铅离子胁迫对丹参幼苗生理活性的影响.docx

1、铅离子胁迫对丹参幼苗生理活性的影响本科生毕业论文（设计）题 目 铅离子胁迫对丹参幼苗生理活性的影响 专 业 生 物 技 术 院 部 生命科学与技术学院 学 号 姓 名 xxxxxxxxxx 指 导 教 师 xxxxxxxxxxxxxxxxxx 答 辩 时 间 xxxxxxxxxx 论文工作时间：2011年 9 月 至 2012 年 5 月铅离子胁迫对丹参幼苗生理活性的影响学 生：xxxxxx指导教师：xxxxxx摘 要：本研究以四川德阳市中江县地区的丹参为实验原材，模拟盆栽试验，研究了丹参在不同浓度铅胁迫条件下的含水量、叶绿素、脯胺酸、丙二醛和生物酶的变化。结果显示，随铅浓度的上升和胁迫时间的

2、增长，含水量下降；在低浓度铅时，叶绿素含量有小程度上升，当铅浓度高时，叶绿素呈下降趋势；在低浓度铅时，丙二醛、脯氨酸、酶活性都随胁迫时间的增长而有一定的上升，维持在相对稳定的水平；当铅的浓度升高时，则含量会有极速的增长。说明了低浓度(0400mg/L)铅对植物生长伤害不明显，而高浓度(400mg/L以上)铅对植物的伤害明显。关键词：丹参；铅；酶；叶绿素Effect of Pb2+ stress on physiological indices of salvia miltiorrhizaUndergraduate:WangJunlong Supervisor: LuoMinghuaAbstra

3、ct: In the paper, the Salvia miltiorrhiza which are planted in Zhongjiang County area in Deyang, Sichuan province were used as eaperimental materials. The moisture content, content of chlorophyll ,content of proline, content of MDA and activity of peroxidase(POD) of the Salvia miltiorrhiza is studie

4、d under different levels of lead stress in this paper. At last, the results display as follows: With the growth of stress time and the concentration of lead, the moisture content will decrease. At low lead concentrations, chlorophyll content will increase in a small degree; at the high lead concentr

5、ations, the chlorophyll content will deacrease in a large scale. At low lead concentration, the content of proline, content of MDA and activity of peroxidase will increase with the growth of stress time and stand in a stable level relatively; at high lead concentration, those will increase quickly.

6、The results showed that the low concentration of lead can promote the growth of plants, however, the high concentration of lead damage the plants obviously.Key words: Salvia miltiorrhiza; lead; POD; chlorophyll目 录1前 言 11.1丹参的研究现状 11.2试验目的 11.3试验意义 12试验材料 12.1试验样品 12.2主要仪器及试剂 12.3主要试剂的配置 23试验方法 23.1试

7、验流程 23.2试验步骤 23.2.1丹参的种植及胁迫 23.2.2测定含水量 23.2.3叶绿素含量的测定 33.2.4脯氨酸含量的测定 33.2.5丙二醛的含量测定 43.2.6酶活性的测定 54结果及分析 54.1含水量的变化 54.2叶绿素含量的测定结果 64.3脯氨酸含量的测定结果 84.3.1脯氨酸的标准曲线 84.3.2脯氨的测定结果 84.4丙二醛含量的测定结果 94.5酶活性的测定结果 105讨论 106结论 117本实验的不足之处 11参考文献 12致 谢 141前言1.1丹参的研究现状丹参为唇形科植物1Salvia miltiorrhiza的干燥根及根茎，始载于神农本草经

8、，被列为上品，历代本草均有收载。其味苦、性微寒，归心、肝二经。具祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效，是一种临床应用广泛的中药。其现代药理作用3,4主要包括舒张冠脉、增加冠脉血流量，具有明显的钙拮抗剂作用；提高心室的顺应性，改善心脏的舒张功能，对缺血心肌和再灌注心脏具有保护作用；抑制内源性胆固醇的合成；增加微循环流速和流量，消除局部静脉血液瘀滞，改善组织细胞缺血、缺氧所致的代谢障碍；具有抗体外血栓形成、抗血小板聚集、抗内外凝血系统功能、减少血小板、促进纤维蛋白原降解作用；具有很强的清除自由基和抗氧化作用等7。随着人类疾病谱的变化，丹参作为能够预防和治疗人类面临的几大危险疾病的植物药之一，它的应用

