HPLC法测定VC葡萄糖注射液中VC含量.docx

1、HPLC法测定VC葡萄糖注射液中VC含量*毕业设计（论文）HPLC法测定VC葡萄糖注射液中VC含量学 生 姓 名 * 指 导 教 师 * 专 业 * 学 院 * 2010年05月 24日Graduation Project (Thesis)*Study on the Production of High Maltose Syrup by EnzymeStudent * Supervisor * Specialty * School Pharmacy 2010-05- 24毕业设计（论文）审阅评语一、指导教师评语：指导教师签字：年 月 日毕业设计（论文）审阅评语二、评阅人评语：评阅人签字：年 月

2、 日毕业设计（论文）答辩评语三、答辩委员会评语：四、毕业设计（论文）成绩：专业答辩组负责人签字： 年 月 日五、答辩委员会主任单位： （签章） 答辩委员会主任职称： 答辩委员会主任签字： 年 月 日摘要 建立了一种VC注射液中VC 的反相高效液相色谱(HPLC)测定法。高效液相色谱系统采用Shim-pack VP-ODS C-18柱，甲醇/磷酸二氢钾缓冲液=75/25 (V/V)作流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为266nm。VC在浓度0.0500.300mg/ml内有良好的线性关系，线性回归方程为y=48455716.963x-7726.010 (R=0.9999)。分析方法中回收

3、率平均为99.23%，标准偏差s=0.0018，变异系数CV=1.90%。VC的最低检测限为2.5010-7mg。关键词:高效液相色谱;维生素C;含量测定AbstractA method of detecting the content of VC in Vitamin c glucose injection by using HPLC was established. In the HPLC system， a Shim-packVP-ODS C-18 column was used， and the mobile phase was a mixture of methanol and po

4、tassium dihydrogen phosphate buffer liquid (75/75). The flow rate was 1. 0 ml/min ， and the detection wavelength 266 nm. The standard working curve of VC had a goodlinear relation in the concentration range from 0.050 to 0.300mg/ml. The linear equation was y = 48455716. 963x 7726. 010，and the relate

5、d coefficient (R) was 0. 9999. When adopting the analyzing method， the recovery of the assay was 99. 23% on anaverage， the standard deviation (s) was 0. 0018， the CV was 1. 90%， and the lower determinable limit was 250 x 10-7mgKey Words： high performance liquid chromatography (HPLC); vitamin C; dete

6、ction目 录摘要 IAbstract II1 绪 论 41.1 维生素C的功能和应用 41.1.1 维生素C的性质 41.1.2 维生素C的来源 41.1.3 维生素C吸收和转化 41.1.4 维生素C生理功能 51.1.5 人体需要的维生素C量 61.1.6 维生素C的药理作用基础与临床应用的新进展 61.1.7 维生素C临床应用新进展 71.2 维生素C测定的原理与特点 91.2.1 还原型抗坏血酸的测定 91.2.2 维生素C总量的测定 101.3 高效液相色谱 111.3.1 高效液相色谱法 111.3.2 高效液相色谱法的特点 111.3.3 高效液相色谱结构组成 111.3.4

7、 使用方法 121.3.5 测定方法 131.3.6 高效液相色谱法的优点 151.4 本课题的来源及研究的意义 151.4.1 本课题来源 151.4.2 研究的目的意义 152 实验部分 162.1 实验仪器与色谱条件 162.1.1 实验仪器 162.2 实验材料 162.3 VC葡萄糖注射液中VC含量测定 172.3.1 标准溶液的配制 172.3.2 最大吸收波长的确定 172.3.3 线性关系考察 172.3.4 供试样品的制备 172.3.5 方法学考察 182.3.6 VC葡萄糖注射液中VC含量测定 18结 论 21致谢 26附录 271 绪 论1.1 维生素C的功能和应用1.

