农杆菌介导的玉米遗传转化及再生体系的建立.docx

1、农杆菌介导的玉米遗传转化及再生体系的建立农杆菌介导的玉米遗传转化及再生体系的建立摘要: 为了建立玉米高频再生及高效遗传转化体系，本研究选用玉米自交系178，昌72，郑58，H736760A，MQ704，2193为材料，对影响玉米成熟胚愈伤组织诱导、继代培养及分化的因素进行了研究。结果表明：高浓度的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）（4.0mg/L）是诱导愈伤组织必须的；在继代培养基中添加适量的2,4-D（2.0mg/L）、6-苄基嘌呤（6-BA）(0.2mg/L)和硝酸银（AgNO3）（10mg/L）能显著增加胚性愈伤组织的形成；在分化培养基中添加0.5mg/L 6-BA有利于提高愈伤组织的分

2、化频率。这个体系的建立，为以成熟胚为受体系统的遗传转化体系奠定了基础。关键词: 玉米；成熟胚；愈伤组织；转化；植株再生Establishment of transformation system and regeneration system of maize mediated by Agrobacterium tumefaciensAbstract: In order to establish the system of high-frequency regeneration and high-efficiency genetic transformation in maize, the i

3、nbred line 178, Chang72, Zheng58, H736760A, MQ704, 2193 have been chosen to study on initiation, maintenance and differentiation of calli in this paper. The results showed that inclusion higher concentration of 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D, 4.0 mg/L) into induction medium was a critical fact

4、or for producing primary calli. Supplement with optimal level of 2,4-D(2.0 mg/L), 6-Benzylaminopurine(6-BA, 0.2 mg/L)and silver nitrate(10 mg/L)in the subculture medium significantly promoted the formation of embryogenic calli. And the addition 0.5 mg/L of 6-BA into regeneration medium has significa

5、ntly increased the frequency of plant regeneration. This efficient regeneration system provides a solid basis for genetic transformation of maize.Key words: Maize; Mature embryo; Calli; Transformation; Plant regeneration摘要ABSTRACT目录1序言 42玉米再生及基因转化体系的研究 42.1玉米再生体系的发展历程 42.2玉米再生及基因转化体系的材料选择 42.3玉米再生体系

6、的影响因素 52.4玉米遗传转化的发展过程 52.5玉米遗传转化方法 62.5.1 电激法 62.5.2 花粉管通道法 72.5.3 PEG法 72.5.4 基因枪法 72.5.5农杆菌介导法 82.6玉米再生及遗传转化的常用受体 92.6.1愈伤组织再生系统 92.6.2原生质体再生系统 92.6.3种质系统 92.6.4直接分化再生系统 102.7本实验研究内容 103玉米成熟胚再生体系的建立 113.1材料与方法 113.1.1 材料 113.1.2实验方法 113.1.2.1 外植体的选择与预培养 113.1.2.2愈伤组织的诱导 113.1.2.2 胚性愈伤组织的形成及愈伤组织的继代

7、 123.2结果与分析 123.2.1玉米种子的预培养 123.2.2愈伤组织的诱导 133.2.3 胚性愈伤组织的形成 153.2.4 AgNO3对胚性愈伤组织形成的影响 163.2.5愈伤组织的分化 163.3 结论与讨论 174 农杆菌介导的玉米转化体系的建立 184.1材料与方法 184.1.1 材料 184.1.2 培养基配制 184.1.3转化方法 194.1.3.1 侵染液的准备 194.1.3.2 侵染 204.1.3.3 抗性愈伤的筛选 204.2 结果与分析 205 参考文献 226致谢 24附录 251序言玉米是早熟禾科(Poaceae)玉蜀黍族(Maydeae)一年生谷