9、将会更加广泛8。由于人类早期对环境问题的忽略9，产生了一系列的环境问题，特别是重金属的污染已成为一大公害。直接或间接的重金属污染物在自然界中沉积，毒性较大，储蓄性强，难降解，对人类健康具有潜在的危害性。1.2试验目的本研究旨在通过研究铅离子对丹参的生长的影响来确定不同浓度的铅对丹参的作用效果，测定出对丹参生长最为有利的铅离子浓度，从而对丹参的种植做出一定的指导。1.3试验意义本实验所用丹参来源于四川省德阳市中江县地区的丹参根种植所得，因中江地区的丹参为道地药材。研究铅对中江产丹参的影响，有利于合理种植的推广，对提高药品整体水平的质量有很大的帮助。2试验材料2.1试验样品丹参幼苗2.2主要仪器及

10、试剂移液管； 申溢牌电热不绣钢蒸馏水器（上海三中医疗器械有限公司出产）； 双燕牌冰箱（博西华家用电器有限公司出产）； 恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司出产）； 高速冷冻离心机（贝克曼库尔特实验系统有限公司广州分公司）； 电子万用炉（北京市永光明医疗仪器厂）；FA1104A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；Sartorius BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）HHS-2数显恒温水浴（上海康华生化仪器制造有限公司）；UL trospec 3300 pro型紫外可见分光光度计（Amersham biosciences）；硝酸铅；95%乙醇； 2.3主要试剂的配置反应混合液10 10

11、0mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中。营养液 2.00mmol/LCa(NO3)24H2O、0.10mmol/LKH2PO4、0.50mmol/LMgSO47H2O、0.10mmol/LKCI、0.70mmol/LK2SO4、10.00umol/LH3BO3、0.5umol/LMnSO4H2O 、 1.00umol/LZnSO47H2O 、0.20umol/LCuSO45H2O、0.01umol/L(NH4)6Mo7O243试验方法3.1试验流程实验定流程下 方案设计 丹

12、参种植 铅胁迫 试验测定生理指标 再胁迫 第二次测定 胁迫 第三次测定图-1生理指标测定流程3.2试验步骤3.2.1丹参的种植及胁迫于绵阳市购得培养丹参所需的各种材料，如营养土、珍珠岩、花盆等；店购实验所需药品，如硝酸铅、甲苯、冰醋酸等。于德阳市中江县丹参种植基地购买的丹参根，折断为每段4-5cm插于绵阳师范学院北校区果园松软的土中，待其长出幼嫩叶子时，移植进装有培养土（营养土：珍珠岩：纯土=1:1:3）的花盆中培养，每3珠一盆，花盆放于露天的土地上。一共设定6个组，编号：(对照)、,其Pb2+浓度分别为0、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L、1600mg/

13、L。对照组定时加入不含铅的营养液，其他分组同时加入不同浓度的含铅培养液。 3.2.2测定含水量将叶片从丹参植株上取下后，迅速剪成小块，置于称量纸上用电子天平称重，记为Wf。将称重后的叶片装入洁净培养皿中，于105烘箱中干燥46h(注意培养皿不能盖盖子)。取出培养皿和叶片冷却至室温，用电子天平称叶片的重量。然后将叶片放入培养皿中再烘2小时，取出烧杯和叶片冷却至室温，用电子天平称叶片的重量，这样重复几次，直至恒重为止。称得叶片干重Wd。烘时注意防止植物材料焦化，如所取材料为幼嫩组织可先用l00105杀死组织后，再在80下烘至恒重。计算： 鲜重含水量（）（Wf - Wd）/ Wf * 100% 干重

