EMS诱变技术在植物育种中的研究进展.docx

1、EMS诱变技术在植物育种中的研究进展EMS诱变技术在植物育种中的研究进展刘 翔*【摘 要】摘 要:甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS)是一种常用的化学诱变剂，能诱发产生高密度的系列等位基因点突变。在当前种质资源极为匮乏，基因资源日益枯竭的状况下，采用EMS诱发突变技术创造有用基因资源具有极其重要的意义。本文通过对EMS的诱变原理和技术要领、应用实例、以及该技术在现代分子生物学中的应用前景加以阐述，对EMS诱变技术在农业生产中的应用具有重要作用。【期刊名称】激光生物学报【年(卷),期】2014(000)003【总页数】5【关键词】关键词:甲基磺酸乙酯;诱变剂;基

2、因突变0 引言变异是自然界物种进化和选择过程中一个重要的生理现象，是物种进化的原动力，也是保证生物多样性的前提。人们利用一系列物理诱变和化学诱变等方式来追求对物种变异的追求，正是诱变育种的基础所在。通过EMS突变可以改变基因的序列，进而改变基因的功能，从而避免由于转基因所带来的潜在的安全性问题。因此EMS诱变技术是植物的现代分子生物学研究种质资源创新的一种行之有效的方法1。1 EMS诱变的原理和特点常用的植物化学诱变剂主要有烷化剂、碱基类似物、叠氮化物、抗生素、羟胺和吖啶等嵌入染料。烷化剂的诱变原理就是烷化剂能使活性烷基转移到其它电子云密度较高的分子上，从而多方面改变氢键的能力。EMS是一种常

3、见的烷化剂之一，是目前对生物影响最小、效率最高的诱变剂之一，该试剂已经成功应用于各种植物的诱变育种中。EMS的诱变原理如下:EMS分子具有多个能被转移的活性烷基(CH1)，当这些烷基转移到一个电子云密度较高的分子上，可置换碱基中的H原子，该过程即发生了烷化作用。DNA分子上的鸟嘌呤(G)的N7位置是主要烷基化位点之一，该位置被烷基化之后，发生两种遗传效应:一是发生嘌呤和嘧啶的转化突变，即GC突变为AT，这种类型是最主要的类型。二是发生置换型突变，即烷基化鸟嘌呤由于DNA分子上的糖苷键断裂造成该位置缺失，在随后的DNA分子复制过程中，该位置被其他的4中碱基替代。另外由于糖苷键的磷酸化反应，会造成

4、核苷链的断裂，从而造成染色体的缺失2。EMS作为诱变剂，具有如下的物理和化学特征:EMS分子式 CH3SO2OC2H5，无色液体，分子量为124，水中溶解度为8%。pH 7条件下在水中半衰期20时是93 h，30时26 h。EMS能使DNA分子上的嘌呤、嘧啶分子发生烷基化来影响mRNA的转录，随后使蛋白的合成过程发生紊乱，进而改变植物的性状。物理诱变譬如超声波、射线、中子等对物种的损伤较大，容易引起碱基的转换、颠换、移码、染色体缺失、易位、倒位等，从而引起生物的突变和死亡。相对于其它化学试剂诱变或者物理诱变，EMS诱变具有如下特点:1)较高的突变频率和较少的染色体畸变。主要是EMS诱变使DNA

5、分子上产生较多的点突变，对染色体损伤轻而不致引起染色体断裂产生畸变，可以针对农作物的某一特殊性质进行改良。2)对处理材料损伤轻。EMS诱变相对于其它物理诱变的生物损伤小，不容易引起生活力和可育性下降，尤其是无性繁殖的植物由于不经历减数分裂过程繁殖后代，相对于可产生种子的植物，这种突变更容易向后代遗传。3)成本低廉，操作简便。使用的EMS诱变剂处理材料不需要特殊的设备，成本较低，一次可以诱变大量的材料，诱变效果较好。4)EMS诱变剂对人体更具有危险性。EMS具有强烈的致癌性和挥发性，常用5%硫代硫酸钠作为解毒剂，因此在操作过程中要注意安全防护，严格遵守试验规则。2 EMS诱变的方法和技术路线EM