8、类植物，学名Zea mays，起源于北、中、南美洲。植株高大，茎强壮，挺直。叶窄而大，边缘波状，于茎的两侧互生。雄花花序穗状顶生。雌花花穗腋生，成熟后成谷穗，玉米具粗大中轴，小穗成对纵列后发育成两排籽粒。谷穗外被多层变态叶，称作包皮。籽粒可食。 玉米作为重要的粮食作物之一，已成为转基因研究的主要对象。其遗传转化受体系统的研究，亦已受到各国学者的广泛关注。利用基因工程开展玉米育种，首先应建立受体植株的高频再生体系，因为玉米不同的基因型，甚至不同的外植体，其再生能力都存在极大的差异。高效的玉米组织培养和植株再生体系的建立为玉米遗传转化和细胞工程研究创造了有利条件。因此，玉米优良品系再生体系的建立是

9、玉米分子设计育种的基础。2玉米再生及基因转化体系的研究2.1玉米再生体系的发展历程玉米组织培养技术得到很大发展，为玉米遗传转化提供了大量可供选择的受体系统。在研究中发现，外植体的来源部位、生理状态和基因型等因素对胚性愈伤组织的诱导和植株再生有较大影响。自1975年Green和Phillips利用玉米幼胚作为外植体诱导出了二倍体愈伤组织并成功获得再生植株以来，利用玉米花药、雌雄幼穗、胚叶等多种外植体诱导出愈伤组织，其中幼胚是目前使用最多的外植体。2.2玉米再生及基因转化体系的材料选择玉米幼胚作为外植体取材受到地理条件、季节和发育阶段的严格限制。相比之下，成熟胚取材方便，不受时间和数量的限制，是一

10、种较理想的培养材料。Green等首次报道利用成熟胚可以诱导愈伤组织，但没有再生植株；Wang和Huang通过改进培养基配方成功获得再生植株。玉米成熟胚诱导愈伤组织具有很强的基因型依赖性，再生频率较低，因此开展更深入的研究，建立成熟胚再生体系将是十分有意义的。2.3玉米再生体系的影响因素玉米组织和细胞的培养主要采用MS和N6培养基，二者对于不同品种和品系玉米愈伤组织的植株再生影响不同。MS与N6的主要区别在于氮源的形式不同。此外激素的选择也影响愈伤组织的生成，2,4-D是影响组织脱分化的关键因素，较高浓度的2,4-D（1 2mg/l）诱导外植体脱分化产生愈伤组织，降低或不加2,4-D愈伤组织才能

11、分化出完整的胚状体并在生出小植株。2.4玉米遗传转化的发展过程1987年，Grimsley等首先用胭脂碱农杆菌C58将玉米条纹病毒(Maize Streak Virus)的cDNA转化玉米幼苗分生组织或靠近生长点的部位，98%的玉米叶片表现了病毒感染性状，说明T-DNA已经转化到玉米细胞中，从而给农杆菌介导的玉米遗传转化带来了一缕曙光。Schalappi等1用同样的方法侵染A188、W23等玉米幼胚，经过扫描镜观察也得到了类似的结果。Gould用含有普通双元载体的农杆菌侵染玉米Funks G90的茎尖获得了转基因玉米，并且外源基因已整合并遗传到R1代，但其稳定性效果欠佳。农杆菌侵染单子叶植物的

12、第一个比较成功的例子来自于Chan和Hiei的研究，他们首次用农杆菌转化水稻的未成熟胚获得了外源基因能稳定遗传的转基因水稻。农杆菌介导的玉米遗传转化随后也取得了重大进展。1996年，Ishida等2用含有A281(对高等植物侵染力很强的菌株)VirB、VirC、VirG基因的超双元载体pSB131和pTOK233转化A188及其杂交种的未成熟胚，转化频率高达5% 30%。同时外源基因能稳定整合和表达，并且70%的转基因玉米可育。这个实验有力地说明农杆菌对单子叶植物和双子叶植物具有相同的转化机制，是玉米遗传转化过程中的一个里程碑。其后用超双元载体分别转化A188和Hi II也得到类似的结果。此后