14、含水量（）（Wf - Wd）/ Wd * 100%3.2.3叶绿素含量的测定取不同浓度等量丹参叶片10,12,14，擦净组织表面污物，分别剪碎（去掉中脉），混匀。称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量碳酸钙和石英砂及23ml95乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，暗处静置35min。取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中，用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀，把叶绿体色素提取液稀释5倍后倒入光径1cm的

15、比色杯内。以95乙醇为参比，在波长663nm、645nm下测定光密度。将测定得到的吸光值代入下面的式子：Lambert-Bee定律 Ca=12.7 D6632.69D645 (3) Cb=22.9 D6454.68 D663 (4) G总=Ca+Cb=8.02D663+20.2D645(5)式中的D663、D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度。Ca、Cb为叶绿素a、b浓度，单位为:mg/L。分别计算叶绿素a、b和总叶绿素的含量 叶绿素含量等于3.2.4脯氨酸含量的测定3.2.4.1脯氨酸标准曲线的制作取7支试管10,17，编号，按下表配制每管含量为06g的脯氨酸标准液。加

16、入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。以15号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。表1 标准样的配制Tab.1 Confecting of the standard samples试 剂管号123456710gml-1脯氨酸标准液（ml）00.10.20.30.40.50.6蒸馏水（ml）21.91.81.71.61.51.4冰醋酸（ml）22222222.5酸性茚三酮（ml）2222222每

17、管脯氨酸含量（g）01234563.2.4.2脯氨酸的提取和测定取不同处理的植物材料各0.5g10,19，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml 2.5酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）

18、值。3.2.4.3计算从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量14，按下公式计算样品中脯氨酸含量：脯氨酸含量（gg1Fw）X 提取液总量（ml）/ 样品鲜重（g） 测定时提取液用量（ml） 公式中：X 从标准曲线中查得的脯氨酸含量（g）3.2.5丙二醛的含量测定 采用二硫代巴比妥酸显色法10,18,29,21。分别称取不同浓度植物叶片0.5g，加入少量石英砂和10%三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml 10%三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。取8支干净试管，编号，7只为样品管（七个重复），各加入提取液2ml。对照管加蒸馏水2ml，迅速各管再加

19、入2ml0.6%硫代巴比妥酸溶液，摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心，取上清液分别在532、600、450nm波长下测定吸光度（A）值。由于蔗糖TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.410-3.MDATBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别为7.410-3和15510-3。532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代替。 按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组 A453=(85.410-3）C糖 A532A600=（15510-3) CMDA+(7.410-3) C糖3.2.6酶活性的测定3.2.6.1酶液提取 取5g洗净的

20、丹参叶片10,20,24,25，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液，研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000g离心10min，上清液转入25ml容量瓶中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。3.2.6.2过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反应体系包括25,28：2.9ml0.05mol/L磷酸缓冲液；1.0ml2%H2O2；1.0ml0.05mol/L愈创木酚溶液和0.1ml酶液。以加热煮沸5min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34水浴中保温3min，然后迅速稀释1倍，470nm波长下比色，每隔1min记录1次吸光度（A470），共记

21、录5次。3.2.6.3结果计算 以每分钟内A470变化0.01为1个酶活力单位（U）。 过氧化物酶活力（Ug-1鲜重min-1）= 式中，A470为反应时间内吸光度的变化；W为丹参叶片鲜重(g)；t为反应时间(min)；VT为提取酶液总体积(ml)；VS为测定时取用酶液体积(ml)。解C糖=A453/85.410-3=11.71A453(mol/L) CMDA+=6.45(A532A600)0.56A450(umol/L) 公式中 1.5510-3为摩尔比吸收系数C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度提取液中MDA浓度（umol/ml)=(CMDA*反应液体积）/测定时提取液用

