常规病毒学实验技术.docx

1、常规病毒学实验技术常规病毒学实验技术（一）病毒的培养实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠主要用于：1 分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒2 培养病毒，制造抗原和疫苗3 测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验）4 制备免疫血清和单克隆抗体5 作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。鸡胚（一） 条件要求SPF鸡、孵化温度38-39，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10左右。（二） 优点组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒

2、的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。（三）接种途径1 绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚）主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。1） 方法一（造人工气室）1 在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。2 用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。3 在气室端中央钻一个小孔。4 用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。5 滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。6 用1ml注

3、射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。7 用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。8 鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。2）方法二1 在气室端的卵壳上开约1.51.5cm的口。2 用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。3 滴入接种物。4 用透明胶纸封闭开口。2 尿囊腔接种（10-11日龄）用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1） 画出气室和胚位2） 在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3） 用钢锥穿一小孔4） 将注射器针头沿此小孔插入0.5-1cm，注入接种物5） 用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3 卵黄囊接种（6-8日龄）主要用虫媒

4、病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。1） 画出气室和胚位2） 垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒气室外端3） 以钢锥在气室中央锥一小孔4） 将注射器针头沿此小孔插入3cm，注入接种物5） 用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次4其它接种途径羊膜腔接种，正粘病毒和副粘病毒静脉接种，蓝舌病毒脑内接种，狂犬病毒组织培养原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常即可使其贴附于玻璃壁上，并生长增殖。继代细胞：将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就

5、是癌变细胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）1） 在无菌条件下采取9-10日龄鸡胚，置灭菌平皿中，除去头（或仅除去喙和眼）、爪和内脏，并剪成块。2） 用Hanks液，充分冲洗后移入大号青霉素瓶或其它广口瓶中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎块。3） 加入Hanks液，充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加洗液。如此反复冲洗2-3遍。4） 于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调整pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次。5） 取出，小心吸弃上层胰酶溶液，用洗液轻洗2次后，用

6、大口径吸管反复吹打，使细胞游离。6） 用双层或三层纱布过滤，收集滤液于离心管中，以600rpm离心沉淀5-10min，吸弃上清液，按每个鸡胚5ml的量，加入营养液，并用吸管反复吹打，直至形成均匀的细胞悬液。7） 细胞计数（培养时，使细胞达到5105个/ml）取细胞悬液0.5ml+2ml0.1%结晶紫构椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37温箱中5-10分钟，充分振荡后进行计数。按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。每ml悬液中的细胞数（n）=N/410000K（稀释倍数）。传代细胞系培养优点：1)可以无限的传代。2)不少细胞系对病毒很敏感。3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培

7、养，适合病毒抗原的大量生产。4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。细胞分散剂1 胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。2 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）营养液1 人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。2 血清1） 动物血清中含有细胞生长所必须的各种营养因子。2） 促进细胞的贴壁和生长。3） 具有很强的酸碱缓冲作用。（二）病毒感染力的滴定LD50，EID50，TCID50（TCID50的测定）1 在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释

8、，从10-110-10。2 将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100ul。3然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3105个/ml。4设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。5逐日观察并纪录结果，一般需要观察5-7天。6结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。TCID50的计算方法：1 Reed-Muench法病毒液稀释度出现CPE孔不出现CPE孔累计出现CPE孔不出现CPE孔出CPE的孔所占的%10-180270100（27/27）10-280190100（19/19）10-373115711191.6(11/12)10-4464

9、0（4/10）10-51130.7（1/13）10-6080210（0/21）高于50%的百分数-50%91.6-50距离比例=0.8高于50%的百分数-低于50%的百分数91.6-40lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.82.Karber法病毒液稀释度出现CPE孔的比率10-18/8=110-28/8=110-37/8=0.87510-43/8=0.37510-51/8=0.12510-60/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L:最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率

10、总和lgTCID50=-1-（-1）(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml（三）病毒中和试验一、原理抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。二、用途1.疾病诊断。2.病毒分离株的鉴定。3.不同病毒株的抗原关系研究。4.疫苗免疫原性的评价。5.免疫血清的质量评价。6.测定实验动物血清中是否存在抗体等。三、分类（一）终点法中和试验1.固定病毒稀释血清法。1)将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。2)在96孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50ul生长液，再加50ul待检血清，混匀后，吸50u

11、l至下一孔，如此下去。一直到1:256），每个稀释度作4孔。3)在上述各孔内加入50ul稀释好的病毒液，混匀后放入375%CO2培养箱中作用45min-60min。4)同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照。5)感作完成后每孔加入100ul细胞悬液，放375%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。6)结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。Reed-Muench计算方法：血清稀释度CPE孔数无CPE孔数累计CPE孔数无CPE孔数保护率（%）1:4（10-0.6）04091001:16（10-1.2）1315831:64（10-1.8）223240