8、1.1 维生素C的性质维生素C是一种含有6个碳原子的酸性多羟基化合物，其分子C-2及C-3位上两个相邻的烯醇式的经基极易解离而释出H+，所以维生素C虽无自由梭基，但仍具有有机酸的性质;又因它具有防治坏血病的功能，故又称为抗坏血酸。由于它的烯二醇式结构，C-2及C-3位上轻基的氢，即可以H十游离，又可以H+释放。所以维生素C不但是相当强的有机酸，而且还是很强的还原剂，可以使许多物质还原。维生素C脱去2个H后成为氧化型维生素C(脱氢抗坏血酸)，当有供氢体存在时，氧化型维生素C又可变为还原型维生素C(抗坏血酸)，所以脱氢抗坏血酸仍有维生素C的生理活性。维生素C是无色无臭的片状结晶体，有酸味，易溶于水

9、，不溶于脂溶剂，是水溶性维生素。维生素C具有很强的还原性，故极不稳定，容易为热、光、氧所氧化破坏，在中性或碱性溶液中尤甚。微量重金属离子存在(如Fe，十、Cu2+等)或荧光物质(如核黄素)更能促进维生素C氧化分解。日常烹饪过程中，蔬菜的水洗、切块、加热过程中会丢失维生素C含量的550%。因使用铁或铜器炊具更加速其老化，丢失速度与加热温度和时间成正比相关。如西红柿去皮，切块、油炒3-4分钟维生素C丢失6%;白菜切块，油炒12-18分钟，维生素C可丢失43%。1.1.2 维生素C的来源维生素C存在于新鲜蔬菜、水果中，番茄、辣椒、柑桔、鲜枣中含量较多。我国野生植物沙棘、称猴桃、酸枣中含维生素C最为丰

10、富，中草药如山植、醋柳果、苍耳子等含有很多维生素C。松针含维生素C极为丰富，新鲜松针汁是最早用来防治坏血病的重要药物，植物组织中含有抗坏血酸氧化酶，能将维生素C氧化成无活性的二酮古洛糖酸，故新鲜食物贮存过久，维生素C便遭破坏。1.1.3 维生素C吸收和转化研究证明，大鼠体内能利用葡萄糖来合成维生素C，但在人、其它灵长类和豚鼠体内由于缺乏合成维生素C的酶类，故不能合成抗坏血酸，因此人对维生素C的全部需要量都由食物供给。食物中的维生素C可迅速被胃肠道吸收，但在某些特殊情况，如腹泻、肠手术、养料吸收障碍、胃肠炎、消化道溃疡等情况下则可使吸收减少。吸收后的维生素C广泛分布于机体，其在各部的浓度大致与组

11、织代谢活动相平行，没有明显的贮存。正常情况下，维生素C绝大部分在体内经代谢分解，最终产物主要为CO:和草酸，后者随尿排出。维生素C也可以直接以还原型及脱H型由尿排出。当机体维生素C己达到饱和，再补充维生素C则大部分随尿排出;而机体未达到饱和，摄入的维生素C并不被肾排出或排出极少。此外，当长期大量服用维生素C，血浆浓度特别高时，还有可能发生草酸盐尿以及尿道有可能出现草酸盐结石。1.1.4 维生素C生理功能 维生素C有多种生理功能，如保持含巯基的物质的还原型，参与造血、促进胶原蛋白的合成，解毒作用，参与体内儿茶酚胺生成，帮助胆固醇转化为皮质激素的作用等等。这里着重介绍以下几种功用。保持巯基。许多酶

12、分子的巯基(-SH)是维持其活性的必需基团，而维生素C能使酶分子中的-SH维持在还原状态，使酶分子保持一定的活性。此外在谷氨酰胺还原酶作用下，维生素C可使氧化型谷氨酰胺(GSSG)还原为还原型谷氨酰胺(G-SH)，而保证G-SH在体内的重要作用。当致毒剂量的铅化物、砷化物、苯以及细菌毒素等进入体内时，给与大剂量的维生素C，可缓解其毒性。据研究发现，重金属离子能与体内羟醛酶类的-SH结合，使其失活，以致代谢发生障碍而中毒。如前所述，维生素C可使GSSG还原为G-SH，后者可与重金属离子(MZ+)结合排出体外，故维生素C能保护含巯基的酶的-SH，具有解毒作用.帮助人体造血。铁是人体红细胞内血红蛋白

