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1、平面色谱法山西医科大学实用标准 文档大全 第十九章 平面色谱法 平面色谱法（plane chromatography ）是组分在以平面为载体的固定相和流动相之间吸附或分配平衡而进行的一种色谱方法。该法具有操作简单，不需要昂贵的仪器设备，分析速度快，结果直观，并有较高的分离能力。平面色谱法主要包括薄层色谱法（thin layer chromatography；TLC ）和纸色谱法（paper chromatograph ）。纸色谱法出现于20世纪的40年代，主要用于微量分析，特别在生化和医药分析中的应用十分广泛。但色谱纸的机械强度较差，传质阻力大，使该法的应用和推广受到了限制。20世纪60年代，

2、薄层色谱法的发展和普及，使得纸色谱法的应用逐渐减少。20世纪80年代出现了仪 器化薄层色谱法（instrumental thin layer chromatography ），薄层色谱的每一步骤均由仪器来代替以往的手工操作，再配以薄层扫描仪，这样就使在较长时期内被认为只能用来定性和半定量的薄层色谱法定量结果的重现性和准确度大大提高，成为一种有价值的分离分析方法。 第一节 平面色谱法的分类和原理 一、 平面色谱法的分类 平面色谱法按操作方式可分为： 1薄层色谱法 薄层色谱法是把固定相均匀地涂布在玻璃板、塑料板或铝箔上形成厚薄均匀的薄层，在此薄层上进行混合组分分离的色谱法。按照薄层色谱法的分离机制

3、不同，薄层色谱法又可分为吸附薄层色谱法、分配薄层色谱法和分子排阻薄层色谱法。 2纸色谱法 纸色谱法的固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为与水互不相溶的有机溶剂，根据被分离混合组分在水和有机溶剂中的溶解能力不同，在色谱纸上产生差速迁移而得到分离的方法。纸色谱分离原理属于分配色谱的范畴。 实用标准 文档大全 3薄层电泳法 薄层电泳法是带电荷的被分离物质（蛋白质、核苷酸、多肽、糖类等）在纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等惰性支持体上，以不同速度向其电荷相反的电极方向泳动，产生差速迁移而得到分离的方法。薄层电泳法属于平面色谱范围，但由于电泳与色谱的驱动力、仪器设备及测定对象与薄层色谱法及

4、纸色谱法有较大差别，故本章不予介绍。 二、 平面色谱法参数 平面色谱与柱色谱的基本原理相同，但操作方法不同，故各种参数也不完全相同。以下主要介绍平面色谱法的定性参数、相平衡参数、面效参数和分离参数。 （一）定性参数 薄层色谱的定性参数是色谱过程热力学特性参数，包括比移值与相对比移值。 1 比移值（retardation factor；Rf） 比移值是在一定条件下，溶质移动距离与流动相移动距离之比。是平面色谱法中用来表征平面色谱图上斑点位置的基本参数，也是平面色谱法用于定性的基本参数 。 0fLLR? （ 19-1） 式中L为原点（origin）至斑点中心 的距离，L 0为原点至溶剂前沿（sol

5、vent front）的距离（见图19-1）。当Rf =0时，组分不随流动相展开，停留在原点，表示组分在固定相上完全保留；当Rf =1时，组分随流动相展开至溶剂前沿，表示组分在固定相上完全不保留。所以Rf值在01之间。在实际工作中，Rf值适宜范围是0.20.8，最佳范围是0.30.5。 图19-1 平面色谱示意图 由于Rf受被分离组分的结构和性质，固定相和流动相的种类和性实用标准 文档大全 质，展开室内的饱和度、温度等多因素的影响。在不同实验室或不同实验者间进行同一化合物Rf值的比较是很困难的。 2 相对比移值（relative retardation factor；Rr） 相对比移值是在一定

6、条件下，被测组分的 比 移值与参考物质比移值之比。 (s)(i)(s) f(i) frLLRRR? （19-2） 式中Rf (i)和Rf (s)分别为组分i和参考物质s在相同条件下的比移值。L(i)和L(s) 分别为组分i和参考物质s在平面色谱上的移动距离。 相对比移值在一定程度上消除了测定中的系统误差，因此与比移值相比具有较高的重现性和可比性。测定Rr时，可以选择纯物质加到试样中作为参考物质，也可以是试样中的某一已知组分。Rr可以大于1，也可以小于1。Rr与被测组分、参考物质、色谱条件等因素有关。 （二） 相平衡参数 1分配系数（ distribution coefficient；K）和保留