12、1:256（10-2.4）407001:1024（10-3.0）401100高于50%的保护率-50%距离比例=高于50%的保护率低于50%的保护率83-50=0.783-40高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例稀释系数的对数=-1.2+0.77(-0.6)=-1.66-1.66的反对数=1/46即：1:46稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。2.固定血清稀释病毒法。1)将病毒作连续10倍稀释1） 将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50l，做两块板子，在一块板子的每孔加入50l待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50l正常血清（对照组）

13、，混合后置375%CO2培养箱作用1h。2） 然后在每孔中加入100l细胞。3） 另外还设两纵排正常细胞对照。4） 置375%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。5） 分别计算每组病毒的TCID50，然后计算血清的中和指数。试验组TCID50中和指数=对照组TCID50(二)蚀斑（痘斑）减数试验1、蚀斑技术病毒蚀斑：又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位。用途：用于病毒纯化；测定病毒悬液中感染病毒的含量。2、蚀斑减数试

14、验将病毒正常血清混合物以及病毒待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒正常血清组和病毒待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。(三)交叉保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。用途：（1）应用已知V鉴定未知V（2）应用已知免疫血清鉴定未知V（3）应用已知V鉴定未知血清（四）病毒的分离和鉴定病毒材料的注备1 脑、肝、肌肉等器官或

15、组织充分研磨后加入5倍量的Hanks液（内含P.S各200V/ml）反复冻融三次。2000rpm10min，取上清作接种物。2 鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物用内含青、链霉素100u/ml的Hanks液，将其稀释3-5倍，充分混匀悬浮后，置4冰箱内感作2-4h或过夜，200rpm10min取上清作接种物。3 咽喉拭子或鼻拭子仔细用棉拭子擦拭咽喉部，并迅速将其泡入盛有2-5mlHanks液的（200-500u/mlP.S）试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融3-5次，收集液体部分，2000rpm10min，收集上清作接种物。4 粪便用含100u/mlP.S的Hanks液作10-20倍稀释，4感作4

16、h，2000rpm10min取上清作接种物。5 无菌的体液或鸡胚液直接接种用。接种方法1 实验动物2 鸡胚目前常用鸡胚分离的病毒有正粘V、副粘V、痘V、脑炎V及引起禽类疫病的其它许多V。3 组织培养细胞。病毒增殖的判定1 细胞病变（CPE）2 抗原的测定3 中和试验4 病毒间的干扰现象乙型脑炎V脊髓灰质炎V流感V西方马脑炎V猪传染胃肠炎牛病毒性膜炎粘膜病V5 电子显微镜观察6 实验动物或鸡胚接种病毒感染力的滴定LD50、EID50、TCID50病毒理化学特性的测定1 病毒核酸型鉴定（药物抑制试验）FUDR、IVDR、BRUDR原理：FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的卤化物，进入cell后发

17、生磷酸化，掺入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶产生至功能分子，从而抑制DNA的合成。常用浓度为50ug/ml。2脂溶剂敏感性试验1） 乙醚敏感试验取同批病毒分装于两个青霉素瓶中，每瓶16ml，在其中1瓶加入麻醉用乙醚，使终浓度为20%，两瓶均用橡皮塞塞紧后，置4冻箱内作用24h，其间不时振荡，随后以2000rpm离心20min。已加乙醚的小瓶，用毛细吸管吸取病毒液，移入另一小瓶内，适当吹打，使残余乙醚挥发殆尽，然后滴定两组病毒的TCID50。2） 氯仿敏感性试验向病毒液内加入分析纯氯仿，使其终浓度为4.8%，置4振荡混合10min。随后500rpm5min，然后吸取上层液体，滴定病毒TCID50。

18、对照组病毒加入终浓度为4.8%的生理盐水，同样处理和滴定。3胰蛋白酶敏感试验脊髓灰质炎V、猪传染性胃肠炎V对胰酶有较强的抵抗力，痘V、呼肠孤V、疱疹V易被胰酶灭活。取病毒液两瓶，每瓶1ml,在其中1瓶加入1ml1%的trypsin，使终浓度为0.5%，另一瓶加入1ml1640（培养基），用橡皮塞塞紧瓶口，将小瓶倒转几次，使其充分混合，置371h，随即加入灭活犊牛血清8ml，充分混合，终止胰酶的作用。最后滴定两瓶V的TCID50。4 耐酸性试验pH3.02horpH5.01h取等量病毒液两瓶，用0.1mol/LHCL将1个小瓶中的病毒液的pH调至3.0(or5.0)，并在另一个小瓶内加入相同于用

