简达气单胞菌感染美洲鳗鲡的病理组织观察.docx

1、简达气单胞菌感染美洲鳗鲡的病理组织观察简达气单胞菌感染美洲鳗鲡的病理组织观察摘要 本研究采用从美洲鳗鲡 (Anguilla rostrata) 分离的简达气单胞菌进行人工感染试验，以探讨感染后的简达气单胞菌在鳗鲡不同脏器引起的病理变化。采集鳗鲡的脾脏、肝脏和肾脏进行简达气单胞菌在鳗鲡体内不同脏器引起的病理变化的研究。结果表明，感染后鳗鲡注射部位出现溃疡，各脏器均出现一定程度的病理变化：心脏部位血管出现扩张，血细胞滞留血管，形成血栓。脾脏组织坏死，细胞与细胞之间间质增宽，细胞萎缩。肾脏中大量肾小管解体，部分肾小管崩溃消失，周围被淋巴液浸润。关键字 美洲鳗鲡 简达气单胞菌 人工感染 病理变化His

2、topathological changes of different organs of American eels (Anguilla rostrata) infected by Aeromonas JandaeiAbstract this study adopted from the American eel (Anguilla rostrata) separation of Aeromonas Jandaei of artificial infection test, in order to investigate the infection after Aeromonas Janda

3、ei in eel different organ pathological changes caused by.Acquisition of the spleen, liver and kidney of Anguilla japonica by Aeromonas Jandaei in Anguilla japonica in different organs caused by pathological changes of.The results show that, after infection of eel injection site ulceration occurs, th

4、e organ was the degree of pathological changes: cardiac vascular expansion, blood cell retention vessel, thrombosis, spleen, tissue necrosis, between the cell and cell mesenchymal broadening, cell atrophy.Kidney renal tubule disintegrated a portion of the tubular collapse, disappear, surrounded by f

5、luid infiltration.Key words: The American eel Aeromonas Jandaei Artificial infection Pathological changes 目录引言 41材料与方法 51.1 供试鳗鲡 51.2 细菌 51.3 人工感染和脏器材料的采集 51.4 主要试剂的配制 51.5 包埋剂的配制 61.6 包埋块的制作 61.7 玻璃刀的制作 71.8 病理切片的染色和观察 72 结果 72.1 简达气单胞菌感染后鳗鲡的解剖病理变化 72.2 简达气单胞菌感染后鳗鲡心脏的组织病理变化 72.3 简达气单胞菌感染后鳗鲡脾脏的组织病理变

6、化 82.4 简达气单胞菌感染后鳗鲡肾脏的组织病理变化 83 讨论 84 结论 10致谢语 10参考文献 11图版说明 12引言美洲鳗鲡为辐鳍鱼纲鳗鲡目鳗鲡亚目鳗鲡科的其中一种。美洲鳗鲡为一种在北美东岸发现，降河回游产卵鱼类。它有一个蛇形身体及一个细小尖锐的头部。背部为棕色而腹部为茶黄色。它的牙齿锐利但没腹鳍。它与欧洲鳗鲡十分类似，但两者的染色体及脊椎骨数目都不相同。前者脊椎骨数103-111；后者为110-119。体长可达152厘米。由于鳗鲡营养丰富，味道鲜美，少刺多肉，并具有清凉解暑，滋补强身的作用。上世纪 80年代以来我国养鳗业发展迅速，特别是珠江三角洲目前已成为我国乃至国际上重要的鳗鲡

7、养殖基地1。在养殖鳗鲡发生的各种疾病中，细菌性疾病为危害最严重的疾病，周年发生，传染速度快，引起的死亡率高。简达气单细胞是养鳗鲡池中的常见菌，一般认为是条件性致病菌，当鳗鲡生长环境不适宜或体表受伤或感染了其他疾病后抗病力下降时容易引起气单胞菌感染2 。气单胞菌能侵入病鳗肝脏和肾脏，与鳗鲡爱德华氏菌一起引起肝脏和肾的病理变化，此外，其还大量存在于胃肠道中，引起胃肠充血和粘膜肿胀、脱落、胃肠道贮积大量白色粘稠状液体，导致鳗鲡腹部膨胀3。我们在参照前人试验结果的基础上决定对简达气单胞菌感染后在美洲鳗鲡体内不同脏器中引起的病理变化进行研究，对鳗鱼感染简达气单胞菌通过一系列试验手段观察鳗鲡脏器，在与对照