7、因子（retention factor；k） 平面色谱法中的相平衡参数也可用分配系数和保留因子来描述（见第十六章 色谱法概论）。 2K、k与Rf值之间的关系 设R为单位时间内一个分子在流动相中出现的几率（即在流动相中停留的时间分数），若R=1/3，则表示这个分子有1/3的时间在流动相中，2/3的时间在固定相中。对于具有统计意义的大量待测组分分子而言，则表示1/3的分子在流动相中， 2/3的分子在固定相中。组分在固定相与流动相中的量可分别用csVs和cmVm表示，cs为组分在固定相中的浓度，cm为组分在流动相中的浓度，Vs为色谱平面中固定相所占的体积，Vm为平面中流动相所占的 体 积 。因此，

8、msmmss1VVKVcVcRR? ? 整理上式，得 kR?11 R也可表示组分分子在平面上移动的速度，若R=1/3，则表示组分分子的速度(u)为流动相分子速度(u0)的1/3(u/u0)，即该组分分子移实用标准 文档大全 行的距离是溶剂前沿移行距离的1/3。由此可得 ，tuutLLR00f?，在平面色谱中，组分分子与流动相分子的移行时间是相同的（定时展开），所以fRR?，即 kR?11f （19-3） 或 ff1RRk? （19-4） msf11V/KVR? （19-5） 由（19-5）可知： （1）由于组分不同，热力学常数K值不同，在平面色谱上的Rf不同，所以平面色谱可以把不同的组分分离出

9、不同的斑点。 （2）当K（k）100时，fR0，此时L=0，表示组分停留在原点，完全被固定相所保留。因此平面色谱一般要求：0.01K100。 （3）由（19-5）得 )R(VVK11fsm? （19-6） 由上式可知，只要测出某组分在液-液分配薄层色谱体系的fR，并已知流动相和固定相体积比Vm/Vs，即可测出该体系的分配系数K。 （三）面效参数 1理论塔板数（number of theoretical plate；n ） 理论塔板数是反映组分在固定相和流动相中动力学特性的色谱参数，是色谱分离效能的重要指标。以下式表示： 2)(16WLn? （19-7） 式中L为原点到斑点中心的距离，W为组分斑

10、点的宽度，因此在斑点移动距离相等的情况下，斑点越集中，W越小，n越大，说明面效越高。在平面色谱法中的理论塔板数主要取决于平面色谱系统的物理特性，如固定相的粒度、均匀度、活度、色谱纸的厚薄及其均匀度，展开剂的流速及展开方式等。 实用标准 文档大全 2塔板高度（height of theoretical plate；H ） 塔板高度是由理论塔板数及原点到展开剂前沿的距离(L0)算出的单位理论塔板的长度。即： nLH0? （19-8） 由此可见，H与n成反比，n值越大，H值越小，面效就越高。 （四）分离参数 1分离度（resolution；R ） 分离度是两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度的比值，是

11、平面色谱法的重要分离参数。 即： )(2)()(2212112WWdWWLLR? （19-9） 式中L2、L1分别为原点至两斑点中心的距离，d为两斑点中心间的距离，W1、W2为两斑点的宽度；在薄层扫描图上，d为两色谱峰顶间距离，W1、W2分别为两色谱峰宽（见图19-2）。在平面色谱法中，R1较适宜。 图19-2 平面色谱分离度示意 图 2分离数（separation number；SN） 分离数是在相邻两斑点分离度为1.177时，在Rf=0和Rf=1两 组 分 斑点之间所能容纳的色谱斑点数。即： 1)()(1210210?WWLSN （19-10） 式中(W1/2)0和(W1/2)1分别为由薄

