POU同源域蛋白的结构及其在发育中的作用.docx

1、POU同源域蛋白的结构及其在发育中的作用 POU同源域蛋白的结构及其在发育中的作用综 述POU(Pit-Oct-Unc)同源域蛋白是一组真核生物转录调控因子，由众多POU同源盒基因家族成员编码，在脊椎动物和无脊椎动物中，参与胚胎发生的早期过程，在细胞谱系的分化及神经、内分泌和免疫等多系统发育过程中起重要的调控作用。POU同源盒基因最早是根据哺乳动物转录因子Pit-1(存在于大鼠垂体中的一种转录调节因子)、Oct-1和Oct-2 (B淋巴细胞转录因子)与线虫Unc-86(线虫发育相关调控因子)都能与一段特定序列的DNA区域结合而归族的1。POU同源盒基因家族是众多同源盒基因家族中的一组成员，具有

2、同源盒基因的特征性结构特点，且其特殊的POU区也是转录因子与DNA结合的重要结构形式2。一、同源盒基因的结构及分类1、同源盒基因的结构模式1983年在瑞士的Gehring实验室，在绘制果蝇触角足基因(antennapedia, Antp)外显子图谱的过程中发现Antp的cDNA克隆和染色体上距Antp基因左侧30kb部位有弱的交叉信号，并发现这一交叉杂交顺序是ftz基因转录单位的一部分，很快在Ubx基因中也发现相同的DNA片段。用这一片段作为探针进行杂交试验，发现在果蝇染色体上有10多个位点有阳性杂交信号。DNA序列分析表明，这些位点所属基因均含有约183 bp的特征性核酸结构，称为同源盒(h

3、omeobox, HOX)。将含有这段同源盒DNA序列的基因称为同源盒基因，由同源盒基因编码的蛋白质则称为同源域蛋白(homeodomain protein)。同源盒结构具有较高的保守性，并保持相同的阅读框架，编码61个氨基酸残基的肽段，称为同源异形域或同源结构域(homeodomain, HD)。同源结构域与螺旋转角螺旋(helix-turn-helix, HTH)、锌指结构、亮氨酸拉链等结构一样，是真核生物DNA结合蛋白中一类特殊的结构式样。接着，在具有同源异形突变现象的甲虫和属于环节动物的蠕虫等无脊椎动物中发现了同源盒结构。随后，在脊椎动物也发现有同源盒结构存在。先是在爪蟾早期胚胎的mR

4、NA中发现同源盒序列，后来在小鼠与人的基因组中也找到这段特殊的DNA序列。同源域蛋白含有同源结构域和特异结构域(specific domain，SD)，连接两者的是一段长度变化较大的连接区(linker)。通常特异结构域位于同源结构域的上游，靠近同源域蛋白的N-末端，同源结构域靠近C-末端，这两个结构域在同源域蛋白作为转录因子发挥作用时均起重要作用。同源结构域是同源盒基因序列编码的61个氨基酸构成的肽段，是具有高度保守性的氨基酸域。它的一个显著特点是碱性氨基酸残基高达30，这符合同源域蛋白是DNA结合蛋白的特点。X-射线衍射晶体学研究表明：同源结构域，折叠成3个-螺旋，在第2和第3个螺旋间构成

5、螺旋转角螺旋结构，这是DNA结合蛋白的主要特征结构3。同源结构域能特异性地识别以5-TAAT-3为核心的1012bp的DNA序列4。第2和第3个螺旋间形成的浅沟结构，可以与特异的核苷酸序列结合，而第l和第2个螺旋则为同源结构域与DNA的结合提供了空间和结构的完整性5。2、同源盒基因的分类迄今已发现300多个同源盒基因，广泛分布于从酵母到人类的各种真核生物中。哺乳动物同源盒基因根据其在染色体上的分布可分为复合型和分散型。复合型同源盒基因在染色体上成簇串联分布，并按前后轴(antero- posterior，A-P)的方式表达，称之为A-P型同源盒基因，又称为Hox类基因，与Antp基因有很高的同