13、玉米农杆菌转化的研究主要以优化转化条件，提高转化效率为主。其中最值得关注的是Frame等用普通双元载体pTF102转化Hi II的未成熟胚，在L-半胱氨酸存在的条件下平均转化效率高达5.5%，Southern blot和分子鉴定R0、R1、R2代转基因玉米表明GUS和选择标记基因bar已稳定整合到玉米基因组中并表达。虽然普通双元载体的转化效率(5.5%)远远低于超双元载体的转化效率(33% 51%)，但普通双元载体的普遍应用使得用这种载体进行农杆菌转化具有更大的潜力。农杆菌与外植体共培养条件的优化、提高Vir基因表达条件的优化和使用毒性更低的标记基因将会是提高玉米农杆菌普通双元载体转化效率的重

14、点。外植体取材的季节限制也一直是玉米遗传转化的限制因素，让人高兴的是这种局限性正在逐渐减少。最近，Sidorov等用农杆菌介导法对7 10 d玉米幼苗诱导的I型愈伤进行转化，转化频率为2% 10%。同时由于这些转基因后代拷贝数低并符合孟德尔遗传规律，因此这种方法可以代替未成熟胚诱导愈伤组织进行转化。Wang等用农杆菌转化受伤的玉米籽粒也获得了较理想的转化频率，由于这种方法受体材料取材简单方便，因此也是一种很有希望的方法。Vega等尝试用低盐的N6培养基配合使用二硫苏糖醇和L-半胱氨酸转化Hi II玉米，发现能比较显著的提高普通双元表达载体的转化频率，平均转化频率最高达到18%。国内对农杆菌介导

15、的玉米遗传转化起步较晚，黄璐和卫志明首次报道用农杆菌转化法获得了杂交种苏玉1号的转基因玉米，张荣等用此方法获得自交系P9 10的转基因玉米。权瑞党等报道将农杆菌侵染和真空渗入、部分酶解及超声波处理等方法相结合，转化玉米愈伤组织得到了转基因植株。近年来，Huang等报道用菌株EHA105介导玉米优良自交系幼胚转化，得到了比较理想的结果，转化效率平均达到23.8%。Yan等通过嘌呤、嘧啶抑制剂和表面活性剂Silwet L-77处理提高了农杆菌对掖515和齐319的转化频率。2.5玉米遗传转化方法2.5.1 电激法电激法转化外源基因是用短时、高脉冲电处理细胞，使细胞膜出现可恢复性孔隙，从而产生新的渗

16、透点(3 4 nm) ，为外源DNA 进入细胞提供了通路。该方法最早应用于动物细胞。Fromm 等用电激法转化玉米原生质体，得到了转化愈伤组织。Rhodes 等用电激法转化玉米原生质体，首次获得了完整的转基因植株。近年来，人们又将原来用于原生质体转化用的电激法用于完整细胞的转化，分别以幼胚、愈伤组织和胚性悬浮细胞系为受体，并且获得了转基因植株。DHallumK等以玉米幼胚和型愈伤组织为受体，用电激法导入neo (neomycin phosphotransferase) 基因，获得了可育的转基因植株，而且neo 基因能稳定地遗传给后代。Laursen 等通过电激法导入bar 基因，也获得了可育的

17、转基因玉米。柯遐义3等利用自制的脉冲式放电电激仪，以具有再生能力的玉米幼胚作受体，成功地将外源基因导入玉米的幼胚细胞并获得转基因植株。电激法不受宿主限制，可以用于原生质体、愈伤组织、胚性悬浮细胞系、幼胚等，操作简单，但转化效率低，在玉米遗传转化技术研究初期应用较为广泛。2.5.2 花粉管通道法花粉管通道法是在植物整体水平进行目的基因DNA 片段的导入，直接获得转化种子，通过后代的筛选获得带有目的基因的片段。由于其利用自身的生殖系统作为载体，被众多研究者采用。1986 年Ohta 在美国科学院院报(PNAS) 上报道，应用外源DNA 与玉米花粉混合授粉，F0代种子的转化率高达10%。丁明忠利用花

