实验五果蝇唾液腺实验概论.docx

1、实验五果蝇唾液腺实验概论实验五 果蝇唾液腺染色体的观察及制备一、目的1掌握剖离果蝇幼虫唾液腺的技术。2掌握制作果蝇唾液腺染色体玻片标本的方法。3观察果蝇唾液腺染色体的形态特点。4.认识体细胞染色体联会现象。二、原理1.双翅目昆虫（摇蚊、果蝇等）幼虫期的唾液腺细胞巨大，此中的染色体称为唾液染色体（ salivary chromosome ）。这种染色体比一般染色体大的多，宽约 5m,长约 400 m，相当于一般染色体的 100150 倍，所以又称为巨型染色体。唾液腺染色体经过多次复制而不分开，大体有 1 000 4 000 根染色体丝的拷贝，所以又称多线染色体（ polytene chromos

2、ome ）。多线染色体染色后，出现深浅不同样、 疏密各其余横纹， 这些横纹的数目和地址经常是恒定的，代表着果蝇等昆虫的好多特点。比方染色体出缺失、重复、到位、易位等，很简单在唾液腺染色体上鉴别。2.黑复果蝇的唾液腺染色体是 2n=2*4=8( 图一 ) ，但因体细胞配对，又因短小的第 4 染色体和 X 染色体的着丝粒在端部所以染色体的一端在染色中心上，看上去，各自只形成一条线状和点状染色体。只有第 2 和第 3 染色体的着丝粒在中央，它们从染色中心以 V 字形向外伸出（ 2L，2R， 3L，3R），所以共有 6条（图二）图一图二在显微镜下， 短小的第 4 染色体有时不易观察到， 所以最简单识其

3、余是第 5（图三）雄果蝇的 Y 染色体几乎包含在染色中心里，由于是异染色质，看起来很淡。唾液染色体上的横纹宽窄、浓淡是必然的，但在果蝇的特定发育时期，它们会出现的膨胀，这称为松懈区（ puff ），当先人们认为这是这部分基因被激活的标志。图三3.唾液腺染色体的另一特点是体细胞中同源染色体处于亲密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在今后不断的复制中仍不分开，由此数不胜数条核蛋白纤维丝唾液腺染色体（ salivary gland chromosome ）是一类存在于双翅目昆虫，若是结合在一起，亲密围绕。所以细胞中染色体只呈单倍数。黑腹果蝇的染色体数目 2n=8 此中第、第染色体为中部着丝粒染色

4、体，第染色体和第IX 染色体为端着丝粒染色体。唾液腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起形成一个染色中心（ chromo-center ），所以在光学显微镜下可见从染色中心处伸出 6 条配对的染色体臂，此中 5 条为长臂， l 条为紧靠染色中心的很短的臂。唾液腺染色体经染色后，表现深浅不同样，疏密各异的横纹（ band）。这些横纹的数目，地址，宽窄及排列序次都拥有物种的特异性。 研究认为这些横纹与染色体的基因是有必然关系的。经过必然的实验方法使果蝇唾液腺染色体各臂分别开，而且使带纹、膨突等特点不受杂质影响清楚地显示出来， 是进行果蝇遗传学研究的很重要的一个环节 果蝇唾液腺染

5、色体在不同样种间的共同点是染色体的着丝点位于一个染色地域， 但不同样的种类经常其染色体臂数目不同样 每条染色体臂上分布着染色深浅不同样、粗细各异的磺纹 (band) ， 这些横纹的宽窄疏密程度以及排列序次和数目又都有种的特异性和种内的差异 由此，果蝇唾液腺染色体近几十年来， 已宽泛用于种内系统发生和种间亲缘关系的研究中， 由于种间及种内不同样品系和近缘种中的遗传差异经常反响在唾液腺染色体的不联会、形成泡(puff) 、缢虞 (constriction) 和间带区的伸缩性以及顶体 (telomere) 的形态等多方面的差异，而特别重要的是研究它的基因序列的差异 ( 观察可否产生了例位以及染色体的