6、源性( 80% )。小鼠及人类的A-P型同源盒基因分为A、B、C、D四个簇，分别位于7、17、12、2号染色体上的特定区域(7p14-15、17q21、12q12-13、2q31)6，每簇中又按基因序列的同源性分为13个组。这一类同源盒基因统称为Hox基因，目前共发现39个Hox基因7。另一类分散型称非A-P型同源盒基因，也被称为Hox类基因，或歧异Hox genes、non-Hox genes。它们不成簇排列，而是散布在不同染色体上，与Antp基因的同源性较低( 50% )。根据同源结构域以外保守序列的同源性分类，又可分为：eve、ems、Dll、cad、Hlx、msh、TLC/NEC、NK

7、-1、NK-2、en、prd、prd-like、cut、LIM、ZF和POU等16种类型。它们之间同源结构域的同源程度存在差异，分子内其他肽段差异性更大，显示出蛋白质水平上的多样性。同源域蛋白是一大类重要的转录调控因子，作为反式作用因子，它既可以是转录的激活子，也可以是转录的抑制子，其靶基因包括其他同源盒基因、粘附分子、胞外蛋白和生长因子等。同源盒基因作为胚胎发育的主控基因，在胚胎发育、细胞生长、分化、迁移和某些组织特异性基因的表达中起重要作用8。当同源盒基因表达调控异常会使个体发育或组织器官在形成过程中出现异常形态结构, 产生疾病, 严重者可使细胞恶性转化形成肿瘤。二、POU同源域蛋白的结构

8、及与DNA的结合1、POU同源域蛋白的结构POU家族成员都有共同的结构式样，称为POU结构域，由147156个氨基酸组成，包括二个亚结构域及其连接区，靠近-末端的是含6978个氨基酸的POU特异性结构域(POU-SD)，靠近C-末端是含61个氨基酸的POU同源结构域(POU-HD)。两者之间是一段长度变化较大的连接区，含1556个氨基酸残基9,10。POU-SD和POU-HD偶联存在，是独立的HTH结构单位，都直接结合到DNA序列上，与DNA的碱基和磷酸基团作广泛的接触，两者都是POU蛋白高亲和性识别并结合特异DNA序列所必需的8。POU蛋白的POU-HD禀承着同源盒结构的共同特点，含有3个-

9、螺旋结构，螺旋和之间形成HTH结构9。核磁共振和X-射线衍射分析表明如，HD在第52/53残基形成一个转折，这样可认为螺旋形成两个螺旋(/)11，这附和某些文献中对POU-HD的描述是形成4个-螺旋结构。组成、螺旋的氨基酸残基极为保守，几乎所有的POU家族蛋白都含有RVWFCN序列。在POU-HD的N端和C端各有一组保守的碱性氨基酸残基：N端8个残基中有56个碱性残基，C端7个中有45个碱性残基，这些碱性残基对于POU蛋白的DNA结合功能及转录激活是必不可少的。POU-SD分为两个亚结构域A和B，两个亚结构域的中心都含有一个碱性氨基酸簇，使两个亚结构域分别在C-末端和N-末端都形成一个-螺旋结

10、构12,13，这样两个亚结构域共形成4个-螺旋结构，可形成与POU-HD相似的立体构象。图3：POU同源域蛋白的结构2、POU同源域蛋白DNA的结合模式完整的POU-HD对于所有的POU蛋白与特异DNA位点的识别和结合都是必需的，POU-SD主要赋予POU蛋白以DNA结合特性和调节特性。对POU蛋白与特异DNA位点识别和结合的研究，目前对Oct-1和Pit-1的了解较为详尽。（1）Oct-1与八聚体元件结合Oct-1蛋白对DNA八聚体元件ATGCAAAT（又称Oct序列）有高亲和性， POU-SD结构域同5端半位点ATGC接触，POU-HD同3端半位点AAAT接触。对复合物的结构分析表明，两个

11、结构域分别结合于双链DNA相反两面的大沟内14，两个结构域之间不形成直接相互作用，各以HTH单位内的识别螺旋定位于相背的大沟内。两个结构域之间24个残基组成的连接区，使蛋白质分子内两个结合DNA的区域结合得更精确，识别更具特异性。POU-HD在DNA大沟内与3端半位点AAAT结合。关键性的结合由识别螺旋内Val47、Asn51和Cys50的侧链进行。Asn51与第3个A(即A7)形成氢键，Val47与T8的甲基发生疏水性作用。Cys50是POU-HD特有的，其SH基与八核苷酸之外的位点接触，其原因尚不清楚。另外一些保守残基如Arg5、Thr6和Arg13同八核苷酸一条主链上磷酸基团形成氢键，L