18、粉管通道法和减压渗透法将大豆总DNA 导入玉米自交系4822和S37，在743份后代材料中筛选出8份高蛋白含量变异材料。关淑艳等利用花粉管通道技术将淀粉分支酶基因的反义表达载体转入玉米自交系中，通过PCR 检测得到转基因的种子，同时探讨了不同导入时间、不同DNA 浓度、不同导入量等对其转化率的影响。张慧英等提取糯质玉米DNA 利用花粉管通道法导入甜玉米自交系，其后代植株产生了变异，主要表现在株高、穗位高、叶面积等性状上的差异；经观察，D3 代各变异性状趋向稳定，从而为以后通过不同种之间的DNA 导入创造玉米新的变异品系提供了可参考的理论依据。花粉管通道法无基因型限制且易实现大规模基因转化，而且

19、不需要昂贵的仪器设备和组织培养技术，但是产生变异后代的类型特别丰富，因此对后代的检测比较繁琐。2.5.3 PEG法1993 年，Golovkin 等用PEG法将H89 的原生质体分别与含有CaMV35S 启动子和鼠二氢叶酸还原酶(DHFR) 突变基因(氨甲喋呤抗性) 的质粒pMP 和pDMP 共培养，其中pDMP 的mdhfr 基因插入了玉米Ds1 转座子，用氨甲喋呤筛选得到抗性愈伤组织，在不含激素的培养基上再生出植株。Omirulleh 等用PEG法将外源基因导入到由HE89的悬浮细胞系分离得到的原生质体，建立了植株再生的转化体系。PEG法转化效率较高，但必须以裸露的原生质体为受体，而且还受

20、到基因型的限制。2.5.4 基因枪法基因枪法又称微粒枪法、微粒轰击法(gene gun ，particle gun ，particle bombardment) ，是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞的一种转化技术。1987 年，美国康奈尔大学的Sanford 等研制出火药引爆的基因枪，又和该校工程技术专家Wolf 及Klein 合作研究基因转移的新方法。因为它利用高速运动的金属粒子，可以非特异地将外源基因导入植物的细胞、组织和器官，不再受到受体基因型的限制，又能避开原生质体再生的障碍，为玉米遗传转化掀开了新的一页。根据基因枪动力系统的不同，可将它们分为3 类：火药式基因枪；放电式基因枪

21、；气动式基因枪。影响基因枪转化玉米效率的因素包括：不同受体材料对玉米再生的影响；基因型对玉米体细胞再生能力的影响；培养条件对玉米体细胞再生能力的影响；质粒DNA 的包被等。2.5.5农杆菌介导法农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，具有转化的外源DNA 结构完整、转化机理清楚、整合位点较稳定、拷贝数低、整合后的外源基因结构变异较小等优点，因而倍受重视。单子叶植物曾被认为不在农杆菌的宿主范围之内，由此而发展了原生质体吸收及基因枪轰击等直接的基因转化方法，但是在实践中发现这些方法还存在着受基因型及再生体系的限制、拷贝数多、易出现基因表达沉默等不足。因此，国际上近年来又将注意力转向农杆菌介导的单子叶

22、植物基因转化方法的研究，并取得了明显的进展。Grimsly 等首次以玉米为材料，用农杆菌将玉米条纹病毒(MSV) 的cDNA 导入玉米植株中，使植株表现了系统感染症状，这个报道有力地证明了农杆菌能侵染玉米。Gould 等(1991)用gus 报告基因和Npt 基因通过农杆菌介导法转化玉米Funk G90 的芽尖，得到的再生植株及其子一代基因组中带有标记基因，从而为建立玉米高效遗传转化体系奠定了基础。Ishida 等(1996)建立了一套农杆菌介导的高效转化体系，通过对菌株、菌液浓度、幼胚等各种因素的优化，使玉米的转化效率达到了30 %，成为玉米遗传转化进程中的一个里程碑。随后，Lupotto

