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1、分子生物学实验课考试资料 分子考试资料整理1. 质粒DNA的构型与电泳速率的关系？答：DNA分子的迁移速率取决于由DNA分子的大小与构型而形成的分子筛效应。在相同的构型下，DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。当琼脂糖凝胶的浓度较低时，电泳速率为：超螺旋DNA线性DNA开环DNA。2. 碱裂解法提取质粒DNA的原理以及三种溶液的作用？基本原理 质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开

2、，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。三种溶液的作用（ 溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS (新鲜的)；溶液III，3 M

3、 醋酸钾 / 2 M 醋酸。）溶液I: Tris-Cl:适当pH值,葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解,悬 浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部, EDTA:抑制DNase的活性，和抑制微生物生长(是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂)溶液II：NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂。 这一步要记住两点：第一，不能用旧的NaOH；第二，时间不能过长， 必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。SDS: 是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-S

4、O3-R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 溶液III：醋酸钾: K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去；高浓度的盐，使得沉淀更完全（在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或KAC，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀）。2 M的醋酸:中和NaOH，创造质粒复性的环境。3. 感受态细胞制备过程应注意的问题；细胞的生长状态和密度 最好从-70甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5107个左右为佳。即应用对数期或对数生长

5、前期的细菌，可通过测定培养液的OD600（0.4-0.5）控制。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同；受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。质粒DNA的质量和浓度 一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%；对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低；重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。整个操作过程均应在无菌条件下进行 ，所用器皿及试剂都要灭菌。用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染

6、 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴 CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；4. 挖胶过程应注意什么？保证切下的条带没有外源DNA的污染。切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积。切胶时尽量在长波长下进行，减少紫外对DNA的损伤。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，可采用薄而宽的梳子来跑胶。5. 如何灭活RNase？A. RNase 灭活剂 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活

7、性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。B.RNase灭活剂C.玻璃器皿200高温烘烤2小

8、时D.塑料器皿焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液处理。6. 提取RNA和DNA时所用的饱和酚有什么不同？水饱和酚又叫水平衡酚。水饱和酚的PH小于7，一般是PH为5.0左右，通常与异硫氢酸胍一起使用，用于细胞RNA的提取，在酸性环境中，DNA在酚相，RNA在水相。两者就分开了。Tris饱和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。其中，酚是强的蛋白变性剂，可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。 由于PH值大于7，在碱性环境中DNA处于水相，RNA处于有机相。从而分离上清，即可得到DNA。7. 如何减少蛋白诱导过程中包涵体的产生？降低诱导温度，一般15-25降低诱导剂ITPG浓度使用中等强度或弱的启动子进

9、行融合表达增加蛋白质折叠的添加剂与伴侣分子和折叠酶共表达选择突变的菌株优化培养基条件7. 单酶切时，为提高连接效率应采取什么措施？为什么？通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其末端的磷酸基，防止环化， 通过连接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。8. 连接反应中，插入片段与载体的合适比例是多少？ 载体与目的基因摩尔数之比为1：3-5 如果插入片段较小，而载体较大，和载体的摩尔比例3-6:1连接效果好，如果载体和插入片段大小相近，摩尔比1：1较好；如果插入片段和载体的摩尔比例过大，会导致多克隆的插入；如果插入片段和载体的摩尔比例过小，会导致假阳性增多。 9. 筛选阳性克隆的方法？ 菌落P

10、CR、酶切鉴定、Cracking gel、菌落原位杂交、测序10. 蓝白斑筛选的原理是什么？如何出现大量蓝斑，可能是什么原因？蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：许多载体（PUC序列）都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）。受体菌含编码-半乳糖苷酶C端aa序列。当无外源基因插入时，载体表达的N端-半乳糖苷酶多肽与受体菌表达的C端-半乳糖苷酶多肽功能互补，具有-半乳糖苷酶活性。可以将生色底物X-gal分解成蓝色物质，从而在培养基中形成蓝色菌落。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点

11、后，造成插入失活，而使表达的产物不具有-半乳糖苷酶活性，不能分解底物X-gal，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。原因：1）载体与目的基因连接做的不好，重组质粒太少，大量的自连载体进入感受态细胞。2）酶切不完全，未被酶切的空载体进入感受态细胞。11. 已知一个基因的核酸序列，如何进行蛋白表达？步骤？目的基因的获取：提取RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，根据核酸序列设计引物，PCR扩增目的基因克隆载体的选择与构建：提取质粒DNA重组质粒的构建，即外源基因与表达载体的连接：双酶切，电泳检测，切胶回收目的片段，连接，获得重组质粒。重组DNA导入受体菌：转化，将重组质粒导入受体菌 重组体的