6、断裂、 交融和重排 ) 所以，无论从细胞遗传学的角度研究基因与突变性状之间的联系， 还是从进化遗传遗传学方面研究染色体的系统发生， 商议种间以及近缘种间的遗传差异和生殖隔断的体系等， 唾液腺染色体的解析研究都是十分重要的从其横纹分布特点可对物种的进化特点进行比较解析， 而一旦染色体上发生了缺失，重复，倒位。易位等结构变化，也可较简单地在唾液腺染色体上观察鉴别出来。三、仪器设备及资料，试济仪器设备： 解剖镜，显微镜，恒温培养箱，镊子，解剖针，载玻片及盖玻片，吸水纸解剖镜，显微镜，恒温培养箱，镊子，解剖针，载玻片及盖玻片。资料 : 黑腹果蝇（ Drosophila melanogaster ）三龄

7、幼虫（选择行动迟缓、肥大、爬在管壁上既将化蛹的三龄幼虫， 利用这样的唾液腺细胞才能制备出理想的染色玻片标本）（图四）（图四）试剂：醋酸洋红液，蒸溜水，浓盐酸， Ephrussi-beaclle 生理盐水四、实验步骤（一）资料准备：在一干净载玻片上滴一滴生理盐水，选择行动迟缓、肥大、爬在管壁上马上化蛹的三龄幼虫放于生理盐水中（二）剥离唾腺：在解剖镜下左手持解剖针按压住幼虫后端 13 处。固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器处， 合适用力向后拉， 把头部与身体拉开， 唾液腺腺体随之而出， 再用解剖针先将含有腺体的一团组织与其余组织分开 尔后再将腺体与脂肪等组织分开 获取果蝇唾液腺。 （果蝇的唾液

8、腺是位于口器后端神经节两侧的一对透明而微白的近似香蕉形的长形小囊， 由单层细胞组成。细胞大，细胞核大，细胞轮廓清楚（图五）脂肪体 唾液腺 （图五）(图六 )（三）低渗办理：在载玻片上滴一滴低浓度的Nacl溶液对唾液腺办理10-15min,使其细胞充分吸水而简单弄破。（四） 解离 : 用滤纸吸取低浓度 Nacl, 再在载玻片上滴一滴 lmol L HCI，让唾液腺在 lmol L HCI 中解离 40-60 分钟 (!) ，以柔嫩组织，利于染色体分别。（五）染色 ：解离后的腺体可用水冲洗 2-3 次后滴 2 滴品红染液染色 20 分钟。 ( 注：解剖和染色过程勿使腺体于燥， 在酒精灯上加热以增强

9、染色收效。 可以不经解离一步而直接染色， 也可以在将幼虫头部与身体拉开后马上加染液染色， 尔后慢慢剖离腺体 )（六）压片： 当腺体被染成红色后，用滤纸擦去染液周围一圈的黑色积淀物，再用蒸馏水冲洗 23 次，尔后加上盖玻片，在盖玻片上方再植盖一层滤纸，再用拇指按住盖玻片用力下压，把腺体细胞压破，把染色体压散开（注：压片晌放载玻片的桌面要干， 不要使盖片滑动。 制好的玻片标本用蜡封住盖玻片周围以防干燥。经低温冷冻办理的资料经解离，染色加盖片后不用敲击镜检即可看到分别优异的染色体。 ）（七）镜检： 将制好的片子先用低倍显微镜观察。 找到好的染色体于视野中心，再用高倍镜油镜观察。若是制片理想，可做成永

10、久制片。注意事项 : 1. 必然加生理盐水，否则唾腺易干。2.水不可以太多，否则幼虫会飘扬而且活跃。如水多了，请再剥离唾腺前吸走些，唾腺剥离后请勿吸水，以防将唾腺一起吸走。3.除去脂肪组织时要量力而为。4.染色液勿过多，否则压片晌唾腺易随染色液漂走。如染色时间到后，染色液已干，应再少加些染色液，再盖上盖波片，防备气泡产生。5.压片晌要均匀用力，轻敲盖片。五、实验结果：在显微镜下我们看到的结果以下结论 :1.四对多线染色体的着丝粒区聚合成为一个，今后中心伸出 5 个长臂和个短臂。2.多线染色体中平行排列的染色质在各段凝缩亲密程度不同样形成（ 85%呈带纹区深染，15%呈间带区浅染）。3.每一臂上

