物质难溶于水，因此配制方法也各不相同：IAA，IBA和GA3先用少量95%酒精溶解，再加水定容，摇匀后贮于试剂瓶中、贴上标签后，存放在冰箱中；NAA可用热水或少量95%酒精溶解，再加水定容至所需容积；2,4-D可溶于少许1molL-1的NaOH溶液中，然后加水定容；KT和6-BA可用少量1molL-1的HCl溶解，再加水定容；玉米素(ZT)先溶于少量95%酒精中，然后加水定容. 植物生长调节物质浓度通常用ppm（mgml-1）和molL-1表示，在配制母液时，常以ppm较为方便，一般配制成0.5ppm的母液，这个浓度既便于计算，也可避免冷藏时形成结晶.

11、4 有机附加物母液的配制在植物组织培养时，培养基中往往要加入一些有机附加物，如椰子汁，以促进组织培养活性.由于椰子汁的活性成分是耐热的，在配制时，要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮存于的-200c的低温冰箱内.（二）培养基的配制1 量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升培养基, 先量取约700 ml体积的水。 表2 根据培养基配方， 用量筒量取所需要的各种元素的母液。物质加入体积或重量大量元素母液(20)50ml微量元素母液(1000)1 ml铁盐母液(100)10 ml有机物质母液(50)10 ml蔗糖30 g琼脂8 g吸取母液时，注意

12、应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可于加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。加热至沸腾片断，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯内溶液是否透明。 3 调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定培养基的pH按照培养材料的要求分别用 1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液来调节所配制培养基的pH值，一般培养基的pH值约为5.8，培养的材料不同，对培养基的pH值要求也不同。4 分装 将配制好的培养基分别

13、装在事先洗净的三角瓶，用锡铂纸封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。5 培养基的灭菌 一般用手提式医用高压锅来灭菌。培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，即将分装好的培养基放在高压灭菌锅中，加热，待压力上升到0.5kg/cm2时，打开放气阀排净冷空气，关闭放气阀继续加热使压力稳定在1.11.2kg/cm2，温度为121摄氏度的条件下，维持1520分钟，培养基灭菌时间不宜过长，以防引起培养基成分的变化，灭菌后的培养基置于室温下贮存（最适宜的温度为10摄氏度），一般培养基在灭菌后二星期内应用。6 培养基的保存 消毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一

14、般 应在消毒后的两周内用完，最好不要超过一个月。 五、 作业1 按上述方法配制MS培养基，先配母液，再配培养基，备用。2 制备母液时应注意哪些问题？为什么？实验三 树型金银花愈伤组织的诱导和增殖的研究实验一、实验设计1研究的技术路线在查阅有关文献资料的基础上，结合预备试验，主要采用芽、幼嫩茎段和幼嫩叶片，着重从诱导愈伤方面研究树型金银花愈伤最佳诱导体系，主要采用单因素、双因素、以及多因素正交设计的方法，同时用多元分析法进行分析，从而摸索出最佳诱导愈伤条件。筛选出最优体系，具体技术路线如下图：外植体选取外植体表面灭菌愈伤组织的诱导愈伤组织的增殖图1 技术路线2 试验方案植物的最佳繁育方法，首先是

15、由其遗传特异性决定的，单就组织培养而言，它还受植物基因型、外植体种类、部位及培养基种类、激素类型及浓度、培养条件等诸多因素的影响。本试验在参考已有资料的基础上采用正交设计和随机区组试验设计，注重启动培养基配方的研究，各阶段设计方案如下：2.1 芽愈伤组织的诱导本试验以MS培养基为基本培养基，MS培养基配方见表2、表3和表4。采用随机区组试验设计探索生长调节因子6-BA,NAA对树型金银花顶芽或侧芽诱导愈伤组织的适用量，6-BA,NAA 8个处理的随机区组试验设计（表2）。表2 芽愈伤诱导激素组合配比表(单位：mg/L)因素水平1234567 86-BA11.522.511.522.5NAA0.

16、050.050.050.050.10.10.10.12.2 茎段愈伤组织的诱导 本试验以MS培养基为基本培养基，MS培养基配方见表1。表2.3表2.4。采用随机区组试验设计探索生长调节因子6-BA,NAA对树型金银花茎段诱导愈伤组织的适用量，6-BA,NAA 8个处理的随机区组试验设计（表2）。2.3 叶片愈伤组织的诱导(1) 正交实验设计 本试验也是以MS培养基为基本培养基，采用正交设计探索生长因子6-BA、2，4-D、NAA以及蔗糖浓度对树型金银花幼嫩叶片愈伤组织诱导的适用量，每个因子设三种水平（表3），构成四因素三水平的试验设计（表4）。表3 叶片愈伤诱导正交设计因素水平表水平因素2,4

17、-Dmg/L6-BAmg/LNAAmg/L蔗糖g/L10.50.11.01521.00.52.03032.01.03.045表4 叶片愈伤诱导正交设计表处理2,4-D6-BANAA蔗糖10.50.111520.50.523030.51345410.1245510.5315611130720.1330820.5145921215(2)单因素诱导叶片愈伤本试验也是以MS培养基为基本培养基，采用随机区组试验设计探索生长因子2，4-D不同浓度对树型金银花幼嫩叶片愈伤组织诱导的影响，该因子设四种水平（表5），构成单因素四水平的试验设计。表5 叶片愈伤诱导2，4-D单因素水平表水平（mg/L）12342，

