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1、PCR技术 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR），是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法，也是分子生物学实验最常用到的一种方法。根据适用对象的不同，又有荧光实时PCR、逆转录PCR等区别。本专题详细介绍了PCR实验的基本原理、步骤及常见问题的解决办法。第一部分:PCR的基础知识第一章:聚合酶链式反应(PCR)的历史和发展本文章内容包括:聚合酶链反应的历史回顾、聚合酶链反应相关技术的发展、其它体外核酸扩增技术、PCR技术的应用举例。第一节：聚合酶链反应的历史回顾1、核酸体外扩增最早的设想由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性

2、，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人 们遗忘。2、聚合酶链反应的发明直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA的体内 复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用

3、大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。二、聚合酶链反应相关技术的发展PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和 英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用 与技术本身的优化问题；第二届会议的主

4、要议题是人类基因组计划与PCR的最新进 展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。(表)聚合酶链反应的相关技术名称 主要用途 简并引物扩增法 扩增未知基因片段 巢居PCR 提高PCR敏感性、特异性，分析突变 复合PCR 同时检测多个突变或病原 反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变 单一特异引物PCR 扩增未知基因组DNA 单侧引物PCR 通过已知序列扩增未知cDNA 锚定PCR 分析具备不同末端的序列 增效PCR 减少引物二聚体，提高PCR特异性 固着PCR 有利于产物的分离 膜结合PCR 去除污染的杂质或PCR产物残留 表达盒PCR 产生合成或突变蛋白质的DNA片段 连接介导PC

5、R DNA甲基化分析、突变和克隆等 RACE-PCR 扩增cDNA末端 定量PCR 定量mRNA或染色体基因 原位PCR 研究表达基因的细胞比例等 臆断PCR 鉴定细菌或遗传作用 通用引物PCR 扩增相关基因或检测相关病原 信使扩增表型分型(mapping) 同时分析少量细胞的mRNA 三、其它扩增技术与PCR及其相关技术发展的同时，新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利 弊，与PCR互为补充，有的可结合应用，共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我 们相信，随着分子生物学技术的发展，这一家族一定会再涌现出新成员。其它体外核酸扩增技术(表)技术应用转录依赖的扩增系统(TAS)检测HIV连接酶链反

6、应(LCR)检测点突变自主序列复制(3SR)系统研究RNA，临床应用、法医学等链替代扩增(SDA)检测、鉴定基因Q复制酶系统增加探针检测敏感性循环探针反应增加探针检测敏感性连接酶链反应 (A)连接酶链反应(Ligasechainreaction，LCR),是一种新的DNA体外扩增和检测 技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。是Backman1997年为检出靶基因序列 中的点突变而设计发明，并申报了专利。LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接,经变性-退火-连 接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循

7、环，94min变性 和65复性并连接，循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用 点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多 态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。依赖核酸序列的扩增 (A)依赖核酸序列的扩增(Nucleicacidsequence-based amplification, NASBA) ，又称自主序列复制系统(self-sustainedsequencereplication，3SR)或再生长 序列复制技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术。NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序

8、。其基本方法为：将引物,标本加入扩增反应液，651min使RNA分子二级结构打 开,降温至37加入逆转录酶,T7RNA聚合酶和RNaseH,并在37反应11.5小时,其 产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。转录依赖的扩增系统 (A)转录依赖的扩增系统(Transcript-basedamplificationsytem，TAS)，是 Kwen等人于1989年研究报道的，主要用于扩增RNA。TAS的主要特点是扩增效率高，因为其RNA拷贝数呈10

9、的指数方式增加，只需6个 循环靶序列的拷贝数就能达到2106。它的另一个特点是特异性高，由于TAS只能进行 6次温度循环，错掺率低，加之用葡聚糖珠夹心杂交，因而特异性也高。虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和 T7RNA多聚酶，有待进一步研究。Q复制酶反应 (A)Kacian等于1972年首次报报Q复制酶(Q-betareplicase)催化RNA模板的自我 复制功能，它能在常温30min，将其天然模板MDV-1RNA扩增至109。1986年Chu等报道 用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交，经洗脱未被结合 的MDV-1后，再加入