8、组比较观察鉴别鳗鲡病理变化，从而得到预期的试验结果，以期能得到新的研究发现。1材料与方法1.1 供试鳗鲡 30尾美洲鳗鲡购自福建省福清市一养鳗场，平均体质量为15 g。试验前将美洲鳗鲡置于试验室水簇箱内，水族箱规格100cm80cm60cm，水深40cm。养殖用水为曝气后的自来水，室温养殖，水温在23-26之间，试验期间水簇箱保持充气，每天投饵2次，早晚各1次；换水2次，换水时间为投饵后3 h ，日换水量为40%。鳗鲡暂养1周后进行注射感染。1.2 细菌 用于试验的细菌分离于发病美洲鳗鲡的肝脏，生化鉴定(Biolog，Ge ) 为简达气单胞菌1.3 人工感染和脏器材料的采集 将20尾平均体质量

9、为15g 的鳗鲡平均分为2组，每组10尾。细菌于28 肉汤培养24 h后，用灭菌生理盐水配成 1.010 8cfu/ml菌液，用一次性灭菌注射器于鳗鲡背部肌肉注射，每尾剂量均为 0.1 mL。注射 6、24、48 h后取3尾鳗鲡，观察其外部症状，解剖后观察其内部各脏器的组织病理变化。采集不同时间段各组鳗鲡的心脏、肾脏和脾脏，每个时间段采3尾鳗鲡，将脏器切成 3 mm3 mm3 mm大小的组织块。 1.4 主要试剂的配制 PBS缓冲液：甲液0.2mol/LNa2HPO412H2O35.82g稀释至500mL;乙液NaH2PO42H2O15.61g加蒸馏水溶解，最后稀释至500mL。配制磷酸盐溶液

10、PH为7.2 Epon812树脂，DDSA,MNA,DMP-30 染色剂 Pual 蓝； 洋红；硼氢化钠 50%丙酮溶液，70%丙酮溶液，80%丙酮溶液，90%丙酮溶液。1.5 包埋剂的配制为了使包埋块质地柔软，容易进行修块，所以按照以下方案配制配制剂量 70mlEpon812 35mlDDSA 8 mlMNA 27mlDMP-30 1.4ml1.6 包埋块的制作将组织切成1mm，进行脱水处理，步骤如下实验项目 实验内容 所需时间系列脱水 50%丙酮 10min 70%丙酮 10min 80%丙酮 10min 90%丙酮 2次，10min / 次 20min 100%丙酮 2次，15min/

11、次 30min浸透 丙酮 ：包埋剂 1 : 1 60min 1 : 2 60min 1 : 3 60min 纯包埋剂 60min 包埋 纯包埋剂 60min聚合 Epon812 24-36h1.7 玻璃刀的制作将2.5cm*40cm硬质条形玻璃的光滑边沿朝上，放在制刀机操作台面上，将其平均划割成2.5cm正方形小块，逆时针旋转45度，摆放于划割器下方，并将金属托叉放在方块玻璃下方，通过推过制刀机左侧手轮卡住两个对角线，拉动划割器，右手顺时针转动断裂旋钮，取出玻璃刀。1.8 病理切片的染色和观察按1.5制作好包埋块后，进行包埋块的修块，然后用超薄切片机进行切片（600nm-4um），再进行染色和

12、观察。步骤如下：paul蓝+0.25%硼氢化钠-1min洋红-1min烘干观察拍照2 结果2.1 简达气单胞菌感染后鳗鲡的解剖病理变化鳗鲡注射6h后无明显病理变化，但见多数鳗鲡在水中快速游动，有的浮于水面，剖检时见肝脏和鳃充血，肾脏轻微肿大。注射后24h已有一条鳗鲡死亡，其它鳗鲡均处于频死状态，可见注射部位溃烂，皮肤脱黏，剖检时见腹部有胶冻样黄色液体流出，肾脏肿大明显，偶见鳃部溃烂。注射部位严重溃烂，皮肤黏液大面积脱落，下颌严重充血，剖检时见腹部有腥臭的胶冻状黄色液体流出，肾脏严重肿大，鳃部溃烂。试验组鳗鲡的注射部位均出现直径0.5-2.0cm大小的圆形或椭圆形溃烂区，溃烂区的皮肤和肌肉严重红

