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1、000001a3栗志文应用药理即溶普洱茶珍不同给予方式对KKAy小鼠降糖效果的影响栗志文，王根辈，何 莹，曹 晶，张莉华，郭嘉华，马晓慧，朱永宏*（天津天士力集团研究院药理毒理所，天津 300410）摘要 目的：比较不同给予方式对于普洱茶珍降糖功效的影响，为适用人群合理饮用普洱茶珍提供理论依据。方法：以C57BL/6J小鼠作为对照组，KKAy小鼠随机分为糖尿病模型组、普洱茶珍灌胃组（0.375、0.75、1.5gkg-1d-1）、普洱茶珍自由饮用组（0.375、0.75、1.5gkg-1d-1）和罗格列酮组8组，连续给药30d，检测小鼠体重、进食量、饮水量、空腹血糖、糖耐量和血清胰岛素等指标。

2、结果：灌胃普洱茶珍及自由饮用普洱茶珍均能降低KKAy小鼠进食量，抑制体重增长，减少饮水量。灌胃普洱茶珍1.5gkg-1d-1才能产生明显的降低空腹血糖作用，而自由饮用普洱茶珍从0.375gkg-1d-1到1.5gkg-1d-1剂量范围均能产生明显降低空腹血糖的作用，且饮用后期逐渐呈现明显的量效关系。在糖耐量实验中，相同给药剂量自由饮用普洱茶珍比灌胃普洱茶珍餐后血糖和AUC降低更加明显。两种给药方式在改善胰岛素抵抗方面无明显差异。结论：灌胃与自由饮用两种给予方式对于普洱茶珍降糖功效存在一定的影响，自由饮用的给予方式更能发挥普洱茶珍的降糖作用。关键词即溶普洱茶珍、型糖尿病、空腹血糖、糖耐量、胰岛素

3、抵抗、KKAy小鼠中国图书分类号R 965 文献标识码AAnti-Diabetic Activity of Deepure Bio-Puer Tea In Diabetic KK-Ay Mice with Different AdministrationsLI ZhiWen, WANG GenBei, HE Ying, CAO Jing, GUO JiaHua, MA XiaoHui, ZHU YongHong* (Pharmacology and Toxicology Department of Tasly R&D Institute, Tianjin Tasly Group Co., Lt

4、d., Tianjin 300410, China)ABSTRACT OBJECTIVE: To evaluate the anti-diabetic activity of Deepure Bio-Puer Tea (DBPT) by different administration route, and to provide a theoretical basic for application of Deepure Bio-Puer Tea. METHODS: KKAy mice were randomly divided into the model group, DBPT-ig gr

5、oup (0.375、0.75、1.5gkg-1d-1) , DBPT-drinking freely group (0.375、0.75、1.5gkg-1d-1) and positive control group (Rosiglitazone) and C57BL/6J mice were taken as the normal group. The body weight, food-intake, water-intake, fasting blood glucose, oral glucose tolerance, and the serum levels of insulin w

6、ere measured. RESULTS: Deepure Bio-Puer Tea with the two kinds of administrations decreased the food-intake and the amount of water drinking, reduced the weight growth of KKAy mice. After DBPT was given to mice by intragastric administration 1.5gkg-1d-1 and by drinking with the range of dose from 0.

7、375gkg-1d-1 to 1.5gkg-1d-1 for 1 week, fasting blood glucose of KK-Ay Mice were decreased significantly. And the obvious dose-effect relation was observed in drinking group from week 2 to 4. Blood glucose concentration and glucose tolerance AUC area of the drinking group is significantly lower than

8、that of intragastric administration with the same dose. The two administrations of DBPT improved insulin sensitivity without significant difference. CONCLUSION: The results demonstrated that the two administrations show the different effect on the anti-diabetic activity of DBPT. Drinking DBPT shows

9、better anti-hyperglycemic and insulin-sensitizing activity in Diabetic KK-Ay Mice compared to the intragastric administration of DBPT. KEY WORDSDeepure Bio-Puer Tea；Fasting Blood Glucose；Glucose Tolerance；Insulin Resistance；KKAy Mice帝泊洱即溶普洱茶珍（简称茶珍，Deepure Bio-Puer Tea，DBPT）是选用云南省普洱市优质大叶种普洱茶（熟茶）为原料，经

10、生态种植、现代生物发酵、高科技萃取，制成纳米级的高纯度普洱茶提取物。 传统的饮茶方式使人们养成了休闲时才能喝茶的饮茶习惯，帝泊洱即溶普洱茶珍力求化繁为简，通过先进工艺确保适用人群可以随时随地任意饮用，使饮茶习惯更人性化。通常不同的给药方法，可以影响药物的吸收速度、利用程度、药效出现时间及维持时间。本实验设计了灌胃给药和自由饮用两种不同给予方式，通过药效对比，比较不同给予方式对于普洱茶珍降糖功效的影响，筛选最佳的给予方式，为适用人群合理饮用即溶普洱茶珍提供理论依据。1实验材料 1.1实验动物 KKAy小鼠（SPF级），7-8周龄，102只，、各半；C57BL/6J小鼠（SPF级），7-8周龄，1