10、Q复制酶，扩增复制MDV-1拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同 源性的第二探针杂交。Q复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点：不需寡核苷酸引物的引 导就可启动RNA的合成。能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有 的RNA折叠结构。在Q复制酶的天然模板MDV-1RNA的非折叠结构区插入一短的 核酸序列不影响该酶的复制。因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被 Q复制酶扩增。1988年Lizardi等，将靶基因序列插进MDV-1质粒里，用T7RNA聚合酶催化转录 出MDV-1RNA探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针,加入Q 复制酶来扩增探针，被

11、扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增。其产物 按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复 制等技术。四、PCR技术的应用举例：研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结 合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆 或表达载体；检测某基因的内切酶多态性诊断：细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致 病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等)；病毒(HTLV、HIV、HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19)；寄生虫(疟疾

12、 等)；人遗传病(Lesh-Nyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等)免疫学：HLA分裂；T细胞受体或抗体多样化的定性；自身免疫病基因作图；淋 巴因子定量人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱法医：犯罪现场标本分析；HLA-DQ肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；生态学；环境科学；实验遗 传学。古生物学：考古与博物馆标本分析动物学：动物传染病的诊断等植物学：检测植物病原等第二章：PCR的基本原理和概念 1983年美国PE

13、-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(polymerase chain re action，PCR)，1985年公开报道，使人们能在试管内以几小时的反应将DNA扩增109倍。 1987年PCR得到美国的专利权，PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，并形成了巨大的市场，有人预言，本世纪末PCR产值可达到4x108美元。本章介绍PCR的原理、常用的各种PCR方法及主要应用范围。 一、基本原理 DNA在细胞中的复制是个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋

14、等结构的若干酶与蛋白质因子等。 PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。PCR的具体过程如下： 将PCR反应体系升温至95左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3端与5端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷

15、酸序列的互补方式依次加至引物的3端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为2n倍。当经30次循环后，DNA产量达230拷贝，约为109个拷贝。PCR扩增过程见图8-1。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）n，R为扩增效率。 二、参与PCR反应体系的因素及其作用 参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪等。现对它们的作用介绍如下： (一)模板核酸 用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录

16、生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。 PCR反应时加入的DNA模板量一般为100-100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的碱基错配。 通常模板DNA用线性DNA分子，若为环状质粒，最好先用酶将其切开成线状分子，因为环状DNA复性太快。 (二)引物 引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。因此，引物设计决定PCR反应的成败。 PCR反应中有两种引物，即5端引物与3端引物。5端引物是指与模板5端序列相同的寡核苷酸，3端引物是指与模板3端

17、序列互补的寡核苷酸。对引物的基本要求有：引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有16-30bp，因为416=4.29x109，已大于哺乳动物基因组3x109bp，保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74度)，亦会影响产物的特异性。G+C的含量一般为40-60。四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。尤其是引物3端，不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应互补，尤其是它们的3端不应互补。一对引物之间不

18、应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体。引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。引物3端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3端A影响最大，因此，尽量避免在引物3端第一位碱基是A。引物3端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。引物5端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等，引物的设计最好以电脑软件进行指导。 反应体系中，引物浓度一般要求在O.1-0.5mol之间。浓度太高，容易生成引物二聚体，

19、或非特异性产物。 引物Tm值与退火温度有关，计算公式为：Tm=4(G+C)+2(A+T)。引物Tm值最好在55-80范围，以接近72为最好。 (三)耐热的TaqDNA聚合酶 1976年Chien分离出热稳定聚合酶，1986年Erlich分离并纯化了适于PCR的Tq热稳定性聚合酶，为PCR成为实用技术奠定了基础，现已用基因重组生产。日前可用于PCR的聚合酶有多种：有从水生栖热菌中提取的Taq酶、从嗜热栖热苗中获得的Taq酶、从Litoralis栖热球菌中分离的VENT酶、及从酸热浴硫化裂片苗中分离的Sac酶，而以Taq酶用得最广泛。Taq DNA聚合酶分子量为94kD，75时酶比活性为150bs