18、4-D0.51.01.52.03 试验方法3.1 培养基的选择 查阅的中文文献和外文文献中绝大多数金银花的组培都选用MS（Murashing and Skoog,1962）培养基，这说明MS培养基为金银花组培的经典培养基，故三种外植体均选取MS培养基为基本培养基，以节约时间和减少浪费。3.2 培养基的灭菌根据试验设计各阶段所需要培养基。培养基配制好后进行认真严格的湿热灭菌，灭菌条件为121C，约110Pa下灭菌20分钟，灭菌完成后取出待其冷去凝固后使用。如果为固体培养基，则在取出后应该适当摇荡使培养基里面的琼脂充分混匀，以防培养基凝固不好。3.3 激素的选取根据外植体的不同分别选取了不同的激素

19、，这些激素分别是:6-BA、NAA、2，4-D 。3.4 外植体的选取 冬芽 选取3月份未萌发的芽,去除外层叶片。 幼嫩茎段 尽量选取茎段顶层。 叶片 选取幼嫩叶片。3.5 外植体灭菌 灭菌试剂的选取75%酒精，0.1%升汞，30% 次氯酸钠。3.5.1金银花芽的灭菌由于金银花芽外面常粘附有泥土，且冬芽的外层披一层绒毛，所以在进行灭菌前应进行预处理，尽量减少其表面微生物数量，降低接种后的污染率。具体处理方法为:取回顶芽，将其最外层叶片剥离，然后将其放入烧杯中，加纯净水和少量洗洁精后，放在双向磁力加热搅拌器双向磁力加热搅拌器上搅拌数分钟，取出材料准备正式灭菌。a 灭菌试剂 分别选用75%酒精+0

20、.1%升汞、75%酒精+30%次氯酸钠这两种组合进行对比灭菌处理，选择最合适灭菌试剂。b 灭菌时间75%酒精灭菌时间均为30s，0.1%升汞灭菌时间分为三个梯度，分别为6min、8min、10min；30%次氯酸钠则分为两梯度，分别为20min、30min。从而选择最佳灭菌试剂以及其最佳灭菌时间。c 灭菌流程75%酒精+0.1%升汞先用75%酒精浸泡30s，然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用0.1%升汞+12滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。75%酒精+30%次氯酸钠先用75%酒精浸泡30s

21、，然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用30%升汞+12滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。3.5.2 金银花幼嫩茎段的灭菌灭菌前茎段预处理：由于树型金银花茎段均为中空结构，且表面披一层较致密绒毛，故在取材时不应将材料剪的过短，防止外界细菌以及真菌通过中空管道直接进入茎段内部，从而导致灭菌不彻底，另外，由于表面披绒毛，容易沾染微生物，且在灭菌过程中灭菌剂不能很好的与精短表面接触，故在灭菌处理前可用毛笔蘸取少许洗洁精或者吐温来回轻轻刷洗其表面绒毛，减少其染菌几率。a 灭菌试剂 选用75%酒精+0.1

22、%升汞这一组合进行灭菌。b 灭菌时间75%酒精灭菌时间30s，0.1%升汞灭菌时间为6min、8min、10min这三个梯度。c 灭菌流程先用75%酒精浸泡30s，然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用0.1%升汞+12滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。3.5.3 金银花幼嫩叶片的灭菌 灭菌前应先用毛笔蘸取吐温或者洗洁精来回刷洗其正反两面，应轻轻刷洗，洗洁精或者吐温的量不能太多，加1滴既可，加入过多会使叶片出现类似于被折叠后产生的变色以及变薄现象，可能原因是过量的清洁剂会使叶片细胞受到一定损伤。

23、a 灭菌试剂选用75%酒精+0.1%升汞这一组合进行灭菌。b 灭菌时间75%酒精灭菌时间30s，0.1%升汞灭菌时间为3min、5min、6min这三个梯度。c 灭菌流程先用75%酒精浸泡20s，然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用0.1%升汞+1-2滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。3.6 外植体的接种3.6.1 芽的接种芽全部采取斜插入培养基的接种方法进行接种。接种前先将灭菌好的冬芽放入已灭菌的带滤纸的培养皿中，将其表面的水吸干，再用镊子小心将芽最外层的因灭菌而褐化死亡的叶片剥去，然后用解

24、剖刀切去芽基部茎段的一部分制造上口后，将芽小心些插入培养基中即可将其放在培养室中培养架培养。3.6.2 茎段的接种茎段也全部采取斜插入培养基的接种方法进行接种。接种前先将灭菌好的茎段放入已灭菌的带滤纸的培养皿中，将其表面的水吸干，再用解剖刀小心将茎段两端因灭菌而褐化死亡的部分切去，然后再用解剖刀将茎段切成约0.5cm长小段后，小心将这些小段平放在培养基中后，即可将其放在培养室中培养架上培养。3.6.3 叶片的接种叶片接种前应先对叶片进行预处理，首先将灭菌好的叶片放入已灭菌的带滤纸的培养皿中，在滤纸上吸干叶片表面水分后，用剪刀小心将叶片边缘剪去薄薄一小圈，然后，用解剖刀将叶片在一部分接种时需要接