22、量1000MDA含量（umol/gfw）=提取液中MDA浓度提取液总量/植物组织鲜重。4结果及分析4.1含水量的变化由图-2可以看出，对照组的含水量基本没变化随着胁迫时间的增加，含水量的百分比逐渐降低。且随Pb2+浓度的增加而下降的越快；同等浓度的Pb2+条件下，随着胁迫时间的增长，含水量的下降越明显。由此可知：Pb2+对丹参叶片的保水能力有破坏，并且随着浓度的增加，胁迫时间的增长，叶片中的含水量就越低，说明Pb2+对丹参叶片的伤害与时间，浓度的变化成正比例。图-2 含水量的变化Fig-2 The situation of Relative Water Content4.2叶绿素含量的测定结果

23、由图-3和图-4可以看出，就对照组而言，随着时间的增长，叶绿素含量呈现增加的趋势，说明该在该营养液中，丹参可正常生长。另外，叶绿素a和叶绿素b在Pb2+浓度较低时会有一定程度的上升，说明低浓度的Pb2+可以 增加叶片叶绿素含量随着铅处理浓度的增加及时间的延长，叶绿素的增加量开始下降。叶绿素含量的高低直接反映植物光合作用能力的强弱。高铅浓度时，叶绿素含量的降低是植物受重金属毒害的重要特征之一。叶绿素含量随着铅浓度的增加不断减少，这与很多植物在受到重金属污染时叶绿素的变化规律想一致。叶绿素含量的降低有多方面的原因，与合成叶绿素所需酶受重金属破坏有关，可能是铅离子被植物吸收后，细胞内的铅离子作用于叶

24、绿素生物合成途径的几种酶的肽链中富含SH的部分，改变了正常构型，从而抑制了酶的活性，阻碍叶绿素的不可逆损伤。叶绿素在不同浓度铅胁迫下参与叶绿素合成的矿物质吸收受阴也可能是植株叶绿素含量变化的原因。图-3叶绿素a含量的测定Fig-3 The situation of Content of Chla图-4叶绿素b的含量测定Fig-4 The situation of Content of Chlb4.3脯氨酸含量的测定结果 4.3.1脯氨酸的标准曲线图-5 脯氨酸标准曲线Fig-5 The free pralinein standard curve图-6 脯氨酸含量的测定情况Fig-6 The s

25、ituation of Content of free pralinein4.3.2脯氨的测定结果随着Pb2+含量的增加，丹参叶片中脯氨酸的含量呈现增加趋势（见图-6）。当铅离子浓度小于400mg/L时，脯氨酸含量增加不显著。当Pb2+浓度达到400mg/L及大于该浓度时，脯氨酸含量的增加越来越显著，且随时间的增长，几乎成倍的增长。脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，并以游离状态广泛的存在于植物体中。在逆境条件下，认为脯氨酸是一种植物渗透调节剂、膜和酶的保护物质以及自由基清除剂等而对植物起保护作用，抗逆性强的植物能积累较多的脯氨酸。本研究结果表明，在铅胁迫时，低浓度时丹参脯氨酸含量变化不大，这可能是

26、胁迫程度较轻，并未影响到丹参体内的游离脯氨酸的正常积累。而当胁迫浓度增加时，脯氨酸含量大量增加，可能是脯氨酸对铅胁迫逆境下积累更多的游离脯氨酸以保持渗透作用。从中可以看出脯氨酸含量在一定范围内与铅浓度有较好的剂量-效应关系。4.4丙二醛含量的测定结果图-7 丙二醛的测定结果Fig-7 The situation of Content of MDA由图-7可以看出，对照组中丙二醛的含量几乎不变，这说明在正常生长条件下丹参中的丙二醛含量趋于稳定，而随着铅离子浓度的增加和培养时间的增长，丹参叶中丙二醛的含量呈现增加的趋势，且浓度小于400mg/L时增加的量较小，当浓度增大的时候，丙二醛的增加量也随之