12、筛选：用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并将阳性菌落保存留种。克隆基因的表达：先将菌种复苏、扩繁；用IPTG分别诱导阳性克隆菌和空载体菌；取适量蛋白样，处理好后，上样、跑胶，染色、脱色、拍照。观察重组蛋白的表达情况。a. 对于阳性克隆菌，向5ml菌液中加入IPTG至终浓度0.6mM（30ul 0.1M IPTG），继续震荡培养；b. 对于空载体菌，向5ml菌液中加入30ul 0.1M IPTG （终浓度0.6mM IPTG）；12.质粒的特点是什么？结构：大多为共价、闭合环状、超螺旋（circular covalently closed DNA,cccDNA)功能：正常生长非必须的，但赋予细菌某些

13、性状特征（具有遗传标记）复制和遗传：细菌内的共生型遗传因子，其复制独立于细菌染色体,但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。可以转移。13.PCR的原理是什么？PCR程序通常有哪几个步骤？聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR）是模拟体内DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。 每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。步骤：PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使

14、之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。14.当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？ 答：要避免星活性及部

15、分酶切。（1）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（2）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；（3）先低温酶，后高温酶；（4）使用通用缓冲液。15.大肠杆菌转化（CaCl2法）的原理？ 0下，细菌处于CaCl2的低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，DNA与CaCl2形成羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经42短时间热击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子基因得以表达，在抗生素选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。16.感受态细胞制备及转化中

16、的影响因素？细胞的生长状态和密度 最好从-70甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600（0.4-0.5）控制。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同；受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。质粒DNA的质量和浓度 一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%；对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低；重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环

17、状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。整个操作过程均应在无菌条件下进行 ，所用器皿及试剂都要灭菌。用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴 CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；17.CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，低温的主要目的是什么？热休克温度和目的是什么？低温目的：（1）抑制细胞的旺盛生理代谢；（2）有助于DNACa2+吸附于细胞表面（3）

18、防止DNAase降解DNA 。 热休克温度是42；目的是使细胞摄入吸附于其表面的DNA。18.影响PCR扩增的因素有那些？ 引物的质量与特异性；PCR循环条件（退火温度）；Mg2+浓度；模板DNA的质量；酶的质量。 19.引物设计的基本原则？引物长度一般在1825碱基之间。避免引物内和引物之间的二级结构两个引物的Tm值要接近。 G+C含量在40%60%之间，避开局部富含GC或AT，3端避开AT rich结构 碱基要随机分布。 引物之间不能有连续4个碱基的互补，特别是3末端的3个碱基。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。引物5端可以修饰，引物3端不可修饰。20.SDS-PAGE的原理？SD

19、S是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键， 使蛋白质变性而改变原有的构象。蛋白质分子与SDS充分结合。PAGE聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bi )在加速剂N N N N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵 (简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。21.SDS-PAGE电泳的速率为什么只与蛋白的分子量有关，而与所带电荷多少无关？蛋白质分子与SDS充分结合后，所带的SDS的负电荷远远大于蛋白质本身的电荷量，因而就掩蔽或消除了不同种类蛋白质分子间的电荷差异对电泳迁移率的影响。电泳迁

20、移率主要取决于蛋白质的分子量。22.提取RNA过程中，怎样才能有效地降低材料本身给RNA提取带来的降解？ 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直

21、接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高 23.异硫氰酸胍法提取RNA的原理？ 异硫氰酸胍可以裂解细胞释放出核酸，并同时使蛋白质变性，抑制内源的RNase活性。在酸性条件下（NaAc pH4.0），RNA溶于水相，而DNA溶于有机相。这样，在加入苯酚/氯仿后，RNA就溶于上层水相

22、中，而DNA溶于下层苯酚/氯仿中，蛋白处于中间层。含有RNA的水相被转移出来以后，在异丙醇的作用下沉淀，从而被分离出来。24. 理想状态下DNA、RNA OD260/280分别为多少？在什么范围比较合适？偏大或偏小分别说明什么？基因组DNA 1.7OD260/OD2801.9，质粒DNA OD260/280: 1.8-2.0；DNA: 1.8 (RNA: 2.0)，比值2.0: RNA污染理想的RNA2.0, OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解。 如果OD260/OD280过低（25 min ；异丙醇沉淀：0.6-1倍体积的异丙醇。

23、39.mRNA的分离纯化：采用Oligo dT-纤维素，从总RNA中分离出mRNA。该法利用mRNA 3末端有Poly（A）的特点，在总RNA流经寡聚（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下， mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时，mRNA被洗脱下来。一般而言，经过二次Oligo dT柱后，可得到较高纯度的mRNA。40.核酸的贮存DNA保存：1）短期贮存： 4或-20存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液(PH为8)，可减少DNA脱氨反应；EDTA可以抑制DNase的活性。2）长期贮存：TE缓冲液中-70保存数年；41.提取基因组DNA主要试剂的作用： EDTA： 二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性SDS的作用：溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对RNA、DNA酶有抑制作用；与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质；蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。苯酚的特点：蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性；苯酚溶于有机溶剂，微溶于水；提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率；氧化苯酚会破坏DNA。42.为什么苯酚要重蒸饱和