25、触培养基的一面小心轻轻划上一些小伤口，另一部分不划，最后用剪刀将叶片剪成0.5cm0.5cm的小片，准备接种。 叶片接种进行两种接种方法的对比：a 叶片正面朝上将一部分反面用解剖刀处理过的小叶片接种在培养基上，反面接触培养基，而正面朝上接入培养基；另一部分反面没有用解剖刀划过伤口的叶片也接种在同样的培养基上，进行比较；接种好后即可将它们放在培养室中培养架上培养。b 叶片反面朝上将一部分正面用解剖刀处理过的小叶片接种在培养基上，正面接触培养基，而反面朝上接入培养基；另一部正面没有用解剖刀划过伤口的叶片也接种在同样的培养基上，进行比较；接种好后即可将它们放在培养室中培养架上培养。3.7 培养条件3

26、.7.1 芽和茎段的培养条件 温度24C2C,光照16h黑暗8小时的光暗交替培养，日光灯。3.7.2 叶片的培养条件分两部分进行培养，从而寻找哪种培养条件适合叶片愈伤组织的诱导，以下为两中对比：a 一部分叶片在温度24C2C下,暗培养15天左右，再进行光暗交替培养。b 另一部分直接放在24C2C下，光照16h黑暗8小时的光暗交替培养条件下进行培养。3.8 试验观察与统计3.8.1 数据记录及现象观察材料接种后，在固定周期内对材料的污染率、褐化率、死亡率、愈伤启动率以及愈伤组织诱导率等情况做观察记载及必要的统计，并根据需要调整试验步骤。以下为一些数据记录公式：启动率未污染外植体启动数/未污染外植

27、体总数100污染率接种污染数/接种总数100%死亡率未污染死亡数/未污染总数100褐化率未污染褐化数/未污染总数100愈伤组织诱导率产生愈伤组织的块数/接种的总块数100其中，有部分外植体并未完全褐化，也长出部分愈伤组织，对于此种外植体，记录数据时，既将其当成褐化外植体同时也当成产生愈伤的外植体。3.8.2 数据处理与分析 用SPSS13.0统计分析软件进行数据的方差分析。二、野生种金银花和栽培种金银花绿原酸提取的比较实验金银花(L onicera j a ponica) ,又称忍冬,是常见中药材之一,具有抗氧化、清除自由基、降血脂、降血压、预防心血管病、抗突变、抑菌解毒、消炎利胆等多种药理活

28、性功能,其主要有效成分为绿原酸(CHA)，常用的CHA 含量的测定方法主要有紫外分光光度法(UV) 、高效液相色谱( HPLC) 法以及高效毛细管电泳( HPCE) 法等。本实验采用紫外分光光度法(UV)。一、原理 绿原酸为金银花的主要功能性成分, 其药效高低取决于绿原酸的含量。绿原酸为咖啡酸奎尼酸衍生物，易溶于甲醇、乙醇、丙酮, 微溶干乙酸乙醋, 是一种重要的生理活性物质, 它具有抗菌、抗病毒、解热、升高白细胞、保肝利胆、免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等作用。由于绿原酸分子中含有酚经基, 其中酚经基与三氯化铁的产生显色反应,显色反应产物的光密度与绿原酸的含量呈良好的线性关系,

29、因此建立了绿原酸含量的快速测定方法。二、仪器和试剂主要仪器: 紫外分光光度计(UV2550 型, 日本岛津公司) , 可见分光光度计(S22PC 型,上海棱光技术有限公司) ,医用数控超声波清洗器( KQ2250DE 型,功率100 % ,昆山超声仪器有限公司) 。主要试剂:CHA (纯度95 % ,美国Sigma 公司) ,显色剂为0. 01 mol/ L FeCl3 甲醇溶液,甲醇(色谱纯,德国Mark 公司) 。供试金银花由杨进老师提供。二、方法1.测定波长的选择 用85乙醇(体积分数)为溶剂；配制绿原酸对照溶液(50 mgL)，以85乙醇(体积分数)为空白，于200400 nm，波长范

30、围测定紫外吸收光谱，找到绿原酸对照溶液和黄山野菊花测试液在某一波长处的最大吸收值，确定这一波长为测定波长。2. 标准曲线的绘制 准确称取105干燥至恒重的绿原酸对照品5 mg，于100 mL量瓶中，加入85乙醇(体积分数)溶解并稀释至刻度，摇匀，即为浓度50gmL的标准品溶液。准确量取标准品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL分别置于10mL量瓶中，加85乙醇(体积分数)稀释至刻度，摇匀，以85乙醇(体积分数)为空白，在确定的波长处分别测定各溶液的吸光度(A)。计算回归方程。3.稳定性实验取上述标准品溶液在确定的波长处每隔1h测定一次吸光度，检验吸光度在8h内有无变化？4.样品测定准确称取