12、层扫描所得的Rf=0和Rf=1的组分的半峰宽。实际上，(W1/2)0和(W1/2)1均不能直接由薄层扫描图上测得。而是通过测量其他组分的Rf值和半峰宽，二者在一定点样量范围内成直线关系，由回归方程外推求得(W1/2)0和(W1/2)1。分离数也是平面色谱法的重要分离参数和面效的评价参数。在一定分离度下，分离数SN越大，平面的容量越大。一般薄层板的SN在10左右，高效薄层板可达20。 第二节 薄层色谱法 实用标准 文档大全 薄层色谱法是平面色谱法中应用最广泛的方法之一。将细粉状的吸附剂或载体（固定相）涂布于玻璃板、塑料板或铝箔上，成一均匀薄层并进行活化，将试样与对照品溶液点在同一薄板的一端（原点

13、），在密闭的容器中用适当的溶剂（流动相或展开剂）展开，显色后样品斑点与对照品斑点进行比较，用于定性鉴别和含量测定。铺好薄层的板，称为薄板或薄层板（thin layer plate ）。薄层色谱法具有以下特点：分离能力强，斑点集中。灵敏度高，几微克，甚至几十纳克的物质也能检出。展开时间短，一般只需十至几十分钟。一次可以同时展开多个试样。试样预处理简单，对被分离组分性质没有限制。上样量较大。所用仪器简单，操作方便。因此在实际工作中特别是基层实验室薄层色谱法是一种被广泛应用的分离分析技术。 一、 薄层色谱法的主要类型 根据薄层色谱法的分离机制，可分为吸附薄层色谱法、分配薄层色谱法和分子排阻薄层色谱法

14、，此外，还有胶束薄层色谱法等。根据分离效能，薄层色谱法又可分为经典薄层色谱法和高效薄层色谱法。本节主要讨论吸附薄层色谱法。 （一）吸附薄层色谱法 吸附薄层色谱法是以吸附剂为固定相的薄层色谱法。在吸附薄层色谱中，将含有A、B两组分的混合溶液点在薄层板的一端，在密闭的容器中，用适当的溶剂展开。在展开过程中A、B两组分首先被吸附剂吸附，然后被展开剂溶解而解吸附，并随展开剂向前移动，遇到新的吸附剂A、B两组分又被吸附、随后又被展开剂解吸附。由于A、B两组分在吸附剂和展开剂中的吸附系数不同，在薄层板上进行无数次的吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，吸附系数大的在板上移动速度慢，Rf值小；吸附系数小的在板上的

15、移动速度快，Rf值大，在薄层板上产生差速迁移而得到分离。在吸附色谱中，一般极性大的组分Rf值小，极性小的组分Rf值大。 实用标准 文档大全 （二）分配薄层色谱法 分配薄层色谱法是以液体为固定相的薄层色谱法。利用试样中各组分在固定相与流动相之间的分配系数不同，在薄层板上进行无数次的分配，分配系数大的组分在板上移动速度慢，Rf值小；分配系数小的组分在板上的移动速度快，Rf值大，在薄层板上产生差速迁移而得到分离。根据固定相和流动相极性的相对强弱，分配薄层色谱法可分为正相薄层色谱法和反相薄层色谱法。 1. 正相薄层色谱法 正相薄层色谱法是流动相的极性小于固定相极性的薄层色谱法。正相薄层色谱中组分极性越

16、大，分配系数越大，随展开剂移动的速度越慢，Rf值越小。正相薄层色谱法常用的固定相是含水硅胶，展开剂是极性较弱的有机溶剂。 2. 反相薄层色谱法 反相薄层色谱法是流动相的极性大于固定相极性的薄层色谱法。反相色谱中组分极性越小，分配系数越大，随流动相移动的速度越慢，Rf值越小。反相薄层色谱法常用的固定相是烷基化学键合相，展开剂是水或水-有机溶剂的混合溶剂。 二、 吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂 (一)吸附剂 吸附薄层色谱法的固定相为吸附剂（absorbent ），常用吸附剂有硅胶、氧化铝和聚酰胺等。 1硅胶 硅胶是吸附薄层色谱中最常用的固定相。硅胶是多孔性无定形粉末，其表面带有硅醇基（silanol