19、酸量的培养基作为对照，置37水溶或室温中感作2h(or1h)，再用5.6%NaHCO3溶液将pH调回至7.2左右，对照组再加紧入相同于NaHCO3量的培养基，测定两者的TCID50。5 耐热性试验将病毒液分成等量的11小瓶，其中4小瓶分别置50、60、70、80水溶中1h，另6瓶置50水浴中分别感作5、10、15、30、60和180min，随后测定每瓶V的感染X。6 病毒粒子大小测定1)电子显微镜直接观察（透射电镜、磷钨酸负染）2)超速离心沉淀3)滤过试验取澄清的病毒液20ml，留出1ml作为对照，将剩余的19ml病毒液在正压下依次通过孔经为450nm、225nm、100nm和50nm的各级微

20、孔，每通过一种孔径的滤膜就吸取1ml滤液用为样品，并将剩余的滤液通过一次滤膜。最后测定原病毒液以及各级滤液的TCID50。病毒液种类TCID50/0.1ml滤前病毒液10-6.75450nm孔径液10-6.23225nm孔径液10-5.78100nm孔径液10-4.5050nm孔径液10-0.50免疫血清学检查目的：新分离毒株的种类及型别的鉴定。检测发病动物体液中的Ab，或进一步比较动物急性发病期和恢复期血清中的Ab效价，了解病毒性Ab是否有明显的增长，从而判定V感染的存在。（一） 中和试验1 终点法中和试验固定病毒稀释血清法中和试验固定血清稀释病毒法中和试验2 蚀斑（痘斑）减数试验1） 蚀斑

21、技术病毒蚀斑，又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每毫升所含的蚀斑单位。用途：用于病毒纯化；测定病毒悬液中感染病毒的含量。2） 蚀斑减数试验将病毒正常血清混合物以及病毒待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒正常血清组和病毒待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。3 交叉保护试验先将实验动物进

22、行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。用途：（1）应用已知V鉴定未知V；（2）应用已知免疫血清鉴定未知V；（3）应用已知V鉴定未知血清。（五）凝集试验定义：颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）或表面载有抗原的颗粒状的物质（如聚苯乙烯胶乳、红细胞、炭素颗粒等），与相应抗体在电解质存在下凝集成团的试验。分类直接凝集试验：颗粒状Ag与相应Ab所发生的凝集反应。（布氏杆菌）间接凝集试验（被动凝集试验）：可溶性抗原吸附到载体颗粒表面，与相应抗体所发生的凝集反应，可以证明相应抗体的存在并测定效价。反相问接凝集

23、试验（反向被动凝集试验）：将抗体吸附到颗粒表面与相应抗原所发生的凝集反应。间接血凝试验胶乳凝集试验炭凝集试验间接凝集试验皂土凝集试验脂质体凝集试验间接凝集抑制试验：先将被检的抗体（或抗原）与已知的抗原（或抗体）作用后，再与抗体（或抗原）致敏的颗粒时行反应。反向凝集抑制试验间接凝集试验的优点：快速、简便、特异、敏感间接血凝试验（IHA）（PHA）口蹄疫、猪瘟、弓形体、胸膜肺炎、衣原体反向IHA：FMDV、水疱病病毒Ag、猪传染笥胃肠炎病毒Ag、小鹅瘟病毒Ag等。红细胞作为载体的优点：1 来源广泛，容易取得。2红细胞表面几乎可以吸附任何一类的Ag或Ab，如蛋白质、糖蛋白、核蛋白以及多糖等。3具有天

24、然的均一性，比其它许多载体都更容易标准化和规格化。缺点：容易破裂、难于保存IHA的优点：敏感性高、特异性强、重复性和稳定性好，操作简便、反应迅速。既可定性又可半定量，而且试剂价格低廉，不需要特殊、复杂的设备。注意：影响红细胞凝集的因素很多：红细胞的来源，致敏条件、操作技术、标本中的杂质、细菌污染和类属Ag常引起非特异性凝集反应。1 红细胞的选择和保存选择：许多种类动物的红细胞，包括人的0型红细胞都可用，但用得最多的是绵羊红细胞。保存：用玻璃珠脱纤法采集或用肝素抗凝。无菌的红细胞在4冰箱中可保存3-4天。采血时加等量氏液和适量抗生素，4保存2周，但这样红细胞致敏时容液自凝。2 红细胞的醛化醛化剂