11、所有的横纹的大小和地址是恒定的，即拥有种的特点。4.如染色体出缺失、重复、倒位、易位等，很简单在唾腺染色体上鉴别出来。六、思虑与谈论1.何谓线染色体（你重新思虑一下）答： 1 一种缆状的巨型 染色体 ，见于有些生物生命周期的某些阶段里的某些 细胞 中。由核内 有丝分裂 产生的多股染色单体平行排列而成。各染色单体上的染色粒（见 灯刷染色体 ）并排排列，组成多线染色体的带，带与带之间则称间带。多线染色体的这种结构可用光学显微镜观察，也能在多线染色体上用原位分子杂交法进行基因定位，并就其结构与功能之间的关系进行系统研究，所以是 细胞学 和遗传学 研究的适用资料。核内 DNA 多次复制产生的子染色体平

12、行排列 , 且体细胞内同源染色体配对 , 亲密结合在一起 , 从而阻拦了染色体纤维进一步聚缩, 形成体积很,大的由多条染色体组成的结构叫多线染色体。多线化的细胞处于永久间期体积也相应增大 , 它存在于双翅目昆虫的幼虫组织内, 如唾液腺、气管等。2.如何差异你看到的就是唾腺染色体？答：（1）由于在唾液腺细胞中 8 条染色体之间以着丝粒互相连结在一起形成染色盘或异染中心和同源染色体之间的假联会， 经碱性染料染色后， 可以观察到一个染色较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的 5 条染色体臂。 (2)在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同样， 被称做明带、 暗带的横纹， 这些横纹的地址，宽窄、数目都拥

13、有物种的特异性。不同样物种，不同样染色体的不同样部位形态地址是固定的。所以依照染色体各条臂带纹特点和各条臂端部带纹特点能正确鉴别各条染色体。 (3) 在染色体臂上还可看到某些带纹经过染色体的解旋、膨大形成的松懈区和巴尔比尼氏环，其富含转录出来的 RNA，所以不着色。（4）唾液腺细胞处于永久初期，染色体解旋呈伸展状态在幼虫发育过程中细胞核中的DNA多次复制，但细胞、细胞核不分裂。复制后的染色单体 DNA不分开，从而形成了多线染色体（ 5）每一臂上所有的横纹的大小和地址是恒定的，即拥有种的特点。3.在昆虫学中，二龄幼虫，三龄幼虫有何生物学意义？（重新思虑）答： 果蝇是完满变态发育的生物之一， 二龄

14、幼虫，三龄幼虫是其变态发育的重要特点。从初生卵发育至新羽化的成虫为一个完满的发育周期，在25， 60相对湿度条件下，大体为 10 天。经过控制养殖的温度，可以加速和减缓果蝇的发育。果蝇个体很小，幼虫在三龄时达到最大，约 2 毫米，成年果蝇也仅为 2 3 毫米。新羽化的雌性成虫大体 8 小时此后即可进行交配，交配此后大体 40 小时开始产卵， 第 4-5 天出现产卵巅峰。 性成熟雌性果蝇生殖能力很强，产卵初期每天可达 50 70 枚，累计产卵可达上千枚。黑腹果蝇是最宽泛应用于遗传学的果蝇， 也是确定经典遗传学基础的重要模式生物之一，对其染色体组成和表型、 基因编码和定位的认识， 是其余生物无法比

15、较的。基于清楚的遗传背景和便利的遗传操作，果蝇在发育生物学、生物化学、分子生物学等领域也都占有了不可以取代的地址。 随着神经科学的流行， 好多遗传操作在该领域不断发展和成熟，为在果蝇中进行神经科学的研究打下了牢固的基础。总之，果蝇在近一个世纪以来的生物学舞台上占有举足轻重的地位， 在各个领域的宽泛应用使其成为一种理想的模式生物， 无论在过去、现在和将来都将为人类研究生命科学的真谛做出不可以磨灭的贡献。参照文件：图一、图二： 图三：loadfile/201008/20100806041103666.jpg图四： 图五：余幼芳 俞佩芳 ( 华东师范大学生命科学学院 上海 200062) 生物学授课 2007年( 第32卷 ) 第 11图六：http:/202.207.208.44/jxzx/smkxyjzx/dmtkj/yc/%B9%FB%D3%AC%CD%D9%CF%D9 %C8%BE%C9%AB%CC%E5%B5%C4%B9%DB%B2%EC实验.ppt#266,9,原理注意：每个图的注明方法按