12、ys25、Ser48、Arg46和Arg53与另一主链的磷酸基团接触。尽管不同POU蛋白的HD存有差异，但与DNA结合的方式却十分相似，特别是Asn51非常保守，总是同AAAT的A7相互作用，Arg53和第25位残基(Oct-1中是Lys25)与磷酸基团形成盐键。Oct-1蛋白的POU-SD和POU-HD有着相似的立体构象，POU-SD由4个-螺旋组成，有高度保守的紧密的疏水核心，许多亲水性残基位于靠近蛋白质一侧表面。Oct-1中螺旋是识别螺旋，Thr45同ATGC序列中的T2和C3形成氢键，Agr49同G3和G4形成氢键。如果把Arg49换成Ala，就会破坏Oct-1对DNA的接触。Gln4

13、4同A1形成氢键。结构域内其他保守性残基也参与接触，如Arg20和Gln27与碱基及磷酸基团的氧原子形成氢键，使整个氢键网络更加稳定15。从Oct-1分离的POU-SD和POU-HD分别与靶序列ATGCAAAT进行结合，测定解离常数。发现单独的POU-SD结合性很弱，POU-HD的结合较好，而含有两者的肽段结构对这一靶序列的亲和性则明显增强。如果在DNA靶序列的ATGC位点和AAAT之间增加13 bp(如ATGCAGCAAAT)，亲和性就会大大降低。两个POU结构域POU-SD和POU-HD对DNA特异位点的结合具有协同作用16，两个结构域之间的连接区使得两侧的POU结构域更易于定位到八聚体元

14、件序列上，都不可或缺。（2）Pit-1以二聚体形式结合于DNA位点哺乳动物Pit-1蛋白以二聚体形式结合于某些基因启动子元件上，复合物晶体结构表明，二聚体亚基分别位于DNA的两侧，同一亚基的POU-SD和POU-HD处在DNA同一侧(见图5)。两亚基通过POU结构域介导相互间形成偶联，一个亚基的POU-HD螺旋的羧基端呈伸展结构，与另一亚基POU-SD螺旋及螺旋、间形成接触，相互作用形成二聚体17。概括来说，POU同源域蛋白共有3个重要的结构区域: N端转录激活区、POU-SD和POU-HD18。POU-SD和POU-HD主要负责与靶DNA的特异结合，POU蛋白对于靶基因的转录激活作用则依靠N

15、端转录激活区19。POU蛋白的N-末端被认为作为转录激活区与POU蛋白的功能密切相关，但对它们的具体作用机制尚不清楚。这些区段往往含有特征性的氨基酸结构，且在不同类别POU蛋白间存有差异。这与POU蛋白可以结合到相同的DNA元件，但各自针对不同的基因产生不同调节作用相符合。例如，Pit-1的N-末端富含丝/苏氨酸，Tst-1的N-末端富含丙/甘氨酸，Oct-3的N-末端富含脯氨酸，Brn-2的N-末端富含谷氨酰胺20-23。POU蛋白的N-末端可通过直接与转录机器复合物接触，从而发挥激活的重要作用。这个作用也可以是抑制性的，如Oct-3结合到Rex-1的启动子上，根据细胞环境的不同，Oct-3

16、依赖N-末端内的不同结构区段能够激活或抑制转录启动。3、连接区在DNA识别中的作用原先认为连接区肽段的功能仅是连接POU-SD和POU-HD，使它们同时结合于DNA。但进一步研究发现连接区的长度在1556氨基酸，序列差异性大，能使POU-SD与POU-HD采取各种相应方向，识别各种DNA元件。例如有些第类POU蛋白，有17个氨基酸的连接区，允许结合的半位点之间存在0、2或3bp的间隔，使POU-SD与POU-HD能以不同方向与相应DNA位点结合更紧密10。4、与辅助因子的相互作用POU蛋白不仅仅依靠两个保守的结构域及连接区来识别和结合DNA序列，往往需要通过其他因子的辅助来调节自身的识别和结合