6、S诱变育种中，诱变材料不同，使诱变效率和筛选难度也有差异。一方面要保证诱变剂的有效渗入，二是要使植物能够顺利生长和发育。对于有大量种子的植物而言，种子是理想的处理材料。对于不易获得种子的材料，也可以选择植物的器官和组织进行诱变处理。例如幼穗、花粉、芽、茎、愈伤组织等。处理方法也根据处理材料的不同有所差别，最常用的处理方法有:1)浸泡法，就是把种子、芽等组织浸泡在适当浓度的诱变剂溶液中。以EMS浸泡法构建突变体库最成功的例子就是拟南芥突变体库的构建，通过EMS诱变拟南芥种子可以构建覆盖全基因的突变子3。2)滴液法:在植物茎上划一道较浅的切口，然后将浸透诱变剂溶液的棉球经过切口浸入，此法可用于完整

7、的植株或发育中完整的花序。例如张敏等利用EMS诱变南高丛越橘筛选出了抗旱突变体1。3)共培养法:在培养基中用较低浓度的诱变剂处理根或者花药共培养。例如刘治先等通过EMS处理玉米花药，从而筛选出高油酸玉米的种质材料4。在EMS诱变处理材料的过程中，必须保证有足够的溶液进入细胞，因此被处理的材料必须完全被溶液浸透，如果能够附以搅拌，对增加处理效果。由于EMS容易挥发，因此处理温度最好在20左右，并且在密闭状态下效果较好，这点已经在拟南芥种子EMS诱变中得到证实5。EMS诱变是个复杂的物理和化学过程，尤其是在构建植物突变体库中，为了获得较好的诱变效应，必须正确地掌握EMS诱变剂的最佳剂量5，6。合适

8、的剂量取决于处理材料本身的特点，同时还和处理浓度、处理时间以及处理时的温度等有关。不同的物种对EMS的敏感程度不同，因此对EMS的浓度、处理温度和处理时间的反应效应也不同，必须通过预备试验来确定最佳的处理剂量。例如王长里等利用5种浓度、6个时间梯度共计30个组合处理小麦品种河农822，统计幼苗致死率和突变频率，结果标明幼苗致死率和突变频率在不同处理间，处理时间以及处理浓度间的互作上均产生了明显影响6。随着EMS浓度的升高，致死效应会逐渐升高，一般而言，EMS诱变剂要求降低10%30%的苗高为适宜剂量，这一点已经在小麦、拟南芥等植物突变体库的构建过程中得以证实5，7。对于EMS诱变后代的处理，研

9、究目的不同，后期的技术路线也有差异。根据本实验室构建二穗短柄草突变体库的研究目的，建立如下的研究路线(图1)。该技术要求植物材料经过EMS诱变后，通过第二代M2要筛选出具有表型的突变子，然后通过构建F2作图群体，利用图位克隆技术将突变基因进行克隆，进而研究基因的功能。3 EMS诱变在植物育种中的应用实例EMS诱变技术已作为一种有效的手段广泛应用于植物品质改良与品种选育上，并且创制出了大批具有高产、优质、早熟、矮秆、抗病等农艺性状的新材料和新品种。在农作物育种中，EMS应用最早、最成功的例子是在玉米中，自Neuffer等将EMS溶于石蜡油中处理玉米花粉获得成功后8，随后该技术被广泛应用于筛选出高

10、油酸、高赖氨酸突变体和白玉米、甜玉米、糯玉米等特用玉米类型9-12。EMS诱变也应用于大豆中育种中13，14，韩锁义等利用 EMS对“南农86-4”大豆种子进行诱变，构建了大豆品种的突变体库，并在M3代获得了蛋白质和油含量变化明显的材料14。EMS在高粱育种中也有较好的效果，Xin等从1600个单株的高粱EMS诱变群体中筛选出768个突变体，并利用TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)技术在该突变体库中筛选出了编码咖啡酸甲基转移酶(Caffeic acidomethyltransferase)基因的两个突变体15。EMS诱变在麦类

11、作物育种中的进展也很迅速，例如Slade等利用EMS诱变分别创建了普通小麦和硬粒小麦的突变体库，同时以小麦颗粒淀粉合成酶I(Granule-bound starch synthase I，GBSSI)基因片段为引物，筛选出多个突变体16。徐艳花等利用EMS溶液处理豫农201种子，对获得的M2代植株进行农艺性状及其他生物学性状的表型筛选，结果共获得722份叶、茎、穗和其他性状发生变异的突变体，其中139份叶片性状突变、220份茎秆性状突变、38份穗部和籽粒性状突变、325份其他性状突变，突变频率分别为2.20%、3.49%、0.60%、5.15%，研究初步构建的豫农 201 EMS突变群体可应用