17、 ）呈弱酸性，通过硅醇基吸附中心与极性基团形成氢键而表现其吸附性能，由于不同组分的极性基团与硅醇基形成氢键的能力不同，在硅胶作为吸附剂的薄板上被分离。硅胶吸附水分形成水合硅醇基而失去吸附能力，但将硅胶在105110左右加热时，可失去水而提高活度，增加吸附能力，这一过程称为“活化”（activation ）。硅胶的活度与含水量的关系见表19-1。含水量越多，级数越高，吸附能力越弱，同一组分在此硅胶上的Rf值越大；含水量越少，级数越低，吸附能力越强，同一组分在此硅胶上的Rf实用标准 文档大全 值越小。 硅胶的分离效率的高低与其粒度、孔径及表面积等几何结构有关。硅胶粒度越小，粒度越均匀，粒度分布越窄

18、，其分离效率越高。经典薄层色谱用硅胶的粒度为10 40m。比表面积大，意味着试样与固定相之间有更强的相互作用，即有较大的吸附力或较强的保留。商品硅胶比表面积一般为400 600m2/g，孔体积约为0.4ml/g，平均孔径约为100nm。 硅胶表面的pH5，一般适合酸性和中性物质的分离，如有机酸、酚类、醛类等。碱性物质与硅胶发生酸碱反应，展开时严重被吸附、斑点拖尾、甚至于停留在原点不随流动相展开。 薄层色谱常用硅胶有硅胶H、硅胶G、硅胶GF254等。硅胶H为不含粘合剂的硅胶，铺成硬板时需另加粘合剂。硅胶G是硅胶和煅石膏混合而成。硅胶GF254含煅石膏，另含有一种无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌（Zn

19、2SiO4:Mn），在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。此外，还有硅胶 HF254、硅胶HF254+366等。 2氧化铝 氧化铝是由氢氧化铝在400500灼烧而成。氧化铝可分为中性（pH7.5），碱性（pH9.0）和酸性（pH4.0）三种。一般碱性氧化铝用来分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等，中性氧化铝适用于酸性及对碱不稳定的化合物的分离，酸性氧化铝可用于酸性化合物的分离。氧化铝的活性与含水量有关（见表19-1）。含水量越高，活性越弱。 表19-1 硅胶、氧化铝的活度与含水量的关系 硅胶含水量% 氧化铝含水量% 活性级 活性 活化 0 0 高 一般活化 硅胶：110/30mi

20、n，氧化铝：110/45min 强活化 硅胶：150/4h， 氧化铝：180/4h 5 3 15 6 25 10 38 15 低 3. 聚酰胺 聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子化合物，常用的实用标准 文档大全 是聚己内酰胺。聚己内酰胺为白色多孔的非晶型粉末，不溶于水和一般有机溶剂，易溶于浓矿酸、酚及甲酸。聚酰胺分子内的酰胺基可与化合物质子给体形成氢键而对该类化合物产生吸附。聚酰胺可用于酚、酸、硝基、醌类等化合物的分离。 (二)展开剂 薄层色谱法的流动相又称展开剂（developing solvent，developer ）。展开剂选择是薄层分离结果优劣的重要条件之一。在吸附薄层色谱法中，选择展开

21、剂的一般原则和吸附柱色谱中选择流动相的原则相似，主要是根据被分离物质的极性、吸附剂的活度和展开剂的极性三者的相对关系进行选择，通过组分分子与展开剂分子争夺吸附剂表面活性中心而达到分离。Stahl设计了选择吸附薄层色谱条件的三者关系示意图（见图19-3），由图可见，将图中的三角形A角指向极性物质，则B角就指向活性小的吸附剂，C角就指向极性展开剂，如此类推。 图19-3 化合物的极性、吸附剂活度和展开剂极性间的关系 薄层色谱法中常用的溶剂按极性由强到弱的顺序是： 水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳环己烷石油醚。 在薄层色谱中，通常根据被分离组分的极性，首先用单