17、功能。POU蛋白结合在不同DNA元件上，能选择偶联不同的辅助因子，这是它们转录调控的重要特性。例如Oct-l可以同多种蛋白因子偶联，包括Spl、Apl、受体PR/GR等激活因子，VP16、RlA、OCA-B/OBF-1 /Bob-1等调控因子，PTF和TBP等基础因子等。当HSV病毒感染细胞，Oct-1与辅助因子VP16形成复合物，结合于HSV病毒基因启动子TATGARAT元件上，形成Oct-l/VP16/ HCF复合物，获得转录激活活性。Oct-1与VP16相互作用主要来自POU-HD内第22位Glu残基。如果用Ala替换Glu22，就会明显降低Oct-1同VP16的偶联能力。VP16作为辅

18、因子本身不能结合到DNA上，但同POU蛋白偶联后结合于DNA，对POU蛋白的调节活性产生重要影响24。图4：在不同DNA结合位点上，辅助因子VP16和OCA-B选择性地与Oct-1结合，并影响转录。 (1)在HCF辅助下，Oct-1与辅助因子VP16形成复合物，结合于HSV病毒基因启动子TATGARAT元件上，形成Oct-l/VP16/ HCF复合物，获得转录激活活性，HCF起到加强Oct-l和VP16间结合的稳定性的作用； (2)在八聚体元件ATGCAAAT上，Oct-1与OCA-B形成复合物，获得转录激活活性。Oct-1与辅助因子的结合受到DNA位点序列的影响。基因表达受染色质结构的影响2

19、5。组蛋白N-末端的赖氨酸可被乙酰化，这样的结构变化能够使DNA结合蛋白更容易与启动子序列结合；相反，组蛋白的去乙酰化反应则会阻遏转录。许多与DNA结合蛋白协同发挥作用的转录共活化物具有使组蛋白乙酰化的内在活性。相反，那些抑制转录蛋白能够直接使启动子去乙酰化，或通过辅助阻遏物发挥去乙酰化作用26,27。N-CoR以前被认为是一种辅助阻遏物28，能结合于Pit-1的同源结构域，有效地抑制Pit-1的转录激活作用。这个转录抑制就是依赖mSin3，SAP30使组蛋白去乙酰化29。N-CoR的作用受结合条件影响，当它与其他转录因子结合，如细胞核激素受体，就能间接活化Pit-1的转录激活作用。Pit-1

20、的POU结构域也能同其他共活化物结合，如CBP/p300和P/CAF等，这些因子都具有组蛋白乙酰化活性30,31。这样，Pit-1与具有乙酰化功能或去乙酰化功能的因子结合，决定着它的转录激活作用是被活化还是被抑制。三、POU家族成员的分类根据POU区的全部氨基酸序列同源程度，可将哺乳动物POU蛋白分为ClassClass共六组：Class(Pit-1)，Class(Oct-1，Oct-2，Skn-1a/I)，Class(Brn-1，Brn-2，Brn-4，Tst-l)，Class(Brn-3.0，Brn-3.1，Brn-3.2)，Class(Oct-3/4，Sprm-1)和Class(Brn-

21、5，RPF-1)，详见表1。居同一组内的成员，其POU-SD、POU-HD和连接区具有明显的保守性，但在POU区以外，包括N-末端和C-末端，POU亚家族成员间均表现明显差异。这与POU蛋白的转录激活功能差异密切相关。表 1：哺乳动物POU同源盒家族成员表家族成员表达部位功能基因敲除表型Class I Pit-1(GHF-1, PUF-1, Pou1f1) 限于腺垂体内调节腺垂体激素的表达如GH, PRL, TSH等腺垂体中GH细胞, OXT细胞, TSH细胞缺失Class IIOct-1(Otf-1, NF-A1, NFIII, OBP100, Pou2f1) 普遍分布调节组蛋白H2B，sn

