双向电泳实验流程.docx

1、双向电泳实验流程双向电泳实验流程 样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） PDQuest软件分析（Software analysis） 质谱鉴定（Protein identification）目录第一章 实验材料11 IPG预制胶条及载体两性电解质12 蛋白质定量试剂盒及其试剂13 蛋白样品制备试剂

2、盒及其试剂14 化学试剂15 蛋白质Marker16 染色试剂17 注意事项第二章SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 1 溶液的配制2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制2. 3 操作方法2. 4 注意事项第三章双向电泳3. 1 溶液配制3. 2 操作步骤3. 3 注意事项附录1 双向电泳完整的操作步骤附录2聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3细胞样品的一般处理步骤附录4组织样品的一般处理步骤第一章 实验材料11 IPG预制胶条及载体两性电解质（一）IPG预制胶条（美国Bio-Rad公司），-20冰箱保存，每包12根项目 规格 货号 原价(元)IPG预制胶条 pH 3-10， 7 cm 163

3、-2000 799IPG预制胶条 pH 3-10， 7 cm ，nonlinear（NL） 163-2002 799IPG预制胶条 pH 4-7， 7 cm 163-2001 799IPG预制胶条 pH 3-6， 7 cm 163-2003 799IPG预制胶条 pH 5-8， 7 cm 163-2004 799IPG预制胶条 pH 7-10， 7 cm 163-2005 799IPG预制胶条 pH 3.9-5.1， 7cm 163-2028 799IPG预制胶条 pH 4.7-5.9， 7cm 163-2029 799IPG预制胶条 pH 5.5-6.7， 7cm 163-2030 799I

4、PG预制胶条 pH 6.3-8.3， 7cm 163-2031 799IPG预制胶条 pH 3-10， 11cm 163-2014 957IPG预制胶条 pH 3-10， 11cm，nonlinear（NL） 163-2016 957IPG预制胶条 pH 4-7， 11cm 163-2015 957IPG预制胶条 pH 3-6， 11cm 163-2017 957IPG预制胶条 pH 5-8， 11cm 163-2018 957IPG预制胶条 pH 7-10， 11cm 163-2019 957IPG预制胶条 pH 3.9-5.1， 11cm 163-2024 957IPG预制胶条 pH 4.

5、7-5.9， 11cm 163-2025 957IPG预制胶条 pH 5.5-6.7， 11cm 163-2026 957IPG预制胶条 pH 6.3-8.3， 11cm 163-2027 957IPG预制胶条 pH 3-10， 17cm 163-2007 1079IPG预制胶条 pH 3-10， 17 cm，nonlinear（NL） 163-2009 1079IPG预制胶条 pH 4-7， 17cm 163-2008 1079IPG预制胶条 pH 3-6， 17cm 163-2010 1079IPG预制胶条 pH 5-8， 17cm 163-2011 1079IPG预制胶条 pH 7-10

6、， 17cm 163-2012 1079IPG预制胶条 pH 3.9-5.1， 17cm 163-2020 1079IPG预制胶条 pH 4.7-5.9， 17cm 163-2021 1079IPG预制胶条 pH 5.5-6.7， 17cm 163-2022 1079IPG预制胶条 pH 6.3-8.3， 17cm 163-2023 1079IPG预制胶条 pH 3-10， 18cm 163-2032 1079IPG预制胶条 pH 3-10， 18cm，nonlinear（NL） 163-2033 1079IPG预制胶条 pH 4-7， 18cm 163-2034 1079IPG预制胶条 pH

7、 3-6， 18cm 163-2035 1079IPG预制胶条 pH 5-8， 18cm 163-2036 1079IPG预制胶条 pH 7-10， 18cm 163-2037 1079IPG预制胶条 pH 3.9-5.1， 18cm 163-2038 1079IPG预制胶条 pH 4.7-5.9， 18cm 163-2039 1079IPG预制胶条 pH 5.5-6.7， 18cm 163-2040 1079IPG预制胶条 pH 6.3-8.3， 18cm 163-2041 1079IPG预制胶条 pH 3-10， 24cm 163-2042 1292IPG预制胶条 pH 3-10， 24c

8、m，nonlinear（NL） 163-2043 1292IPG预制胶条 pH 4-7， 24cm 163-2044 1292IPG预制胶条 pH 3-6， 24cm 163-2045 1292IPG预制胶条 pH 5-8， 24cm 163-2046 1292IPG预制胶条 pH 7-10， 24cm 163-2047 1292IPG预制胶条 pH 3.9-5.1， 24cm 163-2048 1292IPG预制胶条 pH 4.7-5.9， 24cm 163-2049 1292IPG预制胶条 pH 5.5-6.7， 24cm 163-2050 1292IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，