25、：甲醛、戊二醛、丙酮醛、丙酮醛甲醛双固定、戊二醛丙酮醛双固定。1） 无菌采取绵羊静脉血，加至红细胞保存液内，4保存备用。2） 取红细胞悬液1份，加入10倍量0.1mol/L、PH7.2磷酸缓冲液（PH7.2PB），洗5遍，并以该液配成8%红细腻悬液。3） 红细胞悬液1份+3%丙酮醛液等量，24左右的室温中用电磁搅拌器缓慢搅拌17h。PH7.2PB配成8%悬液，丙酮醛固定红细胞悬液。4） 丙酮醛固定红细胞悬液1份+等量3%甲醛液，如上搅拌17hr。5） 再以PH7.2PB液洗5遍，最后用内含0.1%叠氮钠的ph7.2PB配成20%的红细胞悬液，分装后置4冰箱内保存，可用2个月双醛化红细胞悬液。3

26、红细胞的鞣化作用：可增加红细胞吸附蛋白质的能力，新鲜红细胞用1：200000浓度的鞣酸，醛化红细胞用1：100000浓度的鞣酸。程序：取红细胞，用PH7.2PB洗45遍，并用同液配成2.5%悬液，同时以PH7.2PB临时配制1：200000优质鞣酸，将其与红细胞悬液等量混合，37水浴咸作15min。取出后用ph7.2PB洗一次，再用PH7.2pB配成20%红细胞悬液。4致敏红细胞的制备：1） 抗体致敏红细胞取20%鞣化或未鞣化的双醛化红细胞悬液1ml，离心沉淀，弃去上清液，将沉淀红细胞重新悬浮于醋酸缓冲液10ml中，加入等量的提纯IgG液（每毫升需含IgG100300g）置37水浴中咸作2-4

27、h，每15-20分钏用吸管轻轻吹吸混合2-3次。以ph7.2PB洗5遍，再将沉淀红细胞用1%灭活免血清盐水配成0.8%悬液备用。Ab致敏红细胞悬液。2） 抗原致敏红细胞取PBS（PH6.4）4ml病毒抗原1ml，2.5%鞣酸化红细胞悬液1ml，混匀后，置室温下振荡结合3060min（随病毒Ag种类不同）或37水浴30-45min，其间适当振摇。随后以1500rpm离心沉淀10min，并用2倍量的PH7.2PB(内含1%灭活兔血清)洗2遍后，配成1%的致敏红细胞悬液供试验用。以病毒致敏的红细胞悬液应立即使用。4冰箱保存，不宜超过2天。致敏红细胞的保存：用1%兔血清盐水或0.4%明胶缓冲液洗涤，并

28、用其配成2.5%悬液保存备用。长期保存：用含1%糖和4%兔血清的生理盐水，将致敏红细胞配成10%悬液，然后于真空中冷冻干燥。乳胶凝集试验乳胶的预处理取空白乳胶用PBS（PH7.4）配成2%溶液，加入10%的胰蛋白酶液，使其终浓度为1%，于56水溶作用18-24h，其间摇动几次，置4冰箱保存备用使乳胶稳定并减少非特异性凝集。（离心上清，将沉淀用PBS悬浮配成2%乳胶溶液）乳胶的致敏1 将浓缩的病毒抗原作倍比稀释（PBS），加入等量的2%空白乳胶中（逐滴加入，边加边摇动）。37作用15-30min。2 加入10%牛血清白蛋白，使终浓度为1%，混合均匀，3715-30nin，或2h，即得乳胶抗原。（

29、六）标记抗体技术（免疫标记技术）原理：抗体能追踪抗原，在抗原所在部位与之结合，一旦结合后就不易洗脱。但此种结合反应肉眼不易察出。有一些物质在超微量时，即能用某种特殊理化因素将其检测出来。如将这些构标记在抗原或抗体分子上，就能利用调换体与原特异结合的特性，检测抗原或抗体，即免疫标记技术。荧光抗体技术（免疫荧光技术）分类：酶标记抗体技术（免疫酶技术）同位素标记抗体技术（放射免疫测定技术）铁蛋白标记抗体技术免疫荧光技术基本方法和原理1 直接法将标记的特异荧光抗体，直接加在Ag标本上，经一定温度和时间的染色，用水洗去来参加反应的多余荧光抗体，室温干燥后封片，镜检。优点：方法简便，非特异荧光染色因素少。

30、缺点：不够敏感，且一种标记抗体只能检测一种Ag。2 间接法既可检查抗体，也可检查抗原。1） 检查抗原用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗体（二抗）与抗原标本反应，使之形成抗原一抗体抗抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗抗体，干燥封片后镜检。2） 检查AbAb标本为已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤同上。缺点：但特异性较差。可能是间接法的中间层可结合更多的标记抗体所致。优点：敏感性高，且标记一种抗体球蛋白抗体，可用于多种抗原，抗体系统的检查。既可检测Ag，也可检测Ab。3 补体法应用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知Ag或未知Ab。先将未标记的