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1、人类胚胎干细胞基础培训教材30人类胚胎干细胞基础技术高级培训班2010-121. 绪论 32. 饲养层细胞的制备 42.1 从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 42.2 MEF的传代 52.3 MEF的冻存 52.4 MEF的失活 63. 饲养层细胞的准备 74. ES/iPS细胞的复苏 96. ES/iPS细胞的冻存 127. 人类胚胎干细胞的无滋养层培养 137.2 无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代 138. 拟胚体的形成 149. 胚胎干细胞全能性的鉴定 159.1碱性磷酸酶活性检测 159.2干细胞表面marker的免疫染色检测 169.3干性因子的去甲基化程度分析 179.4干

2、细胞内源基因的表达分析 199.5端粒酶活性检测 219.6核型检测 219.7拟胚体形成 219.8畸胎瘤形成实验 2210. 干细胞技术培训及服务一览表 2311. 附录 251. 绪论本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。2. 饲养层细胞的制备材料与仪器 成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01 胰酶，货号M-005-1 成纤维细胞冻存液（2x

3、），货号EFFM-01 基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01 T25透气培养瓶，NUNC，货号156367 T75透气培养瓶，NUNC，货号156499 2 ml移液管，NUNC，货号159617 5ml移液管，NUNC，货号159625 10 ml移液管，NUNC，货号159633 15ml离心管，货号366036 50ml离心管，货号373660 冻存管，NUNC，货号377267 Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头 生物安全柜，货号

4、CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i 电子计数器，millipore，货号PHCC00000 电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800 低速离心机，Thermo Scientific CL10 液氮罐，Thermofisher，货号CN509002.1 从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70的酒精中消毒。2. 将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。4. 找出子宫，一只手用无菌

5、钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。5. 用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。6. 将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。7. 用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。8. 用8mlPBS 将胎鼠洗三遍。9. 用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数。10. 将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。11. 用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏，PBS洗三次。12. 将胚胎

6、转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入0.25胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。13. 用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。14. 一个T75瓶加10ml MEF完全培养基，按照每2-3个胚胎一个T75瓶，将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。2.2 MEF的传代1. 将T75瓶中的MEF培养基吸出。2. 加入大约3ml胰酶 ，于37的CO2培养箱中放置3-5分钟3. 取出瓶子，轻轻晃动，可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。确保瓶盖是拧紧的。用手掌根轻拍瓶侧3-5次。在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。4. 加入同等体积

7、（3ml）的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。Note: 这一培养基是包含血清的，将会完全抑制胰酶的活性。5. 补加42mlMEF培养基到瓶子中，使总体积达到50ml，混匀。6. 将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中，每瓶10ml。7. 放在5CO2培养箱中培养，逐日观察。2.3 MEF的冻存1. 吸去培养液，加3ml0.25胰酶至完全覆盖瓶底（以T75为例）。2. CO2培养箱中孵育3-5分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。3. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，吹打混匀。4. 将其转移至15ml离心管，用电子计数器进行细胞计数后，以1000rpm的速度离心5分钟。5.

8、移去上清，用少量新鲜的MEF培养液重悬细胞沉淀。6. 缓慢加入等量的MEF细胞冻存液（2x）并混匀。7. 分装上述细胞悬液于2ml冻存管中，每管0.25ml。8. 在冻存管上注明细胞名称，代数，数目，冻存时间。9. 将冻存管放到冻存盒中，-80冰箱过夜。10. 最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。2.4 MEF的失活1. MEF传代到35代时，当细胞铺满培养瓶后（以T75为例），加3ml 0.25胰酶，放入37的CO2培养箱孵育3-5分钟。2. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，用移液枪吹打几次以形成单细胞悬浮液。3. 将所有细胞悬液混合到一个50ml离心管中，补加适量新鲜的MEF培养液

9、。4. 取0.5ml上述细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，用4.5ml培养液稀释，混匀。5. 用电子计数器计数细胞。6. 将原来的50ml离心管封口，使用gama射线辐照仪，5080戈雷辐照。7. 辐照完后，以1000rpm的速度离心5分钟。8. 移去上清，用适量新鲜的MEF培养液重悬细胞。用于培养人胚胎干细胞的饲养层细胞标准浓度是30,000 cells/cm2。按照此标准铺板。具体铺板步骤请见3饲养层细胞的准备。对于暂时不用的细胞，将其冻存，需要时复苏。具体冻存步骤请见2.3 MEF的冻存。3. 饲养层细胞的准备材料和仪器 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01