27、增加。这与夏建国18 ，徐燕云23等的研究结果相一致。植物器官衰老或在逆境条件下发生膜脂过氧化作用，丙二醛通常作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件下膜系统受损程度的指标。丙二醛的积累来自不饱和脂肪酸的降解，它的生成是由体内自由基引发而产生的，丙二醛的积累能够反映植物体内自由基的活动状况。本研究中，在铅浓度小于400mg/L的条件下，丙二醛含量变化不大，说明丹参在这一浓度下没有受到铅的污染带来的伤害。而在铅浓度在4001600mg/L的条件下，比对照升高显著。说明铅胁迫在高浓度铅时，丹参受伤害较为明显；且胁迫时间对丙二醛的含量的影响较浓度不明显，说明影响丙二醛含量的主要因素

28、为Pb2+浓度。4.5酶活性的测定结果图-8 POD酶活性测定结果Fig-8 The situation of Content of the activities of POD由图-8可以看出，酶活性随着铅浓度的增加而呈增长趋势，铅浓度在0800mg/L时维持在相对稳定的水平，当铅浓度达到1600mg/L时，酶的活性相对于对照组有明显的增加，是对照组的2.26倍。这说明POD清除活性氧的能力加强，有利于抵抗铅的污染。POD是一种含铁的金属蛋白质，是植物体内常见的氧化还原酶。POD作为细胞内清除活性氧系统中的重要酶，能催化H2O2与酚类的反应，达到清除过氧化物的作用。5讨论叶绿素含量降低与合成叶

29、绿素所需的酶受重金属破坏有关，可能是重金属离子被植物吸收后，改变了作用于叶绿素生物合成途径的正常构型，从而抑制了酶的活性，阻碍了叶绿素的合成。另外，重金属能使叶绿素被膜消失，造成对叶绿体的不可逆损伤。本实验中，叶绿素a的变化比叶绿素b明显，说明高浓度的铅胁迫对丹参幼苗叶片中叶绿素a的影响较大，其机理和显著程度需要进一步研究。同时低浓度铅胁迫处理出现叶绿素含量升高现象，与巢丽仪21等和徐勤松27等的研究结果基本一致。过氧化物酶(POD)是一种含Fe的金属蛋白质25,28，其作用如同氢的接受体一样，是植物体内重要的代谢酶，参与许多重要的生理活动，如细胞分裂，生长发育等28。同时也是植物体内抗氧化酶

30、系统的重要组成部分，它能催化有毒物质的分解，其活性的高低能反映植物受毒害的程度。 植物器官衰老时或逆境条件下15,18，往往发生膜脂过氧化作用，而MDA是其产物之一，因此，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。通过丙二醛含量的测定可了解膜脂氧化伤害的程度，比较植物抗逆性的差异。该研究中，丹参受到铅污染后，体内的丙二醛含量发生了变化，由此表明，丹参处于高浓度铅胁迫时，丹参叶内活性氧的产生和清除平衡受到破坏，体内产生并积累大量活性氧会引发膜脂过氧化，产生MDA等有害的膜脂过氧化物，并且MDA的含量常会随胁迫浓度的增加而增加23。游离脯氨酸的植物体内最重要的

31、渗透调节物质之一14。根据Csonka(1991)和J.Pang(2003)等的报道，脯氨酸的积累对细胞的渗透调节、细胞结构的稳定、氧化的降低具有非常重要的作用。丹参叶片脯氨酸含量在高铅胁迫下急剧增加，从而支持了以往对于脯氨酸具有清除活性氧的作用，与植物抗氧化关系十分密切，是植物对逆境的一种适应性反应的论点。由于当植物遭受逆境时，体内游离脯氨酸的含量增高，常以游离脯氨酸含量作为植物多重抗逆性的指标25。结果还说明，丹参在受到铅低浓度处理时，生长旺盛，生长状况较好。随处理时间的延长及处理浓度的增加，游离脯氨酸含量增加，丹参生长受到一定的抑制27。6结论综合各项研究结果，本研究结论如下：(1)含水量随铅浓度的上升和胁迫时间的增长而呈下降趋势；(2)低浓度铅(100mg/