23、等和黄璐等也相继成功地实现了农杆菌介导的玉米遗传转化。Huang 等成功通过调控农杆菌转化载体的左右两个边界转化再生出不含标记基因的玉米，解决了转基因玉米在食品安全方面的顾虑。关淑艳等利用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因的反义表达载体导入玉米自交系中，并对农杆菌转化系统的条件进行了研究。农杆菌介导遗传转化的过程主要包括：农杆菌在植物敏感细胞上吸附；农杆菌Ti 质粒上的Vir 区被激活；T2DNA切割和T2DNA 复合物的形成；T2DNA 复合物由农杆菌进入植物细胞；T2DNA 整合到植物染色体上并进行表达。从以上步骤看，植物被成功转化的关键在于：农杆菌能否吸附到植物细胞壁上；植物能否释放诱导V

24、ir 区基因表达的信号分子；植物感受态细胞是否存在影响玉米农杆菌转化效率的因素有：细菌菌株和构建的载体质粒的类型；受体基因型；受体的类型及发育状态，不同来源的受体，其对农杆菌的敏感性也不同。2.6玉米再生及遗传转化的常用受体2.6.1愈伤组织再生系统外植体经过脱分化培养诱导出愈伤组织，再经过分化培养获得再生植株。外植体诱导的愈伤组织分两种类型：大多数玉米自交系易形成致密的型愈伤组织，这种愈伤组织胚性差，继代后较难再生出植株；型愈伤组织生长迅速，可以长期继代保持胚性，便于产生胚性悬浮细胞系，继而制备原生质体。外植体不同，愈伤组织的诱导和再生能力不同。愈伤组织再生系统还受基因型限制，获得的再生株无

25、性变异大，嵌合体多。2.6.2原生质体再生系统原生质体是最早用于玉米转基因的受体，20 世纪80 年代就开始大量用于玉米的遗传转化。Fromm等、Golovkin 等和Omirulleh 等分别以玉米的原生质体为转化受体，对玉米进行了遗传转化，并取得了成功。原生质体作为受体系统可直接进行转化，而且转化率较高，嵌合体少。但是玉米的原生质体分离较困难，培养周期长，再生频率低。所以，目前已很少采用原生质体作受体系统。2.6.3种质系统种质受体指转基因利用的受体是植物自身的生殖系统，如花粉粒、卵细胞，也称生殖细胞受体系统。目前主要从两个途径利用种质受体进行基因转化：一是利用组织培养技术进行花粉和卵细胞

26、的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织，进一步分化发育成单倍体植株，建立单倍体转基因受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程实现转基因，主要是花粉管导入法和子房注射法。丁群星等和王国英等分别用子房注射法成功地获得了转基因玉米。以子房、花粉为转化受体，无需组织培养等一系列复杂的过程，实验简单，便于操作，并且育种周期短。但是只能在授粉期进行遗传转化，受季节性影响很大，同时后代得到的群体很大，筛选转化体比较困难。2.6.4直接分化再生系统直接分化指叶片、幼茎等外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织而直接分化出不定芽获得再生植株。玉米茎尖是比较好的直接分化再生系统。李学红等用玉米茎尖离体培养直接产生了雌雄

27、花序。Zhong等用茎尖培养产生了丛生不定芽，基因枪轰击得到了转化株。Gould 等用玉米茎尖与农杆菌共培养获得了转化株和后代。Lowe 等把DNA 转移到早期合子胚的分生组织中，获得了转基因玉米茎。直接分化再生系统省去了愈伤诱导培养过程，体细胞无性变异小，获得再生株的周期短，但玉米茎尖的培养困难。2.7本实验研究内容综上所述，本实验采用诱导培养出愈伤组织，然后用农杆菌介导法侵染愈伤组织，经过筛选，恢复等步骤，最终分化培养成再生植株。3玉米成熟胚再生体系的建立3.1材料与方法3.1.1 材料本实验中所用的实验材料均是由植物科学技术学院玉米育种研究课题组提供，郑58、MQ704、昌72、H736