10、 成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01 基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235 CO2培养箱，Thermo，HERA cell 240 Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头 T25透气培养瓶，NUNC，货号156367 2 ml移液管，NUNC，货号159617 5ml移液管，NUNC，货号159625 10 ml移液管，NUNC，货号159633 电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号45808003.1加入足量的基质胶均匀铺到瓶（或孔板或皿）底部，以能覆盖全

11、部底部为准，譬如T25透气培养瓶以超过0.5ml为宜。3.2 37培养箱放置至少30min。3.3从培养箱中取出瓶（或孔板或皿），轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再次覆盖，然后立即吸弃基质胶。3.4加入适量成纤维细胞完全培养基（37预孵育超过10min），譬如T25透气培养瓶以加入4ml为宜。3.5从液氮中取出冻存的失活过的MEF细胞，立即投入37水浴中，迅速解冻（1min之内）。3.6根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的瓶（或孔板或皿）中，混匀。推荐的饲养层细胞密度为3万cells/cm2。Point 饲养层细胞需在ES/iPS细胞传代前两至三天准备。 饲养层细胞的密度最适

12、宜是8090, 太密或是太稀疏都容易使干细胞分化。 请在铺被前先做预实验估算细胞的复苏存活率，以一个T25培养瓶计算，若存活率为90%，则铺入的细胞量应为83.3万。Note: 饲养层细胞铺了10天之后推荐不再使用。Table1 培养容器的类型和需要的基质胶的体积培养容器的类型基质胶体积24-well0.1-0.2ml12-well0.2-0.4ml6-well/35mm0.4-0.5ml60mm/T25 Flask0.5-1ml100mm/T75 Flask2-3mlTable2培养容器的面积和需要接种的MEF细胞悬浮液的体积（接种细胞的浓度为1.5105 cells/ml）培养容器的类型细

13、胞悬浮液的体积24-well0.4ml12-well0.8ml6-well/35mm2ml60mm/T25 Flask5ml100mm/T75 Flask15mlNote: 上述细胞接种密度按人类ES/iPS细胞培养的标准计。4. ES/iPS细胞的复苏材料和仪器 人类ES/iPS细胞（SiDSH -01, SiDSH -03），货号HIPS-01/03 人类胚胎干细胞完全培养基，货号HESM-01-500 CO2培养箱，Thermo，货号HERA Cell 240 Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头 电动移液器，Thermo Scientific F

14、innpipette C1，货号4580800 T25透气培养皿，NUNC，货号156367 5ml移液管，NUNC，货号159625 15ml离心管，NUNC，货号3660364.1 解冻人ES/iPS细胞，从液氮中取出冰冻的人类ES/iPS细胞冻存管，立即投入37水浴中快速的旋转以迅速解冻（控制在1min之内）。Note: 水不要淹没瓶盖4.2当只有一片冰晶存在时，从水中取出冻存管。用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍，以去除水缸中的微生物。4.3将细胞转移到一个预装有2ml人类胚胎干细胞完全培养基的15ml离心管中，混匀。200g（1000rpm）, 离心5 分钟。4.4吸弃上清液。用4ml

15、的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀。4.5转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞的T25瓶中，补加人类胚胎干细胞完全培养基至总体积为5ml。4.6将瓶放入37的CO2培养箱中，观察细胞每天的生长情况。Point 复苏的第二天无需更换培养液，从第三天起每天更换新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基。 复苏后第5天左右可以看见微小的克隆出现，之后逐渐长大。 复苏后第10-12天传代，具体情况视ES细胞生长情况而定。5. ES/iPS细胞的传代材料和仪器 人类胚胎干细胞培养液（含bFGF 货号 HESM-01-500 ；不含 bFGF 货号 HESM-02-500） 型胶原酶（货号 M-001） 已经包被好饲

16、养层细胞的培养瓶/板 Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头 T25透气培养皿，NUNC，货号156367 5ml移液管，NUNC，货号159625 15ml离心管，NUNC，货号366036 电动吸引器Point 当出现以下情况之一即可以进行细胞传代：1 MEF滋养层细胞生长超过两周。 2 克隆太大，或太密集。3 当培养的ES克隆中出现越来越多的分化。人的ES细胞传代（以T25培养瓶为例）5.1 从培养瓶中吸出旧的人胚胎干细胞培养液5.2 立即加入3-4ml的型胶原酶到瓶中，温柔的摇晃培养瓶使之覆盖到所有的细胞。Note: 型胶原酶需在37度预热。5.3