22、RNA及其他多种基因表达及复制尚无报道Oct-2(Otf-2, NF-A2, Pou2f2)B淋巴细胞，神经胶质细胞，神经元，精子细胞等调节B淋巴细胞特异性基因，GnRH等B淋巴细胞功能缺陷Skn-1a/I(Oct-11, Otf-11, Epoc-1, Pou2f3) 角质形成细胞调节K10和HPV等表皮部位基因角质形成细胞终末分化受阻Class IIIBrn-1(Otf-8, Pou3f3)发育中的神经系统，下丘脑，肾脏调节神经干细胞，下丘脑中部分细胞的分化尚无报道Brn-2 (N-Oct3, N-Oct5, Otf-7, Pou3f2)发育中的神经系统，下丘脑调节神经干细胞，下丘脑中部分

23、细胞的分化室周核、视上核中CRH、 AVP和OT神经元缺失Brn-4 (RHS2, N-Oct4, Otf-9, Pou3f4)发育中的神经系统，下丘脑，腺垂体，内耳调节神经干细胞，下丘脑中部分细胞的分化。与内耳发育相关内耳半规管缺陷，耳聋(中耳听小骨链障碍)Tst-1(Oct-6, SCIP, Pou3f1)胚胎干细胞、发育中的神经系统、神经胶质细胞及表皮调节神经干细胞，下丘脑中部分细胞的分化。调节髓鞘形成髓鞘形成缺陷，膈神经核异常Class IVBrn-3.0 (Brn-3a, RDC-1 Pou4f1)外周感觉神经元、一些中枢神经系统核团调节感觉神经元分化特定感觉神经元和自律细胞缺乏Br

24、n-3.1 (Brn-3c, Pou4f3)外周感觉神经元、中枢神经系统核团、内耳调节感觉神经元，调节内耳发育内耳毛细胞缺失、耳聋Brn-3.2(Brn-3b, Pou4f2)外周感觉神经元、中枢神经系统核团、视网膜调节感觉神经元、视网膜发育视网膜节细胞缺失Class VOct-3 (Oct-4, Oct-3/4, Otf-3, Oct-5, NF-A3, Pou5f1)胚原基细胞、卵母细胞、胚胎干细胞、胚胎细胞团维持胚胎早期多分化潜能，调节FGF4及其它基因胚胎早期所有细胞变成滋养细胞Sprm-1(Pou5f2)精母细胞调节精子发生轻微降低生育力Class VIBrn-5(Emb, mPOU

25、, TCFb, Cns-1, Pou6f1)广泛表达、但在神经系统(包括下丘脑和垂体)表达量较高对有丝分裂后细胞起调节作用，抑制神经元增殖尚无报道RPF-1 (Pou6f2)视网膜、背侧丘脑调节视网膜发育尚无报道四、POU蛋白的表达和功能 根据POU蛋白的表达分布及功能特点，认为它们可能在胚胎发育，特别是神经、内分泌等系统早期发育及细胞分化中发挥重要功能。1、Pit-1 Pit-1基因在人类位于第3号染色体，全长43Kb，由6个外显子和5个内含子组成32。Pit-1蛋白属第I类POU蛋白，由291个氨基酸组成，分子量33kD，包括N端转录激活区和C端POU区。C-末端的POU结构域，参与识别结

26、合DNA位点、形成同源二聚体及与其他因子相互作用；长171氨基酸的N-末端，富含丝/苏氨酸，作为转录激活区，负责激活靶基因的转录。哺乳动物体内还发现存在其他几种异构体。Pit-1(又称Pit-2/GHF-2 /Pit-1)，分子量为35kD，其结构与Pit-1相近，只是转录时由于内含子选择性剪切作用在N-末端转录激活区多插入26个氨基酸33。Pit-1在垂体的表达量仅为Pit-1的1/71/8。Pit-1对大鼠垂体前叶的胚胎发育也具有一定作用34。Pit-1T结构与Pit-1基本相同，由于内含子选择性剪切作用，在Pit-1T蛋白的N-末端转录激活区多插入14个氨基酸。Pit-1T主要在小鼠促甲