20、/酶分子，反应温度过高或过低均影响其延伸率，Taq蕾有很高的耐热稳定性。实验表明，在92.5、95、97.5时，其半衰期分别为40min、30min和5min。 纯化的Taq酶在体外无3-5外切酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。通常，30次循环Taq酶的错配率约为0.25，高于Klenow酶的错配率。Taq酶在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000。应用低浓度的dNTP(各20molL)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10-

21、6次/（核苷酸*循环）。 Taq酶具有类似于末端转移酶的TdT的活性，可在新生成的双链产物的3端加上个碱基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲将PCR产物克隆到载体上，可以用两种处理办法：一是构建dT-载体；二是用Klenow酶将3端的A去掉，即在PCR反应后，先在99加热10min灭活Taq酶，调整Mg2+浓度至5-10mmol/L，加入1-2U Klenow片段，室温下作用15-20min，3端的A即被切去， Taq酶还具有反转录活性。在2-3mmol/L Mg2+浓度下68时出现类似反转录酶的活性。若有Mg2+存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的

22、扩增。 以往用Taq酶进行PCR扩增，一般只能扩增小于400bp的DNA片段，经过对酶的结构与功能的改造，以及PCR方法学的改进，现已能扩增20kb以上的DNA分于。 Taq酶在PCR反应中加入的量也很重要，太少当然不好，太多一方面浪费，同时也导致非特异性扩增，通常每lOOl反应液中含1-2.5U Taq酶为好。最好在0.5-5U范围内确定最佳酶浓度。另一个问题是，虽然Taq酶是热稳定性较好的工具酶，也应注意在-20贮存。 (四)缓冲液 缓冲液提供PCR反应合适的酸碱度与某些离子，常用10-50mmol/L。Tris-HCI(pH8.3-8.8)缓冲液。缓冲液中含有50mmol/L KCl有利

23、于引物的退火。有人并加入小牛血清白蛋白(100g/L)或明胶(0.0)或Twen20(0.05-0.1)或二硫基苏糖醇(DDT，5mmol/L)等，认为这些物质可以保护Taq酶。 (五)Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低；Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等。Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，而PCR反应体系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+的游离浓度。因此，Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2-0.25mmol/L

24、。如果反应体系中含有EDTA等螯合剂，也可结合掉一部分Mg2+。 为了获得Mg2+的最佳浓度，可用下面的优化法。首先在PCR缓冲液小不加入Mg2+，从配置的10mmol/L的Mg2+储存液中取一定量加入到各反应管中，开始以0.5mmol/L的浓度梯度递增(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,5.0mmol/L)，由PCR反应后的电泳结果可确定Mg2+大概浓度范围，再在该浓度的上下以0.2mmol/L递增与递减几个浓度来精确确定Mg2+最适浓度。 (六)dNTP dNTP为PCR反应的合成原料。每种dNTP浓度应相等，通常的浓度范围为20-200gmol/L，在此范围内，PCR产物的量、反应

25、的特异性与忠实性之间的平衡最佳。例如，当每种dNTP为20mol/L时，理论上可以产生2.6g的400bp的DNA。使四种dNTP的浓度保持在其Km值(10-15mol/L)以上，可保持碱基掺入的忠实性；若dNTP的浓度大于50mmol/L，则可抑制Taq酶的活性。 (七)反应温度和循环次数 1变性温度与时间 PCR反应中变性这一步很重要，若不能使模板DNA和PCR产物完全变性，PCR反应就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的变性温度愈高。太高的变性温度和时间又会影响Taq酶的活性，通常的变性温度和时间分别为95、30s，有时用97、15s。虽然DNA链在变性温度时两链分离只需几秒钟，