17、 将T25瓶重新放回37度培养箱中，放置约20min30min。 5.4 消化期间可以处理预铺了饲养层细胞准备用来传代的新的培养瓶，处理如下：吸弃里面的成纤维细胞完全培养基，加入1ml人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤feeder（只要将瓶底盖过），吸弃，然后加入4-5ml新的人类胚胎干细胞完全培养基，以备传代。5.5 待克隆消化下来后，取出培养瓶，将瓶中液体连同脱落的克隆转移到15ml离心管里。加入2ml的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF），混匀。5.6 待干细胞团块沉降下来后，吸弃上清液。5.7 加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤细胞（即吹打重悬），待细胞沉降

18、下来后，吸弃上清。5.8 加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞，并用移液枪吹打克隆到适合大小，然后根据自己需要按比例传代。Point： 在消化过程中，最好每隔10min拿出来观察一下，看是否已经开始消化。随着克隆的消化，克隆边缘部分卷起，当克隆大部分卷起，直至轻轻晃细胞就会脱落时，表明消化充分。注意：消化时间约为2030min，根据经验，这一时间段可以将未分化的干细胞克隆消化下来，而分化的克隆就不会消化下来，所以，消化时间不宜过长，这样可以剔除分化的克隆。而如果消化不充分，会导致传代后的细胞结块。所以，要掌握好时间。 如果细胞不易沉降，则可以10001200rpm离心30sec1m

19、in使细胞沉降。 传代比例通常为1：6或1：8。 传代后的注意事项： 1传代后的第一天，不需更换新的培养液，从第二天起，每天换液。2传代周期为67days，但要视细胞状态而定，传代可以改善细胞状态。3传代的前两至三天预铺feeder。6. ES/iPS细胞的冻存材料和仪器 人ES/iPS细胞（生长到可传代的状态，同上描述） 人胚胎干细胞培养基（货号： HESM-01-500） 胶原酶（货号M-001） 人胚胎干细胞冻存液（2x）（货号：HESFM-01） 15ml离心管，NUNC，货号366036 液氮罐，Thermo，货号CN50900 冰 镊子 Thermo F3移液器和灭过菌的枪头 2m

20、l冻存管，NUNC，货号377267 冻存管架，NUNC，货号376589Point： 人的胚胎干细胞可以在液氮中长期冻存。 为了得到人类胚胎干细胞的高存活率，在开始冻存步骤之前，准备好所有的材料和仪器。冻存管在使用之前应该在冰上预冷，且应该事先将必须的信息（如细胞的名称，传代次数，细胞数目，冻存日期等）标记在管子的标签上。 冻存步骤（以T25瓶为例）：6.1当细胞生长良好时，消化细胞（具体步骤同上述传代过程）。6.2将消化下的细胞洗涤两次。6.3用2ml新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞并吹打至传代大小。6.4待克隆沉降下来后，吸弃上清。6.5加入0.25ml新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞6

21、.6加入0.25ml人胚胎干细胞冻存液（2x），快速混匀。6.7将上述0.5ml细胞悬液转移至2ml冻存管中。6.8迅速将冻存管放入冻存盒中，-80冰箱过夜。6.9最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。7. 人类胚胎干细胞的无滋养层培养材料与仪器7.1 人类胚胎干细胞条件培养基（CM）的收集1. 配制人类胚胎干细胞培养液。2. 培养瓶加入适量明胶（覆盖瓶底即可），放入5CO2培养箱孵育30分钟左右。3. 吸掉明胶，将辐照过的饲养层细胞按照55,000 cells/cm2浓度铺板。4. 待细胞贴壁后，换人类胚胎干细胞培养液培养液（按照0.5 ml/cm2)。5. 24小时左右开始收集培养液，之

22、后每天收集，可持续收集7-10天。6. CM可存放在-20冰箱中一个月。7.2 无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代1. 在培养瓶中加入适量matrigel（覆盖瓶底即可）放入培养箱孵育 1小时左右。2. 吸去 matrigel，将饲养层培养的人胚胎干细胞传代洗涤后，最后细胞转移到此培养瓶中，加CM培养。3. 在人胚胎干细胞克隆生长5天左右传代。吸去培养液，加 dispase 5CO2培养箱消化至克隆大部分脱壁。4. 加适量培养液，用移液管轻轻吹打使克隆脱壁。5. 将细胞悬液转移到15ml离心管中，用移液管吹打几次使细胞克隆至适当大小。6. 吸取适量混匀的悬液至小离心管中，离心沉淀，用胰酶消化成