11、0只、各半。均由中国医学科学院实验动物所提供，合格证号：SCXK(京)2009-0004。1.2饲养条件 在SPF级动物饲养室分笼饲养，温度19-26，相对湿度4070% ，每笼1只，照明时间12小时，定时添加足量饲料，定时添加足量饮水。KKAy小鼠饲料为灭菌专用高脂饲料，由中国医学科学院实验动物研究所生产；C57BL/6J小鼠饲料为灭菌普通饲料，由北京科澳协力饲料有限公司生产。每日更换垫料。1.3主要试剂和药品 帝泊洱即溶普洱茶珍，云南天士力生物茶科技有限公司，批号20100119；马来酸罗格列酮片，葛兰素史克（天津）有限公司，规格：4mg/片，批号：09060016；Rat/mouse I

12、nsulin ELISA Kit购于美国MILLIPORE公司（批号：ST2347EN00）；血糖测试试剂(BIOSEN 5030型血糖/乳酸分析仪配套试剂)。 1.4实验仪器 BIOSEN 5030型血糖/乳酸分析仪，德国EKF公司制造；Infinite200多功能酶标仪，瑞典TECAN公司制造。2实验方法 2.1 空腹血糖测定方法：所有动物均禁食（自由饮水）5h，剪尾取末梢血10l，用BIOSEN 5030型血糖/乳酸分析仪测定空腹血糖。2.2 分组及给药：动物适应性喂养一周后按照空腹血糖测定方法测定空腹血糖，按实测空腹血糖值分层随机分组。102只KKAy中选取空腹血糖14.9 mmol/

13、L的入组，随机分为8组：糖尿病模型组（n=11）组；阳性药组（1.33mgkg-1d-1，n=11）；茶珍灌胃低剂量组（0.375gkg-1d-1，n=11）；茶珍灌胃中剂量组（0.75gkg-1d-1，n=11）；茶珍灌胃高剂量组（1.5gkg-1d-1，n=11）；茶珍自由饮用低剂量组（0.375gkg-1d-1，n=11）；茶珍自由饮用中剂量组（0.75gkg-1d-1，n=11）；茶珍自由饮用高剂量组（1.5gkg-1d-1，n=11）。正常C57BL/6J小鼠（n=10）做对照组。茶珍自由饮用各组普洱茶珍配成普洱茶珍饮用液作为动物饮用水，由动物自由饮用。根据测定的动物体重及饮水量平均

14、值计算应配制的普洱茶珍饮用液浓度，每周根据新的体重及饮水量进行相应调整，保证各组动物茶珍饮用量达到0.375gkg-1d-1、0.75gkg-1d-1和1.5gkg-1d-1的剂量要求。茶珍灌胃各组、阳性药组每日灌胃1次，对照组予等量生理盐水灌胃。2.3 观察指标：2.3.1 日常观察指标实验期间观察动物精神、活动、毛色、及尿量粪便变化情况；每周定量测定一次饮水量、进食量及体重。2.3.2 空腹血糖测定方法分组前及给药后7d、14d、21d、28d分别尾静脉取血测空腹血糖值。所有动物均禁食（自由饮水）5h后取血，灌胃组于取血前1h给药，取血时断尾取末梢血10l，用BIOSEN 5030型血糖/

15、乳酸分析仪测定空腹血糖，比较各组动物血糖值。2.3.3 糖耐量实验观察指标及检测方法 给药后最后一天动物禁食5h（自由饮水），灌胃组于取血前1h给药，禁食结束时经口给予葡萄糖2.0gkg-1，测定给葡萄糖后0h、0.5h、1h、2h的血糖值，观察各组给予葡萄糖后各时间点血糖值的变化，并计算血糖曲线下面积。血糖曲线下面积（AUC）1/2（0h血糖值0.5h血糖值）0.51/2（0.5h血糖值1h血糖值）0.51/2（1h血糖值2h血糖值）1。2.3.4 空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数测定动物给予普洱茶珍30d后禁食不禁水12h，腹腔注射水合氯醛麻醉，眶静脉取血，常温静置30min，2500g10mi

16、n 4离心，分离血清，采用用双抗夹心酶免法（ELISA）按照试剂盒说明书步骤测定空腹胰岛素。胰岛素抵抗指数（Insulin Resistance Index, IRI）根据HOMA Model计算，计算公式是：IRI=空腹血清胰岛素（FINS）空腹血糖（FBG）22.5。2.3.5 数据处理及结果判定计量资料以均数标准差（）表示。应用SPSS11.0统计软件分析，多样本均数的两两比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。两变量的关联性采用线性相关分析。3实验结果 3.1 一般情况实验期间正常对照组C57BL/6J小鼠精神状态良好，反应灵敏，动作自如，皮毛有光泽，进食量、饮水量稳定，