12、于小麦功能基因组研究和小麦遗传改良7。另外EMS技术还广泛应用于谷子等其它农作物的品质改良方面的研究17。现代分子生物学的飞速发展，使植物突变体库的构建成为研究功能基因组学的重要基础。拟南芥、水稻等模式植物的功能基因组研究证明，突变体库的构建在阐明基因功能方面具有重要作用，由于EMS诱变技术的应用，大大推动了植物功能基因组学的发展5，18-20。例如用EMS处理水稻优良籼型恢复系缙恢10号，获得了24份半矮化突变体，为水稻矮化基因资源的丰富和GAs信号传导途径的深入研究创造了条件18。4 EMS诱变的前景随着EMS诱变技术的发展，使得正向遗传学主导的植物功能基因组学得到快速发展，图位克隆技术(

13、Map-based cloning technology)以及定向诱导基因组局部突变技术(Targeting induced local lesions in genomes，TILLING 技术)15，21-23是伴随着 EMS 诱变技术的发展衍生出来的技术。TILLING技术是将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术有机结合，快速有效地从化学诱变剂(如EMS)诱变产生的突变群体中鉴定出点突变。TILLING技术实质上是一种高通量等位变异创制和快速精确鉴定技术，是将传统的化学诱变方法和突变体高效筛选有效结合的全新反向遗传学研究方法。其技术原理是将传统的酶切技术与PCR技术相结合后

14、采用红外双色荧光系统进行结果鉴定，从而筛选出相应的突变体。该方法具有高通量、低成本的特性，从而大大加快了植物基因组学的研究进程22。由于EMS诱变随机性太强、自身突变效率不高、有益突变太少等原因的存在，致使EMS诱变育种无法实现真正意义上的定向诱变育种。近年来，随着分子遗传学研究的深入，利用基因工程技术辅助育种是当前国际研究的热点之一，尤其是CRISP技术，是一种新的对基因组进行高效定点修饰的技术24-26。该技术的原理就是利用细菌编码的酶CAS9能利用引导RNA(guide RNA)分子对特定的DNA片段进行定向切割，在多种类型的细胞和生物体内，这种RNA介导的Cas9酶切作用能够正常地行使

15、功能，在完整基因组上的特定位点完成切割反应。这样就可以方便地进行后续的基因组改造工作。细胞通常会通过两种方式对发生双链断裂的DNA进行修复，这两种方式分别是同源重组修复机制(homologous recombination，HR)和非同源末端连接修复机制(non-homologous end joining，NHEJ)，不过在修复的过程中细胞有可能会对修复位点进行修饰，或者插入新的遗传信息。科学家们利用这种特点开发出了一种能够对基因组进行特异性定点改造的工具，对细胞乃至整个生物体进行基因组改造。目前已经利用这种技术对细菌、人体细胞、斑马鱼、水稻和拟南芥进行过成功的遗传学改造工作。如果改良的个别

16、性状为隐性基因控制的，采用诱变育种的效果较好。改良多个性状而且有些性状为多基因控制的，诱变育种的难度大。在花卉育种中应用诱变育种比较广泛，主要是花卉的改良要求性状特异，并非强调要求种子产量高。采用诱变育种较易获得各种奇特的突变体。因此通过EMS诱变育种与遗传工程的结合，譬如离体培养结合离体诱变和离体筛选具有十分广阔的前景。利用单倍体技术与诱变技术结合具有很多优点，在诱变当代既可发现隐性或显性突变体，还能提高突变率。随着基因重组技术的发展，便有可能直接对DNA施加诱变处理，获得离体诱变，实现“定向诱变”的理想。与其他育种方法一样，诱变育种还有一定的局限性，它是继杂交育种之后发展起来的一种新的育种

17、方法，又是创造新的种质资源，丰富育种材料，具有杂交育种及其他育种方法难以代替的特点。学科间的相互渗透已成为当前科学发展的一大趋势，辐射诱变育种学也必定会在与相邻学科的相互渗透中得到更快的发展。5 总结随着现代分子生物学的发展，使得功能基因组学得到迅速发展，而通过EMS诱变的方式获取突变体库仍是当前最主要的方式之一。该技术具有其它诱变育种方式所不具有的优点，是适合大规模突变的最常用的技术方法。而基于EMS诱变技术衍生出来的基因克隆技术譬如图位克隆技术、TILLING技术，以及基因定向诱变的CRASPR-CAS技术是后基因组时代重大科技进展。本文对EMS技术的原理方法、技术特点、应用实例以及后期展

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