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1、医药卫生科研项目可行性报告模板TiO2纳米管载pH响应型胶束药物控释体系的研究(面上项目)1、立项的背景和意义 牙列缺损及牙列缺失是口腔患者的常见病、多发病，不仅直接降低患者的咀嚼效率，同时对患者的颜面部外形、全口牙齿咬合的稳定性、全身营养的均衡都有一定的影响。随着生活质量水平的不断提高,人们对牙齿修复体的要求已经不仅仅是满足于简单的咀嚼功能的恢复，更要求在修复过程中不损伤天然牙，修复体更舒适，修复牙齿更逼真等。因此，以钛材为基础的骨内种植技术应运而生，成为牙列缺损、牙列缺失和颌面部缺损最有效的修复手段之一，种植义齿以其不损伤临牙，美观，咀嚼功能强等不可替代的优点已经作为牙列缺损及缺失重要的修

2、复方式被广泛应用于口腔临床治疗。随着优质钛合金的出现及钛合金表面改性技术的发展，钛合金以其优异的综合性能（良好的生物相容性、机械强度、钝化能力、抗腐蚀性、与骨组织相近的低弹性模量等）成为牙种植体、颌面赝复体固定桩、骨内植入式假肢以及各种矫形材料等人体硬组织替代物和修复物的首选材料。据统计，每年我国植入牙种植体数百万颗，人工关节、脊柱装置、冠脉支架数十万件，骨折内固定器械数百万套。然而，由此引起的植入物相关性感染问题也逐渐凸显出来，成为临床上一个非常棘手的问题1。牙种植体由植体、穿龈部分及上部结构三部分组成，植体材料基本为商业纯钛或TC4钛合金，钛植体经应力分析对材料形态和结构优化设计，表面采用

3、不同技术处理以增大比表面积及使其在体内容易形成类骨磷灰石（BLA）层，已实现材料与骨的化学性键合，其抗剪切力达50Mpa以上，完全可满足负重、承载修复体的应用要求；上部结构的修复可根据不同口腔情况的要求，基本实现形态和功能并举的目标。但在实际应用中，牙种植体仍有较高失败率，其基本表现为牙龈附着下移或牙周袋形成，牙槽骨吸收，最终种植体松动、脱落。大量报道对种植体失败的原因进行了分析，除应力过载或屏蔽致骨吸收外，种植体周围炎的发生和发展是其最终失败的重要表现和主要原因。因此，寻找有效的方法消除种植体相关感染具有非常重要的临床意义，对钛合金种植体进行表面改性研究十分必要。种植体表面易感染的主要有两方

4、面原因：一、表面生物膜的形成；二、种植体/组织界面免疫能力低下。钛种植体在生理环境下其表面会吸附一层蛋白层，使钛表面适合于细菌聚集和生物膜形成2-3。生物膜是指附着在物质表面的微生物实体，是细菌在复杂多变的环境中，产生外部多糖包膜多聚体，使细菌相互粘连形成膜状物，它可以通过多种机制保护其内部的细菌不受攻击3。此外，在种植体植入后的早期，种植体/组织界面血管分布量较少，防御能力较低，有利于细菌入侵从而发生感染。种植体手术的病人临床上常规会给予全身抗生素预防性治疗以阻止感染的发生4,5。然而，全身抗生素给药具有许多缺点，如靶点药物浓度低和全身毒副作用等。因此，从这些角度考虑局部抗生素给药更有优势。

5、目前已有多种方法实现植入体表面局部缓释给药，如在种植体表面制备各种涂层6-7，采用共价结合的方法将药物固定在钛表面等方法8；但是这些缓释方法存在药物载量少，且涂层易剥脱等缺点。 近年来一种新的局部药物缓释设计理念是在钛种植体表面用阳极氧化法形成TiO2（二氧化钛）纳米级小管作为局部“药物纳米储存缓释器”，为种植体局部药物缓释提供了新思路9。药物在TiO2 纳米管中的释放主要受管孔结构支配（直径和长度比），纳米管长径比对于药物释放率起着决定性作用，可以有效延迟或加速药物释放10。目前延长药物释放的方法主要是减小TiO2 纳米管径，通过降低药物释放率来延长释放持续时间，但是此法存在降低药物装载总量