13、肿发炎。2.2 简达气单胞菌感染后鳗鲡心脏的组织病理变化试验鳗鲡的心脏（见图1A,图1B），血管扩张，血细胞滞留血管，形成血栓2.3 简达气单胞菌感染后鳗鲡脾脏的组织病理变化鳗鲡脾脏组织坏死，细胞与细胞之间的间质增宽（图2A）；大量细胞萎缩(见图2B)2.4 简达气单胞菌感染后鳗鲡肾脏的组织病理变化肾小球坏死、裂解、充满红细胞,结构消失,肾小管上皮细胞坏死, 数量明显减少,部分肾小管管腔消失,肾间质严重出血,有大量红细胞（见图3A，3B）。3 讨论本实验的简答气单胞菌属于温和气单胞菌的一种，温和气单胞菌广泛存在于水、土壤中，属条件致病菌，由王永坤等4从温和气单胞菌对鲫鱼和小白鼠毒力试验、溶血素

14、试验以及兔回肠肠毒素试验等结果可知 ,所分离的温和气单胞菌能产生溶血素、细胞毒素、肠毒素等多种毒力因素。这些毒素具有多种生物学活性 ,一旦条件适宜 ,温和气单胞菌便大量繁殖 ,其毒素可引起生物体广泛而复杂的病理变化。鱼类感染具有发病率高、传播快、死亡快的特点，近年来由温和气单胞菌引起的各种疾病报道日益增多。5-9根据目前的研究，本试验所使用的这一株简达气单胞菌毒力较强，鳗鲡经人工注射感染后在极短的时间内心脏，脾脏，肾脏和腮都出现了明显的病理变化，其中肾脏的病理变化最严重，其表现为肾脏的肾小管上皮细胞的大量坏死,肾小管裂解。由以上的病理变化可知，鳗鲡经过感染后，病菌会通过血液循环进入各个器官，造

15、成能肾脏功能的损害，从而引起鳗鲡的排泄紊乱，脾脏的损伤使鳗鲡的免疫系统破坏，降低了鳗鲡的抵抗能力和免疫力，从而导致鳗鲡的各方面防御免疫机能大幅下降，最终导致鳗鲡的急性死亡，所以在实际的生产过程中，我们要以预防为主，才能避免疾病的爆发。试验中染病鳗鲡注射部位均出现明显的溃烂区域，体表出现脱粘斑，从头顶后部开始，严重时溃烂。肝脏、肾脏形成坏死病灶区，有时见肠、胃发炎，肠粘膜层坏死、脱落，心肌部分坏死，鳃溃烂。体表腹部皮肤出血，腹腔积血液，肝脏苍白色，肾脏、脾脏肿大，这与鳗鲡细菌性疾病的研究临床症状3 和大鲵感染温和气单胞菌的实验研究所描述的症状相同10。Ventura 等11对感染气单胞菌的斑点叉

16、尾鮰的组织病理观察，炎症反应仅在消化道、皮肤和皮下肌肉中发现。Huizinga 等12对感染气单胞菌的黑鲈病变肝脏、肾脏观察, 病灶处无炎症细胞浸润。简达气单胞菌广泛地侵袭肝、肾、脾、腮、心脏、等器官组织，且大量增殖，造成全身性组织损害，各器官组织出现肿胀、形成血栓，组织坏死崩解等现象。在本次实验中，第一次包埋树脂块时，由于树脂块过于脆弱易碎，使部分组织脱落，无法修块，分析如下原因：1. 所用的树脂包埋剂不好，第一次用的spurr树脂，可能已经过期；2. 调配树脂包埋剂的时候，比例不当，造成包埋块硬度过硬；3. 在组织块脱水的时候，混入大量的空气，使包埋块充满气泡，变脆弱；4. 在树脂进行组织