9、24cm 163-2051 1292（二）载体两性电解质（美国Bio-Rad公司），4冰箱保存项目 货号 原价(元)Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，10ml 163-1112 1704Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，25ml 163-1113 2463Bio-Lyte 3/5 Ampholyte，20%，10ml 163-1132 3275Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，10ml 163-1142 3713Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，25ml 163-1143 9287Bio-Lyte 5/7 Am

10、pholyte，40%，10ml 163-1152 2984Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，25ml 163-1153 7540Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1162 3569Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1163 8187Bio-Lyte 7/9 Ampholyte，40%，10ml 163-1172 3479Bio-Lyte 8/10 Ampholyte，20%，10ml 163-1182 1912Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1192 327

11、5Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1193 8114（三）等电聚焦上样缓冲液（美国Bio-Rad公司），4冰箱保存项目 货号 原价(元)100ReadyStrip Buffer，for pH 7-10 IPG Strips，1ml 163-2093 744Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，100，1ml 163-2094 396100ReadyStrip Buffer，for pH 6.8-8.3 IPG Strips，1ml 163-2095 566100ReadyStrip Buffer，for pH 5.5-6.7 IPG Strip

12、s，1ml 163-2096 774100ReadyStrip Buffer，for pH 4.7-5.9 IPG Strips，1ml 163-2097 545100ReadyStrip Buffer，for pH 3.5-5.1 IPG Strips，1ml 163-2098 59212 蛋白质定量试剂盒及其试剂项目 货号 报价(元)Protein Assay Kit，bovine -globulin standard 500-0001 919Protein Assay Kit，BSA standard 500-0002 919Protein Standard，bovine -globul

13、in，1 bottle 500-0005 429Protein Assay Dye Reagent Concentrate，450ml 500-0006 690Protein Standard，bovine serum albumin，1 bottle 500-0007 365Quick Start Protein Assay Kit,Bradford法 500-0201 934Dc Protein Assay Kit ,bovine -globulin standard 500-0111 2281Dc Protein Assay Kit ，BSA standard 500-0112 2281

14、RC DC Protein Assay Kit，-globulin ，Lowry法 500-0121 3183RC DC Protein Assay Kit，BSA standard ，Lowry法 500-0122 318313 蛋白样品制备试剂盒及其试剂项目 货号 原价(元)Ready-Prep 2-D Cleanup Kit 163-2130 2533ReadyPrep Sequential Extraction Kit 163-2100 2969Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml 163-2101 539ReadyPrep Sequential Ext

15、raction Kit Reagent 1，1vial 163-2102 1116ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2，1vial 163-2103 909ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 3，1vial 163-2104 646ReadyPrep 2-D Starter Kit 163-2105 3250ReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer 163-2106 331ReadyPrep Starter Kit Equili

16、bration Buffer，with DTT 163-2107 508ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer 163-2108 498E.coli Protein Sample，lyophilized，2.7mg 163-2110 446ReadyPrep Overlay Agarose，50ml 163-2111 287ProteoMiner Protein Enrichment SmallCapacity Kit 163-3006 3699ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit 16

17、3-2007 5618Aurum Serum Protein Mini Kit 732-6701 1513Aurum Affi-Gel Blue Mini Columns 732-6708 1873ReadyPrep Protein Extraction Kit (Cytoplasmic/Nuclear) 163-2089 4919ReadyPrep Protein Extraction Kit (Membrane I) 163-2088 4919ReadyPrep Protein Extraction Kit (Membrane II) 163-2084 2986ReadyPrep Prot

18、ein Extraction Kit (Signal) 163-2087 281514 化学试剂项目 货号 原价(元)尿素Urea，250g 161-0730 222尿素Urea，1kg 161-0731 685AG 501-X8（D）Mixed Bed Resin 142-6425 2771CHAPS，1g 161-0460 390Triton X-100，500ml 161-0407 421DTT（Dithiothreitol），1g 161-0610 291DTT（Dithiothreitol），5g 161-0611 731Tributylphosphine（TBP），200mM，0.