28、760A、178、2193共6种自交系。3.1.2实验方法3.1.2.1 外植体的选择与预培养取上述基因型种子各5个，在自来水下冲洗干净，然后在超净工作台上75%酒精浸泡2min，然后用1%NaCLO浸泡15min，灭过菌的种子用无菌蒸馏水冲洗，然后放入含4mg/l 2,4-D的无菌蒸馏水中浸泡2d 3d（因基因型不同，故种子出芽速度有差异）。3.1.2.2愈伤组织的诱导将浸软的种子放置在超净工作台上，剥离出成熟胚，去除胚根（如图1所示），所得胚芽纵向切为两半后，再横切段，切口紧贴诱导培养基上在26黑暗中培养3周，得到初级愈伤组织，计算愈伤组织诱导频率。图1 玉米种子的外形的结构3.1.2.3

29、 胚性愈伤组织的形成及愈伤组织的继代将初级愈伤组织转移至继代培养基上， 26黑暗中继续培养，每2周继代一次，诱导胚性愈伤组织形成。3.1.2.4胚性愈伤组织的分化将胚性愈伤组织转移到分化培养基上，在26、16 h的光周期条件下进行分化培养。3.1.2.5培养基配制（详见附录）表1 培养基成分培养基成分诱导培养基N6盐+B5有机+2mg/L甘氨酸+690 mg/L L-pro +1 g/L CH +0 5mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂， pH 5.8继代培养基N6盐+B5有机+2 mg/L甘氨酸+690mg/L L-pro +1 g/LCH +1 3mg /L 2, 4-

30、D+0 0.4 mg/L 6-BA+0 20 mg/LAgNO3(过滤灭菌)+ 30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂， pH 5.8分化培养基N6盐+B5有机+2 mg/L甘氨酸+1 g/L CH +0 1.0 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂， pH 5.8生根培养基1 /2 MS盐+B5有机+2 mg/L甘氨酸+1.0 mg/L IBA+20 g/L蔗糖+7 g/L琼脂， pH 5.83.2结果与分析3.2.1玉米种子的预培养用含有4mg/L2,4-D的无菌蒸馏水浸泡玉米种子，为避免种子因无氧呼吸而死，故无菌蒸馏水不能没过种子，最好为种子的2/3处为宜。然后为避免染菌，要在

31、培养皿盖与底的中间部分封一层保鲜膜，从而大大减少了预培养的染菌率。（如图2）图2用含有4mg/l 2，4-D的无菌蒸馏水浸泡玉米种子3.2.2愈伤组织的诱导将胚芽切为四段接种于诱导培养基中，将切面紧贴培养基，3d 6d后盾片开始膨大，10d后出现1mm 2mm大小的愈伤组织。诱导培养3周后，形成颜色淡黄、结构粘软的初级愈伤组织。（如图所示）图3 诱导愈伤6d后图4 诱导愈伤10d后图5诱导愈伤组织3周后2,4-D是影响愈伤组织产生的关键因素。在没有添加2,4-D的诱导培养基上，成熟胚在开始培养后的2d 3d内容易萌发胚芽和胚根，不能诱导愈伤组织的产生。从实验中可以知道，在添加有低浓度的2,4-

32、D诱导培养基上，愈伤组织诱导频率较低；在一定浓度范围内，随着2,4-D浓度的增加，愈伤组织诱导频率相应增加。供试的2193在含有4.0mg/L 2,4-D的诱导培养基上产生了最高的愈伤组织诱导频率(30 40%); 5.0mg/L 2,4-D有再显著提高愈伤组织的诱导频率，也没有改善愈伤组织的质量。考虑到高浓度的2,4-D容易导致体细胞无性系变异，因而4.0mg/L 2,4-D被认为是合适浓度。3.2.3 胚性愈伤组织的形成将初级愈伤组织转移到含有不同浓度的2,4-D和6-BA的继代培养基上，经过2次继代培养后，愈伤组织可以分为两类：一类是粘软的、水渍状的、褐色的非胚性愈伤组织;另一类是致密的、松脆的、形状不规则的、淡黄色或乳白色的胚性愈伤组织。在继代培养基中添加2,4