23、单细胞，加培养液中和，细胞计数。7. 以1000rpm的速度离心5分钟。8. 吸去上清，加CM培养液重悬细胞。9. 按照90,000170,000 cells/cm2将细胞接种到已铺好matrigel的培养瓶中，补加适量CM。轻轻晃动培养瓶，使克隆均匀分布在瓶底，放入5CO2培养箱培养。8. 拟胚体的形成材料与仪器拟胚体（embryonic body,EB）来源于多能干细胞，且由多种分化的细胞类型组成。它可以模拟胚胎早期发育的过程，是一种很好的在体外研究早期发育中细胞和分子间作用的模型。拟胚体的制备：将得到的iPS细胞系扩增培养后，按正常传代步骤消化下来，洗涤去除MEF细胞，将细胞吹打至小团块

24、（比正常传代大小再小一些），然后悬浮培养在MEF培养液中。3天后换第一次液，之后每2-3天换液一次，直至收集。收集EB后用TRIZOL裂解，抽提RNA, 反转录，通过real-time PCR的方法（见real-time PCR检测的具体protocol）检测各胚层marker的表达情况。9. 胚胎干细胞全能性的鉴定胚胎干细胞全能性的鉴定主要包括以下几个方面： 碱性磷酸酶活性检测 干细胞表面marker的免疫染色检测 干性因子的去甲基化分析 干细胞内源基因的表达分析 端粒酶活性检测 核型检测 拟胚体形成 畸胎瘤形成实验下面分述各种鉴定的方法以及详细的操作步骤：9.1碱性磷酸酶活性检测材料 PB

25、S buffer 4% Paraformaldehyde Alkaline Phosphatase Detection Kit：Sidansai，货号AP-1kit 1 x Rinse Buffer (e.g. TBST: 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05% Tween-20) 碱性磷酸酶染色步骤：a. Aspirate media and fix ES or iPS cells with a fixative (e.g. 4% Paraformaldehyde in PBS) for 1-2 minutes. Note: Do not overf

26、ix. Fixing cells longer than 2 minutes will result in the inactivation of alkaline phosphatase. b. Aspirate fixative and rinse with PBS buffer.c. Aspirate and rinse with 1 X Rinse Buffer. DO NOT allow wells to dry. d. Prepare reagents for Alkaline Phosphatase staining (BufferA: BufferB: BufferC=100:

27、38:28)e. Add enough stain solution to cover each well (e.g. 0.5mL for a well of a 24-well plate). Incubate in dark at room temperature for 15 minutes. f. Aspirate staining solution and rinse wells with 1 X Rinse Buffer. Cover cells with 1 X PBS to prevent drying and then count the number of colonies

28、 expressing AP (red stem cell colonies), versus the number of differentiated colonies (colorless).9.2干细胞表面marker的免疫染色检测可用的试剂盒包括：货号包装所鉴定的抗体A-P1-1KT10testOct4，Sox2，Nanog，SSEA4，Tra-1-60，Tra-1-81A-P2-1KT10testOct4，Sox2，Nanog，SSEA1，SSEA3，SSEA4，Tra-1-60，Tra-1-81A-P3-1KT10testOct4，Nanog，Sox2，SSEA1表达于人类ES/i

29、PS细胞中的标志物包括：Stage-specific embryonic antigen-3(SSEA3)Stage-specific embryonic antigen-4(SSEA4)Tumor-related antigen-1-60(TRA-1-60)Tumor-related antigen-1-81(TRA-1-81)OCT4SOX2Nanog表达于小鼠ES/iPS细胞中的标志物包括：Stage specific embryonic antigen-1(SSEA-1)OCT4SOX2Nanog免疫染色步骤：1. 首先把细胞固定在4多聚甲醛（4PFA）中，室温放置30min;2. 在

30、无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）注意：此步骤仅限于核蛋白，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白如SSEA 和Tra等3. 将上述溶液吸干，先用1X PBS洗涤一次，再用抗体稀释液（0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于PBS）洗涤两次；4. （此步骤可不操作，进行此步骤是为了更好的封闭非特异反应）用封闭液（含1%BSA+4% normal serum+0.4%TritonX100的PBS溶液）封闭细胞；5. 将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4度放置过夜；6. 用PBT（0.1%TritonX100）洗涤细胞35次；7. 将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置1h; 注意：从步骤7开始，样品要注意避光！8. 用PBT洗涤3次；9. 将DAPI (1mg/ml in PBS)母液以1:1000 用PBS稀释, 室温放置5min;OR: 将JASMIN（hochest）母液以1:1000用PBS稀释，室温放置5min;10. 用PBS洗涤5min,两次；11. 再用4多聚甲醛室温固定30min；12. 最后