6、、纳米管直径调控范围有限（20-300nm），“突释”现象明显以及很难满足长时间（数周）药物连续释放的临床需求等缺点11。因此，如何增加可控孔径范围内TiO2纳米管的药物装载总量，达到药物缓释的可控性，实现植入体表面缓释给药从而达到有效控制种植体周围炎十分重要。 近年来，生物可降解聚合物胶束作为纳米药物载体备受瞩目12-14。它能包裹疏水性药物，提高药物在水中的溶解度，延长药物在体液中的循环时间另外，聚合物胶束的尺寸一般为10200nm，处于TiO2纳米管直径调控范围之内（20-300nm），装载入TiO2纳米管内可以避免聚合物胶束过早地 被肾脏清除和机体免疫系统吞噬，局部用药可降低全身药物副

7、作用和改善药物利用率15值得注意的是，单纯TiO2纳米管装载聚合物胶束无法控制药物的释放量为靶向位点提供有效的药物浓度。刺激响应性胶束可根据内部刺激（如pH、氧化还原电位、溶酶体酶）或外部刺激（如温度、磁场、光）快速响应，如溶解、溶胀或坍塌，从而达到在合适时间释放药物的目的，提高治疗疗效。在这些刺激中，pH响应性是使用最广泛的, 在正常人体组织，ph值在7.4，某些病理状态(如炎症)下，病灶组织局部由于缺氧导致无氧代谢而被酸化，pH值降低，在种植体穿龈或穿皮部位，由与细菌大量产酸，在菌斑内ph值甚至低至5.5。因此，低pH值被视为炎症反应的重要标志之一。因此，我们可以利用正常组织和炎症组织的p

8、h值差异，设计一种能对环境中pH值做出响应的TiO2纳米管加载聚合物胶束的药物缓释系统。 综上所述，充分利用TiO2纳米管结构的可控性、聚合物胶束良好的稳定性、药物包封率及腙键的pH响应性能等优势，结合两者的优势对钛基体表面进行改性研究，从而达到钛种植体表面pH智能响应型药物缓释的目的，降低药物全身副作用，改善药物利用率。本项目在前期已成功采用阳极氧化法在纯钛基体表面制备TiO2纳米管阵列，针对不同电压、电解质浓度、阳极氧化时间等因素对制备不同管径、长度TiO2纳米管阵列的影响做了初步的实验和探讨，确定参数后制备结构稳定的TiO2纳米管，采用简易真空冻干法成功在TiO2纳米管内直接加载阿莫西林

9、，通过SEM、XRD、EDS观测等手段对TiO2纳米管进行表面观测及结构表征，同时在缓冲溶液中模拟体外药物释放，证实了钛表面TiO2纳米管结构直接装载药物呈现出药物“突释”现象，本项目拟在前期研究基础上，采用聚合物胶束良好的药物包封率和pH智能响应的优势，改善TiO2纳米管载药“突释”现象，从而建立一种新型种植体周抗炎药物缓释体系并实现释放速率的调控，模拟正常生理过程中出现种植体周围炎时药物的响应性释放，最大限度的降低种植体周围炎对种植体初期愈合产生的不良影响，促进种植体早期愈合、提植成功率。2、国内外现状和发展趋势 阳极氧化是指金属或合金的电化学氧化。在相应的电解液和特定的工艺条件下，由于外