22、一溶剂展开，由分离效果进一步考虑改变展开剂的极性或选择混合展开剂。例如，某物质用氯仿展开时，Rf值太小，甚至停留在原点，可选择另一种极性更强的展开剂或加入一定比例的极性溶剂，如乙醇、丙酮等。如果Rf值较大，斑点在前沿附近，应选择另一种极性更弱的展开剂或加入一定比例极性小的溶剂，如环己烷、石油醚等。为了寻找合适的展开剂，往往需要多次实验，有时需要两种以上溶剂的混合展开剂，甚至要加入一些酸或碱。常用的薄层色谱混合展开剂见表19-2。 表19-2 常用薄层色谱混合展开剂 实用标准 文档大全 样 品 配方举例 亲水性样品 正丁醇+乙酸+水(4+1+5) 异丙醇+氨水+水(9+1+2) 苯酚+水(4+5

23、) （1）混合振摇（2）样品中强度亲水性样品 三氯甲烷+甲酰胺 三氯甲烷+甲醇 乙酸乙酯+甲醇 三、 薄层色谱操作方法 薄层色谱法一般操作程序可分制板、点样、展开和斑点定位。 （一）薄层板的制备 薄层板可分为加粘合剂的硬板和不加粘合剂的软板两种。软板制备简便，但表面松散，很易吹散、脱落，现己不常用。下面介绍硬板的制备方法。 （1）薄层板的选择 薄层板应选择表面光滑、平整、洁净，厚度一致的玻璃板、塑料板或铝箔。薄层板大小可根据实验需要选择，如：载玻片，20cm20cm 玻片等。 （2）薄层板的涂布 将固定相、粘合剂和水按一定比例混合，研磨至均匀且无气泡，即得到固定相匀浆。将固定相匀浆涂铺在准备好

24、的薄层板上，使整板涂布均匀，一般厚度以250m为宜。薄层厚度及均匀性直接影响试样分离效果和Rf值的重复性。 （3）薄层板的活化 涂铺的薄层板自然晾干后，在105110活化0.51h，取出，冷却至室温，存放在干燥器中。用聚酰胺吸附剂铺成的薄层板则需要保存在有一定湿度的空气中。 常用的粘合剂有羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和煅石膏（CaSO4? 1/2H2O）。用CMC-Na为粘合剂制成的薄层板称为硅胶-CMC 板。这种板机械强度好，但在使用强腐蚀性显色试剂时，要掌握好显色温度和时间，以免CMC-Na炭化而影响检测。用煅石膏为粘合剂制成的薄层板称为硅胶-G板。这种板机械强度较差，易脱落。 在分离酸

25、性或碱性化合物时，可制备酸性或碱性薄层来改善分离效果。如在硅胶中加入碱或碱性缓冲液制成碱性薄层，可分离生物碱实用标准 文档大全 等碱性化合物。 除手工制板外，还可以用自动机械铺板器制板。用铺板器制板速度快，薄层厚度均匀，重现性好，定量分析结果可靠。此外，还有商品薄板可供选择。 （二）点样 点样 (spotting)是薄层色谱分离的重要步骤。选择适当溶剂，将试样配制成浓度为0.01%0.1%的溶液。溶剂一般选用乙醇、甲醇等易挥发性有机溶剂，避免使用水，因为水溶液斑点易扩散，且不易挥发除去。点样工具一般采用点样毛细管或微量注射器。点样原点直径以24mm为宜，采用分量多次点样，每次点样需自然干燥或用

26、电吹风干燥后，才能二次点样，以免斑点扩散。点样量一般以几微升为宜，若进行薄层定量或薄层制备时，可多至几百微升。点样形状可以是点状，也可以是带状。自动点样仪可进行程序控制点样。 在进行薄层定量时，原点直径的一致，点样间距的精确，是保证定量精确度的关键。 （三）展开 展开（development ）过程使用的器皿一般为长方形密闭玻璃缸，称为层析缸或色谱缸。将薄层板直立于盛有展开剂的色谱缸中，展开剂浸没薄板下端的高度不超过0.5cm，原点不得浸入展开剂中。展开剂借助毛细管作用向上展开，待展开剂前沿达一定距离（如1020cm）时，将薄层板取出，标记溶剂前沿。 在展开之前，薄层板置于盛有展开剂的色谱缸内