13、的主要成分，有二价铁和三价铁二种形式.二价铁形成的血红蛋白可运输氧气，三价铁形成的高铁血红蛋白无运输氧气的能力。正常人红细胞内有NADH-高铁血红蛋白还原酶系统，使高铁血红蛋白还原为血红蛋白。先天性高铁血红蛋白过多的病人红细胞中缺乏NADH-高铁血红蛋白还原酶，高铁血红蛋白的浓度会升高，可占血红蛋白总量的4050%(正常为0.4环)。如果这种先天性病人每日口服500mg维生素C，其高铁血红蛋白可下降至6%左右。此外，维生素C能使肠道难以吸收的三价铁还原成易于吸收的二价铁，增加人体对铁的摄取。叶酸也是参与造血的维生素，维生素C能使叶酸转化为有生理活性的四氢叶酸后，叶酸才能发挥作用。故治疗营养不良

14、性贫血应补充二价铁盐，治疗巨幼红细胞贫血时应补充叶酸，但二者同时应当注意补充维生素C，以促进发挥它们的作用.促进胶原蛋白的合成.维生素C最重要的生理生化功用是促进胶原蛋白的合成，胶原蛋白含有较多的轻脯氨酸和经赖氨酸，它们分别由蛋白质中的脯氨酸和赖氨酸经化合成。维生素C可激活轻化酶，从而激化胶原蛋白的生成。胶原蛋白是细胞间的粘合剂，维生素C缺乏时，胶原蛋白等细胞间质的合成发生障碍，会发生创面，溃疡不易愈合;骨骼、牙齿等易于折断或脱落.毛细血管脆性、通透性增大，引起皮下、牙眼、粘膜出血等坏血病症状.豚鼠用缺乏维生素C的食物喂养14天后，四肢皮下有血点，不能行走.正常食物喂养的豚鼠皮肤切开的伤口在九

15、天后自然愈合，患坏血病的豚鼠伤口在九天后仍不愈合.鱼喂以无维生素C食物一个月后，脊柱折裂、游动呈S形，皮下有出血斑，缺乏维生素C的坏血病人齿眼和口鼻腔易出血，而且在其皮下会出现出血点及癣血斑。并有皮肤伤口不愈合现象.1.1.5 人体需要的维生素C量中国营养学会在1988年制定的每日膳食中维生素C的供给t需要量(RDA)为:儿童3050mg/d，成人60mg/d，孕妇80mg/d，乳母100mg/d，维生素C有增强运动能力的作用，所以运动员需要量较大，一般运动员每日需维生素在高温、寒冷、缺氧条件下劳动或生活;工作中常接触铅、汞等有害物质;许多疾病患者，吸烟者每日供给量应酌情增加，因为维生素C还有

16、许多保健作用。C130-140mg比赛时需150200mg。1.1.6 维生素C的药理作用基础与临床应用的新进展 维生素C是治疗贫血重要的辅助药物。能促进铁的吸收，能将血浆运铁蛋白中的Fe还原成Fe2+，然后渗入铁蛋白，再以铁蛋白Fe3+的形式贮存，储存铁动员时，需要VC才能完成。而且VC能使亚铁络合酚等巯基处于活性状态以便有效地发挥作用。叶酸要体内还原为四氢胺酸进，也常要VC参与，故VC缺乏时也会发生巨幼细胞贫血。 还原性质与解毒，VC能使体内氧化型的谷氨酰胺(GSSG)还原成为还原型的谷脆甘太(GSH)，后者可与工业上的重金属Pb、Hg、Ca、Sr等离子结合而排出体外，避免重金属离子与体内

17、含硫基酶相结合而失去酶的活性。同时VC分子CZ位上的氧具有负电性而与重金属阳离子结合生成一种复合物。这种复合物可以由尿中排出。在消化道中VC九与金属离子Cu、Zn、Ca进行络合使肠道吸收下降，从而减少它们对人体的毒性作用。 还原性质与防治坏血病，坏血病是胶原的合成发生障碍.因而结缔组织容易发生改变。在临床表现血管壁的通透性增加及脆性增加等，容易出血，如牙眼出血，还表现骨质脆弱，易于骨折，以及在骨骼接头处受损，出现类似佝偻病的症状VC参与胶原形成，使前胶原a- 肽链上脯氢酸残基与赖氨酸残基的怨化酶激活，所以机体长期缺乏VC会患坏血病。 还原性质与免疫作用，抗体分子中含有相当数量的二硫键(- S-