10、加电流的作用下，将金属或合金的制件作为阳极，采用电解的方法使其表面形成氧化物薄膜。虽然阳极氧化的历史已经超过50年，但直到1995年，人们发现通过优化阳极氧化条件可以形成高度有序孔阵列的氧化膜。1999年，Zwilling16等第一次报道了在含氟离子溶液中，钛表面经过电化学阳极氧化得到TiO2纳米管阵列。TiO2纳米管制备设备要求较低，并可通过调整制备电压、电解质浓度、阳极氧化时间、pH值等参数获得一定管径和管长的TiO2纳米管阵列，具有很好的生物相容性。目前TiO2纳米管阵列已广泛用于种植体表面处理方面的研究。 近年来，在钛种植体表面用阳极氧化法形成TiO2纳米级小管作为局部“药物纳米储存缓

11、释器”为种植体局部药物缓释提供了新思路。TiO2纳米管的制备是钛金属基片通过在电解质溶液中阳极腐蚀而获得纳米级小管，这种方法可以制得排列整齐的纳米管阵列，且纳米管与基体金属直接相连，结合非常牢固。TiO2纳米管具有良好的生物相容性，且其纳米管状结构有利于药物装载和缓释，已经使用TiO2纳米管实现药物缓释17。药物在TiO2 纳米管中的释放动力学主要受孔结构支配（直径和长度比），纳米管长径比对于药物释放率起着决定性作用，可以有效延迟或加速药物释放17。目前延长药物释放的方法主要是减小TiO2 纳米管径，通过降低药物释放率来延长释放持续时间，此法存在降低药物装载总量、“突释”现象明显以及很难以满足

12、长时间（数周）药物缓释的临床需求等缺点18。 一些学者用各种方法对钛纳米管药物缓释进行调控。如采用PLGA和壳聚糖对钛纳米管管口进行封闭药物可以以零级速率缓释达6-8周。还有一些学者采用电化学沉积法将羟基磷灰石沉积于钛纳米管管口，大大延缓了药物的释放速率。目前这些调控缓释的方法仅仅是针对早期的药物突释进行调控，这些缓释系统不能对组织的微环境做出反应，不管种植体周围组织是否存在感染，抗菌药物都按既定的方式进行释放。 在正常生理状态下，人体组织环境处于pH=7.4，某些病理状态(如炎症)下，病灶组织局部由于缺氧导致无氧代谢而被酸化，pH值降低，在种植体穿龈部位，由于细菌大量产酸，在菌斑内pH值甚至

13、低至5.5。因此，可以将低pH值作为炎症状态的一种典型特点，充分利用炎症状态与正常生理组织环境下pH值的差异，设计一种对pH响应敏感的种植体表面改性体系。 近年来，生物可降解胶束作为纳米药物载体备受瞩目。聚合物胶束是一类由两亲性共聚物在水溶液中通过自组装形成的纳米粒子，亲脂性的药物分子能通过物理包裹进入胶束的疏水内核，而亲水的壳层用来稳定胶束，聚合物胶束具有良好的生物相容性和生物可降解性。聚乙二醇（PEG）和聚（-己内酯）（PCL）是具有生物可降解性和良好生物相容性的材料，并已获得FDA批准由PEG-PCL嵌段共聚物自组装形成的胶束作为纳米药物载体尤为常见但其存在降解缓慢和无刺激响应性等缺陷，

14、从而阻碍了药物在靶向部位高效累积，降低了药物的有效利用率。 目前，已有大量基于酸敏感键（原酸酯、腙和缩醛等）的响应性胶束的研究。其中，特别是腙键，它在中性条件下稳定，酸性环境中容易水解，并被广泛用于连接聚合物主链和各种活性治疗药物在已有的文献报道中，腙键常被用到pH敏感聚合物胶束中，且能在酸催化下快速水解，其结构合成简单，对酸灵敏度高，最常被用来作为pH敏感药物载体的酸可裂解官能团。Wang等19报道了叶酸和细胞穿透肽R7修饰的含腙键PLGA-mPEG胶束，负载硫酸长春碱以后，在pH=7.4条件下8 h内释放了35.8%. 而在pH=5.0条件下8h内释放了65.6%.说明载药胶束释放呈pH依