17、包埋的过程当中混入空气，使包埋块充满气泡，变脆弱；5. 在烘箱中聚合的时间过长，导致包埋块松脆；在修整树脂块时，组织块的的顶面，使长方形或者梯形的上面两边要保持平行，以便得到连续的切片，如果组织面上下两边不平行，切片带将发生弯曲或者切片散开。对于精切的组织块所用的玻璃刀要现做现用，因为玻璃刀放置在空气中容易氧化，刀口会变钝。在进行切片染色的时候，由于红色比蓝色容易上色，所以在使用洋红的时候要尽量缩短时间，避免切片染成过红，影响观察。4 结论简达气单胞菌感染美洲鳗鲡后，其病理变化表现为：鳗鲡的心脏，血管扩张，血细胞滞留血管，形成血栓，脾脏组织坏死，细胞与细胞之间的间质增宽；大量细胞萎缩，肾小球坏

18、死、裂解、充满红细胞,结构消失,肾小管上皮细胞坏死, 数量明显减少,部分肾小管管腔消失,肾间质严重出血,有大量红细胞。致谢语本篇论文师从陈锦民老师，在老师的悉心指导下，费神斧正并进行反复修改，终于得以完稿。特别感谢陈老师在本论文的选题、开题及初稿的写作过程中的精心辅导，我的成长过程凝结着老师的智慧和心血。老师深厚的学术造诣、严谨的治学风格、执着的学术追求、乐观的生活态度、为人师表的人格魅力，深深地打动着我，激励我不断上进。在本文的写作过程中，老师曾多次指点迷津，使我受益匪浅。在此，谨向恩师表达深深的谢意！最后要感谢众多同学好友，在我毕业论文的写作中给予大力帮助，没有你们的帮助，我不能这么顺利的

19、完成四年的学业。学无止尽，我将在今后的学习、研究中更加严格要求自己，争取更上一层楼。参考文献1 卢卫红，王安利，陈健酬，等. 感染温和气单胞菌日本鳗鲡的抗氧化功能研究J. 湖北农业科学,2010,49(6):1434-14362 何进义，邢华.欧鳗嗜水气单胞菌病研究 J. 中国水产，2005(3): 833 郭松林，鳗鲡细菌性疾病的研究概况J. 科学养鱼，2011(7): 48-494 王永坤,李志健,朱国强,等.温和气单胞菌和嗜水气单胞菌致病力的比较研究J .鱼类病害研究,1997 ,19 (1-2):18 - 24.5李长生，朱笃，邓娟,等鸭儿芹总黄酮提取及含量测定研究J 食品科学2006

20、 (27):357-360 6 徐淑云主编药理实验方法学M第2版北京：人民卫生出版社。1991506 7 刘彦双，朱淑霞，王永利 急性肝损伤模型的研究进展J河北医药。2007，29(6):6138 陈梁，朱锦善，任建平 柴胡疏肝散对四氯化碳所致大鼠急性肝损伤的防治作用J 中西医结合肝病杂志， 2004（14）：429张秀明，陈科力，李翰明，等 蛇葡萄根的抗肝降酶及抗自由基损伤作用J 中国药师， 1999（2）:225-228 10 王玉，敖弟书，吴中明 大鲵感染温和气单胞菌的实验研究 J. 遵义医学院学报, 2008,31(1): 7-10 11 Ventura M T, Grizzle J

21、M. Lesions associated wit h natural and experimental infections of Aeromonas hydrophila in channel catfish , Ictalurus punctatus ( rafinespue) J. 1Journal of Fish Diseases , 1988(11): 397-407112 Huizinga H W, Esch G W, Hazen T C , et al. Histopathology of redsore disease ( Aeromonas hydrophila) in n

22、aturally and experimentally infected largemouth bass Micropterus salmoides (Lac epede) J . Journal of Fish Disease , 1979 (2): 263-277图版说明图1A图1B图A，图B为简答气单胞菌感染鳗鲡心脏后的切片，图中箭头所指表示鳗鲡心脏血管扩张，血细胞滞留血管，形成血栓。图2A图2B图A，图B为简答气单胞菌感染鳗鲡脾脏后的切片，图A箭头说明鳗鲡脾脏的组织坏死，细胞与细胞之间的间质增宽；图B箭头说明脾脏的部分细胞萎缩。图3A图 3B图A，图B为简答气单胞菌感染鳗鲡脾脏后的切片，图A实心箭头说明肾小管解体，实心尾部带圆箭头说明肾小管崩溃，裂开。图B箭头说明肾小管解体，矩形部分表示周围被淋巴细胞浸润。