18、S-)这些二硫键都是由二个半胱氨酸组成的，所以合成抗体要有半胱氨酸。但蛋白质中含有大量的胱氨酸，这就必须将胱氨酸还原成半胺氨酸，才能参人抗体的合成，而体内高浓度的VC可以将肤氨酸还原成半胱氨酸，使体内半脆氨酸含量增高经利于免疫球蛋白的合成。肤氢VC又可能使新合成的免疫球蛋白肤键的硫基(-SH)成为二硫键(-S-S-)，而促进免疫球蛋白(抗体)的形成。VC还能增强体液免疫与细胞免疫功能。1.1.7 维生素C临床应用新进展抗病毒，寻找抗毒毒物质的系统研究从五十年代开始_的.由于病毒只能在机体活细胞内生长，故多数抗病毒制剂对宿主亦有毒性，从而难于在临床应用。近十余年，由于对病毒结构与繁殖周期以及抗病

19、毒药物的作用点有了新的认识。现已知病毒是核蛋白，中心的部分等核酸，周围有蛋白质组成的外壳，有些病毒的最外层还有以脂类为主要成分的封套。这种结构使病毒侵入机体后，其中心的核酸不致被体内核酸酶水解而遭破坏。VC浓度为10-3克分子/升时，可以使表面张力下降，可使蛋白质蛋白质，蛋白质脂类和脂类脂类之间的结合力下发，以至病毒侵入机体后，病毒的蛋白质脂类外壳很快脱离里面的核酸，病毒里面的核酸就易被体内核酸醋水解而破坏，病毒的致病力就减弱。VC通过轻化作用促进组胺分解，对组胺有解毒作用。VC可增加白细胞的吞噬作用增加抗体生成，减弱病毒的致病力，用来防治感冒。 抗衰老，从生物学水平来解释衰老的一个重要理论是

20、“自由基学说”，认为在机体代谢过程必然产生一些自由基（:free radical)，而引起细胞损伤和交联键的形成，这就降低了酶的活性.使核酸代谢发生误差，膜功能受损，衰老色素大量堆积，影响细胞功能，导致衰老。因VC有很强的还原性，可作为一种抗氧化剂，能捕获这种活性能力极高，而且能使瞬间即逝的，对人体损害很大的自由基成为惰性或活性物质，因此起到抗衰老作用。 防治体脉粥样硬化，有人认为动脉粥样硬化患者动脉壁上的沉着物可能是钙磷脂胆固醇组成的一种不溶解的复合物。大量VC能促进胆固醇转化胆汁酸，可使动脉壁粥样斑块沉着物中的胆固醇溶解，促进钙盐溶解。若VC持久占优势，则胆固醇由动脉粥样硬化斑块转向肝脏，

21、血浆胆固醇及B脂蛋白保持低水平，并且脂蛋白脂肪酸活性增高，从而使血浆甘油三脂降低，减少动脉粥样硬化发生。VC参与胶原及细胞间质的形成，免于动脉基质受损害，防止局部血栓形成。动物实验证明VC能加速心肌蛋白合成，促进梗塞区的修复，还可促使心肌对葡萄糖的利用及糖原合成，所以VC可用来防治冠心病。 治疗不孕症，美国TEXAS医学研究所DAWSONEB等报告二VC可恢复精子活动力，增加受孕机会。当血清VC含量达到25MG/cll，精子VC含量上升到12.7mg/d1，凝集不动的精子由原来的20%程下降到n%。VC只能适用于非特异性精子凝集致不孕者，对其他原因造成的不孕则不一定有效。大量服用VC以后可能降

22、低某些妇女的生育能力，还可能影响胚胎发育。 抗癌，VC的杭癌作用与下例四方面有关 (1)致癌物质亚硝胺，在体内可由食入的亚硝酸盐和仲胺合成。VC还原性质，可以防止亚硝胺在体内合成，使体内亚硝胺含量下降。但VC不能阻断体内亚硝胺的致癌作用。(2)脂肪、碳水化合物和食物中其它成分的氧化，对人体的健康至关重要，但是这种氧化作用是靠多种酶的精确控制，这些反映的产物是无害的二氧化碳和水。然而，非酶性氧化作用的产物是过氧化物游离基或称过氧化物离子(O2)这些危险的反应物能刺激活细胞产生许多不良化学反应，并可能标志开始发生癌瘤.VC可通过减少过氧化物离子的生成，防止癌瘤发生。(3)药物或毒物在内质网上的轻化