15、赖性。因此，充分利用官能团腙键敏感的pH响应特点，结合PEG-PCL嵌段共聚物良好的生物相容性和生物可降解性，将其共聚物载药后装载入钛表面TiO2纳米管内，从而可获得一种具有pH智能响应的药物缓释体系。参考文献1 Campoccia D, Montanaro L, Arciola CR. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials 2006, 27(11): 2331-2339.2 Evan M. Hetrick, Ma

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17、ous complications in joint replacement. Acta Chir Orthop Traumatol Cech 2006,73(2):108-114.5 Williams DN, Gustilo RB, Beverly R, et al. Bone and serum concentrations of five cephalosporin drugs. Relevance to prophylaxis and treatment in orthopedic surgery. Clin Orthop relate Res 1983,179:253-265.6 N

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20、graft loaded with adsorbed vancomycin. Bone 2011,48(3): 631-638.9 Karan G, Moom SA, David F, et al. Local drug delivery to the bone by drug-releasing implants:perspectives of nano-engineered titania nanotube arrays. Therapeutic Delivery (2012) 3(7), 857873.10梁砚琴. TiO2 纳米管的制备及改性研究D. 天津大学,2012.11 Vall

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24、Drug from Self-Assembled -Substituted Amphiphilic Poly(-caprolactone) Micellar NanoparticlesJ. Biomacromolecules,2012,13(7):2163-2173.16 V. Zwilling, E. Darque-Ceretti, A. Boutry-Forveille, et al. Structure and physicochemistry of anodic oxide films on titanium and TA6V alloy. Surf Interface Anal 19

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26、ineeringJ. Chemistry. 2006 Aug 7;12(23):5934-43.19 Wang Y, Dou L M, He H J, Zhang Y, Shen Q. Mol Pharmaceutics, 2014, 11(3): 885-894.3、研究内容、研究目标、拟解决的问题和今后研究思路（一）研究内容1.微结构的制备：采用阳极氧化法在Ti表面制备不同管径、长度的TiO2纳米管，构建PEG-NH-N=CH-PCL聚合物胶束装载的载体（已部分完成）在含NH4F，H2O 和甘油的电解液中通过阳极氧化法在钛表面制备TiO2 纳米管阵列。对TiO2 纳米管阵列进行表征。2.制

27、备PEG-NH-N=CH-PCL聚合物胶束并载药利用具有生物相容性和生物可降解的PEG和PCL作为原料，采用开环聚合方法，合成PEG-NH-N=CH-PCL嵌段共聚物，并将腙键引入到PEG-NH-N=CH-PCL的主链上，并以此为构筑单元制备共聚物胶束。取一定量的PEG-NH-N=CH-PCL和阿莫西林溶于，-二甲基甲酰胺（DMF）中，超声溶解后滴入磷酸盐缓冲溶液后离心处理，冷冻干燥上层清液得到载药胶束。采用动态光散射（DLS）测量聚合物胶束的粒径及粒径分布通过透射电镜（TEM）观察其形态结构，利用核磁共振证实腙键的成功引入，用UV/Vis可见光谱检测230nm激发波长处的吸光度，绘制标准曲线

28、，计算包封率和载药量。3.采用真空冻干法装载聚合物胶束在TiO2纳米管内装载已完成药物包封的PEG-NH-N=CH-PCL胶束。在体外模拟体液中研究PEG-NH-N=CH-PCL胶束的pH智能响应性释放，通过改变TiO2纳米管管径比，选出能最大程度装载聚合物胶束的制备参数。4.生物学评价（1）体外细胞学评价 对加载了含阿莫西林的pH响应型聚合物胶束的TiO2纳米管进行生物相容性评价，以及体外模拟炎症环境下药物缓释对于种植体周围炎中常见致病菌中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制作用。（二）研究目标 本课题的主要目标是成功构建一种安全、有效的种植体周pH响应型局部缓释给药系统，以获得最大限度装载阿莫西