26、但反应管内部达到所需温度还需要一定的时间，团此要适当延长时间。为了保证模板DNA能彻底变性最好为7-10min，然后在以后的循环中，将变性步骤设为95/min。 扩增100-300bp短片段时，还呵以用快速的两步PCR法，即变性(94-97)、退火及延长(55-75)。 为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管内加入1-2滴液体石蜡。 2复性温度和时间 复性温度决定PCR的特异性，合适的复性温度应低于引物Tm值的5。退火温度过低，引起非特异性扩增；增高退火温度，可提高扩增的特异性，因此要严格规定退火温度。退火反应时间一般为1min。 在PCR开始的头一次循环时，反应从远低于Tm值的温度开温，

27、由于Taq酶在低温时仍具有活性，这时就可能因引物与模板非特异性配对面出现非特异性产物或出现引物二聚体 然后在以后整个PCR反应中，非特异性产物反复扩增，而使PCR严重失败。为了尽量消除这种非特异性扩增，可以使用热起动的方式，热起动方法有几种：一种方法是在PCR系统中加入抗Taq酶抗体。抗体与Taq酶结合，使Taq酶活性受抑制。因此在开始时，虽然温度低，引物可与与模板错配，但因Taq酶没有活性，不会引起非特异性扩增；当进行热变性时，抗体在高温时失活，Taq酶被释放，就可发挥作用，在以后的延伸步骤进行特 异的DNA聚合反应。另一种热起动法是用石蜡将Taq酶与PCR反应系统分隔，因此一开始在室温条件

28、下也没有非特异性扩增。当升温到热变性温度下，石蜡熔化，Taq酶与PCR反面系统混合，从而在以后的步骤中发挥作用。使用热起动可以提高PCR扩增的特异性。 3延伸温度与时间 延伸温度一般为72左右，此时Taq酶活性为每秒钟掺入核苷酸35-100个，2kb的片段用1min已足够，若DNA片段较长，扩增时间可适当延长。延伸时间过长又可引起非特异性扩增。 4循环次数 循环次数主要取决于最初靶分子的浓度，例如在初始靶分子为3x105、1.5x104、1x103和50拷贝数时，循环数可分别为25-30、30-35、35-40从40-45。过多的循环次数会增加非特异性产物量及碱基错配数。PCR反应后期，扩增产

29、物的增加并不成为指数方式，称为平台效应。平台效应可能与下列因素有关：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，多次循环后酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸。 (八)PCR仪 有多种进口与国产PCR仪。仪器的升降温方式可有气体加温、水加温及电热块加温等。温度、循环次数及时间等参数现多用电脑控制。可根据需要选择仪器。 由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而引起以后的PCR假阳性。为此，应将PCR仪及PCR产物检测等过程与标本制备及PCR反应管的制备尽量在空间分开，最好在不同的房间进行。通常可将实验空间分为标本处理区、反应混合制

30、备和PCR扩增区、产物分析区等。第三章：引物的稀释和使用1OligoDNA是以OD260单位来计算的，这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1OD260单位，根据此定义，1OD260单位相当于33g的OligoDNA，您可以根据此数据和您的OligoDNA分子量，计算得到摩尔数以计算不同摩尔浓度的溶液。 2引物序列的分子量计算公式如下： MW=（A碱基数312）+（C碱基数288）+（G碱基数328）+（T碱基数303）-61 例如：引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACGA=1C=3G=11T=6 MW=（1312）+（332

31、8）+（6303）-61=6541 3OligoDNA的分子量也可以用以下近似方法计算：OligoDNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一条OligoDNA的分子量=碱基数324.5。 例：您得到一管标为5OD260的20merOligoDNA 分子量=20324.5=6490 质量数=533=165g 摩尔数=165/6490=0.025mol=25nmol 若加灭菌双蒸水400l溶解，则浓度为25nmol/400l=62.5M 4装有引物的eppendorf管一般保存于-20，临用前稀释。 5由于OligoDNA呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前请先离心10,000rpm，1min，然后再慢慢打开管盖。 6在装有引物的eppendorf管内加入100-