23、过程是生物转化中心的重要反应，此种反应由混合功能氧化酶完成，VC可升高此酷的后性，增强药物或毒物经化作用。如一些致癌性芳香胺茶胺，通过芳香环经化，则可消除毒性，而便于排泻.(4)近年来，有人发现癌病毒能使正常细胞内CAMP含量下降，而使细胞产生恶变。VC通过增高细胞内CAMP的含量则可使恶变的细胞转为正常。VC提高细胞内CAMP的含量与VC参与氨基酸代谢及神经递质的合成有关二体内络氨酸通过轻化作用生成肾上腺素，羟化反应需要B一轻化酶氧化，B一轻化酶分子中的铜原子必须处于Cu2+还原为Cu+，顺利完成多巴胺的羟化作用，促进肾上腺素合成，而肾上腺素活细胞膜上的腺甘酸环化酶将ATP转变成CAMP。另

24、一方面VC结构与CAMP相似，对水解CAMP的磷酸二脂酶有竞争性抑制CAMP生成无活性的5AMP。cAMP是机体内重要的调节因素之一，它是某些激素及身体的第二信使，参与了多种生理功能和物质代谢。而VC的广泛的药理作用可能与增加细胞内CAMP有关。 其它，VC还应用于辅助治疗各种传染病、肝胆疾病、克山病、精神病、创伤及纠正代谢性硷中毒等。VC是水溶性维生素，基结构与营养物质葡萄糖相类似，可以通过主动转运，并在离纳子协助下能对抗浓度差而吸收。VC可以食物各到。由于摄入不足会出现VC缺乏，应适量补充。不管致病机制如何，不加区别大量使用VC，一方面浪费，另一方面也会产生另一种危险性，应注意。 1.2

25、维生素C测定的原理与特点 1.2.1 还原型抗坏血酸的测定 2，6-二氯酚靛酚法(2，6-D法)，其原理是利用2，6-二氯酚靛酚钠盐(C12H6O2NCl2Na)在酸性条件下将还原型抗坏血酸氧化成氧化型抗坏血酸，而其本身被还原成无色的衍生物;当还原型抗坏血酸全部被氧化时，过量的2，6-二氯靛酚钠盐呈现红色，指示终点。该方法适于测定无色和浅色样液或提取液中的AsA，无须特殊仪器，操作简便、快速、准确4。由于大多数果蔬和其制品有颜色，影响了终点的准确性。使用白陶土脱色2和加1，2-二氯乙烷5均不能得到理想的结果。作为对该法的改进，向一定量的AsA提取液中加入过量2，6-D，与AsA作用后，剩余的2

26、，6-D被二甲苯萃取、比色。样液中AsA含量与二甲苯萃取液中浅红色呈线性负相关。因花青素不溶于二甲苯，故可测定深色样品7。应用流动注射分析(Flow Injection Analysis，简称FIA)，使该法的分析速度更快(120样品/h)、灵敏(检出限05 ug/ml)1。由于2，6-二氯靛酚和还原型抗坏血酸具有不同的电位(2，6-二氯靛酚的氧化还原电位是150mV， AsA的氧化还原电位是100 mV)，利用铂和氯化银复合电极测定其电位差的变化，可准确地测定样液中AsA的含量。该法适宜色泽较深样品中AsA的测定。溶解氧测定是利用极谱分析法原理进行的，其基本电路与电位滴定相似3。但样品中同时