29、林及聚合物胶束，充分发挥聚合物胶束pH智能响应型释放药物的优势，模拟种植体周围炎情况下的低pH 环境，最大限度的提高药物利用率，保证种植体的稳定性，提高种植成功率。其中包涵以下任务： （1）成功构建一种安全、有效的种植体周局部缓释给药系统，获得TiO2纳米管加载聚合物胶束实现pH响应性释放药物的效果。 （2）体外模拟试验证实TiO2纳米管加载聚合物胶束pH响应型释放药物，抑制种植体周围炎的发生发展，提高种植成功率。（三）拟解决的问题 如何控制聚合物胶束的粒径和TiO2纳米管管径及管长，以期可以达到最大载药量和包封率的同时，保证TiO2纳米管的结构稳定性，是本项目亟需解决的问题。（四）今后研究思

30、路 利用本课题的实验基础，进一步探讨种植体周辅助给药应用，进一步研制更加“智能”的种植体药物缓控释系统，如不需要时药物不会从TiO2 纳米管中释放，而情况需要时在某种因素刺激下药物可以按我们设定的释放动力学药从TiO2 纳米管中释放。并进一步开展体内试验研究，为其应用于种植临床奠定基础。 在完成本课题的研究内容后，将申报浙江省自然科学基金以获得资金资助，使研究工作继续发展，推动种植体周辅助给药领域的进步。4、研究方法、技术路线和进度安排（一）研究方法阳极氧化法法制备TiO2 纳米管阵列及表征材料：纯钛片1mm2mm0.5mm。电解液：0.50wt% NH4F+ 10vol% H2O 的甘油溶液

31、。 DH1715A-5 型直流稳压电源提供阳极氧化所需电源, 在2060V 电压下阳极氧化一定时间后，立即取出样品用二次水超声清洗并晾干。表征：场发射扫描电镜（SEM）和透射电镜(TEM)观察分析试样表面形貌和内部结构，并利用X 射线能量色散谱( EDS) 分析TiO2 纳米管组试样表面元素组成。开环聚合法制备PEG-NH-N=CH-PCL胶束及表征1.1试剂聚乙二醇（PEG，Mn5000）、对硝基苯基氯甲酸酯（NPCF）、对羟基苯甲醛（PHB）、-己内酯（-CL）、阿莫西林、吡啶、水合肼、锌酸亚锡（阿拉试剂公司）；二氯甲烷（CH2Cl2）、二甲基亚砜（DMSO）、，-二甲基甲酰胺（DMF）（

32、北京化工厂）；其他为常用分析纯试剂1.2 PEG-NPCF的合成称取PEG（100mg，0.02mmol)溶于20mLCH2Cl2中，用微量进样器向该反应体系中加入16.11L吡啶，不断搅拌直至溶解将mL NPCF（200mg，0.99mmol）的CH2Cl2溶液逐滴加入到反应体系中，搅拌24h，控制整个反应过程的温度为反应后，浓缩反应液并用石油醚、乙酸乙酯沉淀，重复操作次后，真空干燥至恒重，即得白色固体PEG-NPCF。1.3 PEG-NH-NH2的合成称取PEG-NPCF（100mg，0.02mmol）溶于10mL无水乙醇，将29.10L水合肼逐滴滴加到反应体系中，90回流搅拌48h冷却至室温后，浓缩反应液，加入石油醚、乙酸乙酯，使沉淀析出，用无水乙醇洗涤沉淀，重复操作次后，真空干燥即得淡黄色固体PEG-NH-NH2。1.4 PEG-NH-N=CH-OH的合成称取PEG-NH-NH2（200mg，0.04mm