27、饱和1530分钟，此时薄板不与展开剂直接接触。待色谱缸内展开剂蒸气、薄层、缸内大气达到动态平衡时，体系达到饱和，再将薄层板浸入展开剂中。预饱和可以避免边缘效应。边缘效应是同一组分在同一板上处于边缘斑点的Rf比处于中心的Rf值大的现象。产生边缘效应的原因是由于展开剂的蒸发速度从薄层中央到两边缘逐渐增加，即处于边缘的溶剂挥发速度较快。在相同条件下，致使同一组分在边缘的迁移距离大于在中心的迁移距离。 薄层展开常用上行法，另外还有下行法（展开剂从上向下展开）、实用标准 文档大全 径向展开（展开剂由原点径向展开）、多次展开 （同一展开剂，重复多次展开）、双向展开（展开一次后，转90o用另一展开剂展开）。

28、选用自动多次展开仪，可进行程序多次展开。 （四）斑点的确定 为了对薄层分离的组分进行定性、定量分析，必须对从层析缸中取出的薄层板上的斑点进行定位。斑点位置确定的方法有： （1）在日光下观察，画出有色物质的斑点位置。 （2）在紫外灯（254nm或365nm）下观察有无暗斑或荧光斑点，并记录其颜色、位置及强弱。能发荧光的物质或少数有紫外吸收的物质可用此法检出。 （3）在254nm紫外灯下，掺入了少量荧光物质的薄层板呈黄绿色荧光，被测组分在荧光薄层板上淬灭荧光而产生暗斑进行检出。 （4）利用显色剂显色斑点。薄层色谱常用的通用型显色剂有碘、硫酸溶液和荧光黄溶液等。碘蒸气对许多有机化合物都可显色，如生物

29、碱、氨基酸衍生物、肽类、脂类、皂甙类等。该显色反应是可逆的，在空气随着碘的升华挥发，组分斑点可回复到原来状态。10%硫酸乙醇溶液使大多数有机化合物产生有色斑点，如红色、棕色、紫色等，甚至于出现荧光。0.05%荧光黄甲醇溶液是芳香族与杂环化合物的通用显色剂。 四、 定性和定量分析 (一)定性分析 1.比移值Rf定性 在一定色谱条件下，某一组分的Rf值是一定值，可用于定性分析。但是绝对比移值Rf影响因素很多，如吸附剂的种类和活度、展开剂的种类和极性、薄层厚度、展开距离、色谱容器内溶剂蒸气的饱和程度、温度等，因此与文献收载的Rf值比较进行组分定性困难较大。常用的方法是将试样与对照品在同一块薄层板上展

30、开，根据试样和对照品的Rf值及其斑点颜色比较进行定性。必要时可经过多种展开系统，样品的Rf值及其斑点颜色与对照品比较，进一步实用标准 文档大全 认定该组分与对照品是同一化合物。 2.相对比移值Rr定性 组分的Rr值定性比Rf值可靠的多。可采用与文献收载的Rr值比较进行定性，也可与对照品的Rr值比较进行定性。 此外利用斑点与显色剂反应生成的有色斑点也可初步推断化合物的类型。 (二)杂质检查 薄层色谱可用于药品中有关物质的检查和杂质限量的检查。 1.杂质对照品比较法 配制一定浓度的试样溶液和规定限定浓度的杂质对照品溶液，在同一薄层板上展开，试样中杂质斑点颜色不得比杂质对照品斑点颜色深。 2. 主成

31、分自身对照法 首先配制一定浓度的供试品溶液，然后将其稀释一定倍数得到另一低浓度溶液，作为对照溶液。将试样溶液和对照溶液在同一薄层板上展开，试样溶液中杂质斑点颜色不得比对照溶液主斑点颜色深。 例19-1 硫酸长春碱的杂质检查（中国药典2005年版）。 取硫酸长春碱用甲醇制成10mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用甲醇稀释成0.20mg/ml的溶液，作为对照溶液。吸取上述两种溶液各5l，分别在同一GF254薄层板上点样，用石油醚(沸程3060)氯仿丙酮二乙胺(12:6:1:1) 为展开剂，展开，晾干。在254nm紫外灯下检测。供试品溶液如显杂质斑点，不得超过2个，其颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。 (三)定