27、存在的Fe2+、Sn2+、SO2、SO3、S2O32-等还原性杂质对本法则有干扰。扣除样品中内源还原性物质是对2，6-二氯靛酚法的一个改进12。 碘量法，其原理是基于AsA还原碘，自身氧化DAsA，而碘可由碘酸钾还原碘化钾来得到，当多余碘存在时，淀粉呈蓝色，指示终点。反应式如下:KI+KIO3+6H+2K+3H2O+I2 III还原型抗坏血酸+I2+2H+氧化型抗坏血酸+2HI IV该法简便，但在测定深色样品时，准确度欠佳9。分光光度法，其原理是三价铁离子被AsA还原二价铁离子，后者与4，7-二苯基-1，10-菲咯啉(Bathophenanthroline， BP)生成红色络合物， 其强度与样

28、品中AsA含量有化学计量关系。该法具有快速，灵敏的优点;此外，样品中DAsA还可被Dithiothreitol (DTT)还原为AsA，同时测定DAsA的含量15。采用流动注射分析停留技术还可实现AsA与果蔬常用抗褐变剂L-半胱氨酸的同时测定13。间接光度法，测定是在pH=50的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，抗坏血酸与铁(III)和1，10-二氮杂菲溶液相互作用，形成橘红色的Fe (II) -二氮杂菲络合物，在波长510 nm处，吸光度与50ml抗坏血酸含量在10200 ug浓度内呈线性关系。该法的特点是简便快速，灵敏度高，干扰少8。紫外光度法，其原理是还原型维生素C(AsA)在紫外区2438 nm

29、处有最大吸收峰，以Cu2+作催化剂，利用溶解氧，将在2438 nm处有最大吸收的AsA选择性氧化为2438i nm处无最大吸收峰的DAsA，进行本底校正，此法具有简便、快速、准确的特点6。光电比浊法，其原理是在酸性提取液中的AsA，可被亚硒酸氧化成DAsA，后者还原成元素硒，在一定条件下，其溶液中形成稳定的悬浊液。当2050 ml浸出液中AsA含量在04 mg时，浊度与AsA含量成正比。样品中含有单宁、山梨酸、还原酮类不干扰测定。Fe2+、SO2在常温下干扰不明显，仅亚锡离子有干扰11。高效液相色谱法(HPLC)此法的优点不仅操作简便，分离时间短，对结构不稳定的维生素C，尤为适合;缺点是所用仪

30、器较为昂贵14。极谱法，其原理是用溴水将AsA氧化成DAsA，而后者与邻苯二胺缩合，可用于极谱定量测定抗坏血酸含量。脱氢型的还原糖、还原酸等对测定有干扰，可用氯仿萃取分离干扰物质后进行测定11。 1.2.2 维生素C总量的测定2，4-二硝基苯肼法，此法为测定维生素C总量最常用的方法。其原理是用活性炭把AsA氧化成DAsA，在pH5以上时，后者分子重排，其内酯环裂开生成2，3-二酮古乐糖酸(DKG)，与硝基苯肼偶联，生成红色的脎，其呈色强度与DKG浓度成正比;如果再测定出DKG、DKG + DAsA的含量，则可计算出AsA、DAsA的含量。该法虽然测试过程长、须严格掌握测试条件，但其准确度和精密

31、度均较高11。荧光分光光度计法，其测定维生素C的基本原理是:样品中的AsA被氧化成DAsA，并与邻苯二胺反应，生成荧光物质喹喔啉(Quinoxaline)衍生物，荧光强度与DAsA的浓度成正比，用荧光计测定荧光强度。该法具有较强的专一性，样品中有些成分会造成干扰，可作空白试验校正干扰物所产生的荧光。此法的优点是，生成荧光物质所需时间短，操作简单，能在短时间内测定维生素C总量和分开测定AsA、DAsA的含量14。 过氧化物酶法，果蔬中的维生素C，在过氧化氢存在下，添加合成底物1，4-二氨基苯，通过过氧化物酶氧化显色，作为维生素C氧化终点，然后比色测定。该法的特点是不需要昂贵的仪器，适应性强，容易掌握，费用低，检测快速，不需要预先纯化所分析的试样16。在上述测定维生素C的方法中，有些既可以测定AsA，或DAsA，又可测定维生素C总量，如分光光度法、紫外光度法、2，4-二硝基苯肼法、荧光分光光度计法、过氧化物酶法，在同时测定AsA和DAsA时适宜选用。1.3 高效液相色谱 1.3.1 高效液相色谱法 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同