17、体重持续增加。模型组KKAy小鼠随着周龄的增长逐渐出现精神萎靡，反应迟钝，动作迟缓，皮毛失去光泽。各给药组小鼠毛发光亮，精神佳。3.1.1 动物体重变化结果实验期间模型组体重随给药周期的延长稳步增长。各给药组动物体重随着给药周期的延长，出现不同程度的下降。给药4周后，阳性药与模型组相比差异显著（p0.01），茶珍灌胃高剂量组与模型组相比差异显著（p0.01），茶珍饮用各剂量组体重明显下降，与模型组相比差异极显著（p0.001）。见表1。表1 不同给药方式对KKAy小鼠体重变化的影响（，g）Tab. 1 The effects of different administration method

18、s on the weight of KKAy mice（，g）3.1.2 动物进食量变化结果模型组动物进食量明显高于正常对照组，实验期间模型组动物进食量变化不大，各给药组动物进食量均出现不同程度的下降。结果见表2。表2 不同给药方式对KKAy小鼠进食量的影响（, g）Tab. 2 The effects of different administration methods on the food-intake of KKAy mice（, g）3.1.3 动物饮水量变化结果模型组动物饮水量明显高于正常对照组，实验期间模型组动物饮水量变化不大，各给药组动物饮水量均出现不同程度的下降，特别是阳

19、性药组及茶珍饮用组下降明显。结果见表3。 表3 不同给药方式对KKAy小鼠饮水量的影响（，ml）Tab. 3 The effects of different administration methods on the water-intake of KKAy mice（，ml）3.2 不同给药方式对空腹血糖的影响在4周的给药周期中，模型组动物血糖值呈逐步升高的趋势。阳性药组从给药的第一周空腹血糖值即低于模型组（p0.01）。茶珍灌胃除高剂量组与模型组比较有统计学差异，中、低剂量组均未显示明显的降空腹血糖作用。茶珍饮用低、中、高三个剂量组从给药第一周开始空腹血糖值明显低于模型组（p0.001）

20、。实验结果表4。表4 不同给药方式对KKAy小鼠的空腹血糖影响（mmol/L）Tab. 4 The effects of different administration methods for FBG in KKAy mice（mmol/L）3.3 不同给药方式对糖耐量的影响普洱茶珍饮用各剂量组在灌胃外源性葡萄糖后0.5h、1h血糖升高程度明显较模型组低（p0.01、p0.001），AUC与模型组比较有明显统计学意义（p0.05、p0.001）。普洱茶珍灌胃高、中剂量组AUC与模型组比较有统计学意义（p0.05、p0.01）。结果见表5、图1。表5 不同给药方式对KKAy小鼠不同时间点血糖及

21、葡萄糖耐量的影响（mmol/L）Tab. 5 The Statistics of DBPT for BG of different times and glucose tolerance in KKAy mice with different administration methods（mmol/L）图1 普洱茶珍不同给药方式葡萄糖耐量的血糖曲线下面积（AUC）统计Fig1 The Statistics of Deepure Bio-Puer Tea for AUC in KKAy mice with different administration methodsdifferent adm

22、inistration methods（mmol/L）3.4 不同给药方式对动物空腹血清胰岛素及胰岛素抵抗指数的影响模型组的空腹血清胰岛素及胰岛素抵抗指数明显高于阴性对照组（p0.001），阳性药组、普洱茶珍灌胃各组、普洱茶珍饮用各组的空腹血清胰岛素及胰岛素抵抗指数与模型组比较差异显著（p0.001）。实验结果见图2。图2 普洱茶珍不同给药方式胰岛素抵抗指数影响的统计Fig 2 The Statistics of Deepure Bio-Puer Tea for Fasting Insulin in KKAy mice with different administration methods

23、 administration methodsdifferent administration methods（mmol/L）4讨论KKAy小鼠是一种多基因遗传性2型糖尿病动物模型鼠，是在遗传易感的基础上加环境因素而诱发，具有型糖尿病的特征，与人类型糖尿病表现极为相似，被学术界视为型糖尿病理想动物模型；而C57BL/6J小鼠与KK小鼠基因型相同，普通饮食下无糖尿病发生，常作为其对照组。本实验结果显示，高脂喂养12周KKAy小鼠可出现典型胰岛素抵抗症状（高血糖、高胰岛素、糖耐量下降，HOMAIR高）。本研究以KKAy糖尿病小鼠为研究对象，研究方法成熟、简便、重复性好，适宜于探讨普洱茶珍不同给药方