19、6ml 163-2101 539碘乙酰胺Iodoacetamide，30g 163-2109 1429溴酚蓝（Bromophenol Blue），10g 161-0404 501矿物油（Mineral Oil），500ml 163-2129 298SDS，100g 161-0301 368SDS，1kg 161-0302 1991Tris，500g 161-0716 813Tris，1kg 161-0719 1151低熔点琼脂糖，25g 161-3111 1360甘氨酸，1kg 161-0718 713甘氨酸，2kg 161-0724 1671丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，50

20、0g 161-0101 919丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，2kg 161-0103 3411丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，1kg 161-0107 1870丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，5kg 161-0108 8514甲叉双丙烯酰胺（Bis），5g 161-0200 294PDA（Piperazine Diacrylamide），10g 161-0202 1902PDA（Piperazine Diacrylamide），50g 161-0203 17361过硫酸氨（Ammonium Persulfate），10g 161-0700 155过硫

21、酸氨（Ammonium Persulfate），100g 161-0754 1153TEMED，5ml 161-0800 207TEMED，50ml 161-0801 485甘油 Sigma硫尿 Sigma15 蛋白质标准品Marker项目 货号 原价(元)Unstained SDS-PAGE Standards，high range，200l 161-0303 689Unstained SDS-PAGE Standards，low range，200l 161-0304 689Unstained SDS-PAGE Standards，broad range，200l 161-0317 884

22、Polypeptide SDS-PAGE Standards，200l 161-0326 692Prestained SDS-PAGE Standards，high range，500l 161-0309 689Prestained SDS-PAGE Standards，low range，500l 161-0305 689Prestained SDS-PAGE Standards，broad range，500l 161-0318 800Precision Plus Std Unstained，1ml 161-0363 1168Precision Plus Std Dual Color，50

23、0ul 161-0374 10802-D SDS-PAGE Standards，500l 161-0320 1457IEF Standards，pI range 4.45-9.6，250l 161-0310 162116 染色试剂项目 货号 原价(元)Coomassie Brilliant Blue R-250，10g 161-0400 413Coomassie Brilliant Blue G-250，10g 161-0406 670Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions Kit 161-0435 1440Coomassie Bri

24、lliant Blue R-250 Staining Solutions，1L 161-0436 464Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，41L 161-0437 1856Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，1L 161-0438 488Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，41L 161-0439 1952Bio-Safe Coomassie Stain，1L 161-0786 878Bio-S

25、afe Coomassie Stain，5L 161-0787 3493SYPRO Ruby Protein Gel Stain，200ml 170-3126 2226SYPRO Ruby Protein Gel Stain，1L 170-3125 5725SYPRO Ruby Protein Gel Stain，5L 170-3138 16744Silver Stain Kit 161-0443 3933Silver Stain Plus Kit （质谱兼容） 161-0449 285417 注意事项1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级，尽量选用进口试剂。2.双向电泳中使用超纯

26、水。3.所有包含尿素的溶液加热温度不超过30，否则会发生蛋白氨甲酰化。详细订货信息请致电: -128广州誉维生物科技仪器有限公司Bio-Rad产品专员 唐佩君第二章 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 1 溶液的配制30% 聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙烯酰胺 4g 超纯水 500ml滤纸过滤后，棕色瓶4冰箱保存1.5mol/L Tris碱 pH8.8 Tris碱 90.75g 超纯水 400ml用1mol/L HCl调pH至8.8，加超纯水定容至500ml，4冰箱保存。0.5mol/L Tris碱 pH6.8 Tris碱 12g 超纯水 120ml用1mol/L HCl调p

27、H至6.8，加超纯水定容至200ml。4冰箱保存。10% SDS SDS 10g 超纯水 100ml混匀后，室温保存。10% Ap Ap 0.1g 超纯水 1ml（用时加水溶解）溶解后，4冰箱保存10电泳缓冲液（1= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）Tris碱 30g甘氨酸 144gSDS 10g超纯水 1L 混匀后，室温保存2SDS-PAGE上样缓冲液0.5M pH6.8 Tris碱 2.0ml10% SDS 4.0ml甘油 2.0ml1% 溴酚蓝 0.05ml超纯水 定容至10mlDTT 0.154g（用时现加）2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制参见附录12. 3 操作方法1. 将玻璃板洗净、晾干、固定。2. 按照实验要求，配制不同浓度的分离胶。将分离胶注入玻璃板夹层中，上部用超纯水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，配制浓缩胶。3. 配制好浓缩胶后，倒去分离胶表面的少量水分，然后灌入浓缩胶，插入点样梳。4. 将待分析鉴定的蛋白质样品，