27、状腺激素(thyrotropic stimulating hormone，TSH)阳性细胞中表达35，功能尚不清楚。（1）Pit-1蛋白在垂体前叶胚胎发育中的作用。小鼠胚胎8.59天形成Rathkes囊，是垂体腺的初始。第10.5天开始不对称分裂生成一种前体细胞，表达垂体特异的Pit-1祖先蛋白(Porp-1蛋白)，Prop-1结合在Pit-l基因上游调控区，调控Pit-l基因表达，至胚胎14天Pit-1开始在垂体腺中表达。Pit-1基因表达后，随后在第17天生长激素(growth hormone，GH)、催产素(oxytocin, OXT)和TSH才开始表达，这种前体细胞进一步分化成GH、O

28、XT和TSH垂体细胞。Pit-1在胚胎期的率先表达，提示Pit-1蛋白对于胚胎期垂体前叶细胞发育分化以及调控GH、OXT和TSH基因表达，可能起重要作用。在Snell侏儒鼠，Pit-1发生突变，失去作为转录因子激活靶基因转录的能力，其垂体前叶的GH、PRL和TSH细胞均出现萎缩32，此试验进一步证明了Pit-1蛋白对于胚胎期垂体前叶GH、PRL和TSH细胞的发育有重要作用。（2）Pit-1蛋白在垂体前叶激素基因表达中的作用成熟个体的Pit-1在垂体的3种细胞类型中表达，即合成TSH的促甲状腺素细胞、产生OXT的催产素细胞和合成GH的生长激素细胞。这些细胞系中， Pit-1蛋白可以作为反式作用因

29、子作用于上述细胞特异性基因的启动子元件，激活GH、PRL、TSH及Pit-1基因的转录36。GH基因5旁侧区有两个Pit-1结合位点。有研究证明，在调节GH基因转录的过程中，Pit-1与生长激素释放激素(growth hormone-releasing hormone，GHRH)及生长抑素(somatotropin release inhibiting factor，SRIF)具有内在的联系。关于GHRH及SRIF促进或抑制GH分泌的作用，一般认为是通过环磷酸腺苷蛋白激酶A系统作用于Pit-1基因来实现的。蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)可使环磷酸腺苷(cyclic

30、adenosine monophosphate，cAMP)反应元件结合蛋白磷酸化，已磷酸化的反应元件结合蛋白则通过促进Pit-1的基因表达来调节GH基因的表达和分泌。SRIF的作用与GHRH相反，它通过cAMP-PKA系统抑制GH基因的表达和分泌37。在OXT基因近端启动子区和远端增强子区各存在4个Pit-1蛋白结合位点和1个雌激素反应元件，这些结合位点的核心序列与GH相同。试验表明，体内OXT基因的正常表达需要Pit-1蛋白和雌激素-雌激素受体复合物的协同作用。在TSH基因启动子序列上发现2个Pit-1结合位点，在异构体Pit-1T的协同作用下，Pit-1能直接与这两个位点结合并激活TSH基

31、因转录。目前认为，有两种蛋白Porp-1蛋白和Pit-1蛋白可以调节Pit-1基因的表达。Prop-1蛋白启动胚胎期Pit-1基因的起始表达及维持生后Pit-1基因的持续表达。Ames侏儒鼠Porp-1基因发生突变，会导致胚胎期Pit-1基因的起始表达不能激活38。从胚胎16.5天开始，Pit-1蛋白通过结合至Pit-1基因上的正性和负性元件精确地控制Pit-1基因的基础表达。在Snell侏儒鼠，Pit-1发生突变，Pit-1基因在胚胎期14天尚有正常表达，但至围产期时消失。证明生后Pit-1基因的持续表达，需要Pit-1蛋白的自身维持。（3）Pit-1蛋白调节细胞增殖除了调节细胞终末分化的标志性基因GH、OXT和TSH的表达，Pit-1蛋白还有对垂体的细胞增殖有激活作用。通过显微注射技术将Pit-1反义序列注入垂体肿瘤GC细胞系，可出现细胞增殖能力显著下降的现象39。Snell侏儒鼠，Pit-1基因发生突变，垂体中的GH细胞、OXT细胞和TSH细胞出现显著细胞增殖缺陷32。近期的研究表明Pit-1促使细胞增殖的的机制可能与以下三方面有关。首先，腺病毒相关试验揭示Pit-1直接参与调节DNA的复制；其次，Pit-1可以直接调节细胞周期起始相关基因