24、式降糖效果的筛选和研究。通过对实验期间动物进食量、饮水量及体重变化的观察发现，糖尿病小鼠普遍发生多饮、多食、多尿等情况。灌胃普洱茶珍及自由饮用普洱茶珍均能降低糖尿病小鼠进食量，抑制KKAy小鼠的肥胖趋势，在减少糖尿病小鼠饮水量方面自由饮用普洱茶珍效果更佳，自由饮用普洱茶珍“消渴”作用更明显。本实验研究表明灌胃普洱茶珍1.5gkg-1d-1才能产生明显的降低空腹血糖作用，而自由饮用普洱茶珍从0.375gkg-1d-1到1.5gkg-1d-1剂量范围均能产生明显降低空腹血糖的作用，且饮用后期逐渐呈现明显的量效关系。糖耐量实验结果表明，在相同给药剂量的前提下自由饮用普洱茶珍比灌胃普洱茶珍餐后血糖和A

25、UC降低更加明显，结果提示自由饮用普洱茶珍对外源性葡萄糖的耐受性更强。胰岛素抵抗（或组织的胰岛素敏感性）是糖尿病重要的发病原因，是研究糖代谢紊乱病因及其与并发症联系的重要指标1。各组动物在给药30d后，模型组的空腹血清胰岛素和胰岛素抵抗指数明显高于阴性对照组，证明该实验动物为胰岛素抵抗的典型模型。本研究结果发现灌胃普洱茶珍和自由饮用普洱茶珍均可明显降低动物空腹血清胰岛素及胰岛素抵抗指数，推测普洱茶珍可能具有改善组织对胰岛素的抵抗作用，增加胰岛素敏感性，从而具有降低机体空腹血糖的作用。本研究结果与文献报道相符2-3。在改善胰岛素抵抗，增加胰岛素敏感性方面自由饮用给药方式趋势更明显，但两种给药方式

26、无统计学差异。综上所述，通过一系列药效比较，灌胃与自由饮用两种给予方式对于普洱茶珍降糖功效存在较大影响，自由饮用的给予方式更能发挥普洱茶珍的降糖作用。传统的饮茶习惯休闲时大量喝茶，不能最好的发挥普洱茶珍降糖的功效，根据实验研究结果高血糖人群在饮用即溶普洱茶珍时应合理选择饮用方式，养成随时随地任意饮用即溶普洱茶珍的饮茶习惯，以最大化的发挥即溶普洱茶珍的辅助降糖作用。 参考文献1 Wang L S , Lin L C , Chen N T , et al. Hypolipidemie efect and anfiatherogeaic potential of Pu-Erh teaJ. ACS S

27、ymp, Ser, 2003(859):87-103.2 WANG FEN, HE HUALIANG, JIANG NAN, et al. The effection of tangnai-kang for insulin signal-transduction in spontaneous type-diabetic animal KKAy mouseJ,Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae(中国实验方剂学杂志),2008,14(1):46-50.3 ZHANG XINFU, GONG JIASHUN, ZH

28、OU HONGJIE, et al. Study on relationship between polyphenols and quality of yunnan Pu-erh teaJ.Food Sciences(食品科学),2007, 28(1):230-234.表1 不同给药方式对KKAy小鼠体重变化的影响（，g）Tab. 1 The effects of different administration methods on the weight of KKAy mice（，g）GroupDosenWeek 0Week 1Week 2Week 3Week 4Control1020.8

29、0.722.92.624.12.924.22.725.63.3KKAy Model1135.31.936.32.338.23.340.93.643.03.8Positive drug group1.33mgkg-1d-11135.62.635.91.836.62.537.92.239.02.2DBPT-ig-low dose0.375gkg-1d-11135.72.236.61.938.21.839.11.842.04.4DBPT-ig-middle dose0.75gkg-1d-11135.83.137.53.638.63.539.13.340.13.4DBPT-ig-high dose1.

30、5gkg-1d-11135.41.834.12.934.92.637.32.738.12.8DBPT-drinking freely-low dose0.375gkg-1d-11135.11.633.92.034.21.536.21.937.72.2DBPT-drinking freely-middle dose0.75gkg-1d-11135.32.733.22.333.52.236.52.337.62.6DBPT-drinking freely-high dose1.5gkg-1d-11135.71.933.52.033.642.534.72.736.93.0Note: compared

31、with the model group, p0.05, p0.01, p0.001；表2 不同给药方式对KKAy小鼠进食量的影响（，g）Tab. 2 The effects of different administration methods on the food-intake of KKAy mice（，g）GroupDosenWeek 0Week 1Week 2Week 3Week 4Control103.51.03.41.03.30.83.21.73.82.4KKAy Model115.61.15.91.16.01.25.91.06.00.9Positive drug group1.33mgkg-1d-1115.41.15.41.05.20.75.21.04.61.4DBPT-ig-low