细胞因子检测.docx

1、细胞因子检测细胞因子检测细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用。某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。1、免疫学检测法 其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。2.、生物学测定法 其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标

2、,间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。3、分子生物学测定法 目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。一、IL-1的检测(生物活性测定)产生IL-1的细胞种类很多,其中最主要的为单核-巨噬细胞。IL-1可分为IL-1(也称酸性IL-1,pI=5.0)和IL-1(中性 IL-1,pI=7.0)。两者的分子量和生物活性相似,只能用抗体检测方法才能区别,常用的生物学测定

3、法对两者都适用。IL-1的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G 4.1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。IL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdR或125I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。本试验介绍L929细胞增殖MTT比色法。（一）IL-1的诱生体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用P388D1(鼠),THP-1(人)细胞株制备IL-1。本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1。1、取610周龄BALB/c或C57BL/6小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒。2、用带9号针头的5ml注射器腹

4、腔注入5ml冷的含5小牛血清的Hanks液(5NBS-HBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(内含腹腔细胞),反复抽吸几次。3、1500r/min离心8min,洗细胞2次。4、将腹腔细胞用含10小牛血清的RPMI-1640液(10NBS-RPMI-1640)配成2106/ml,加到24孔平底培养板,1ml/孔,置5CO2,37温箱孵育2h。5、每孔用5 NBS-HBSS洗3次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为巨噬细胞单层。6、将LPS(10g/ml)加入巨噬细胞单层,每孔1ml,培养4h；加入10NBS-1640 1ml继续培养至48h,收集上清液,置-20冰箱保存,待测 IL-1活性及含量。（二）L92

5、9细胞增殖MTT比色法MTT比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑盐3-(4.5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下,被还原成兰黑色的MTT-甲 ,形成MTT-甲 的量与细胞增殖程度呈正相关。故通过测定细胞形成MTT-甲 量,可间接定量分析细胞的增殖情况,具体步骤如下:1、将生长成单层的L929细胞用0.25胰酶消化23min。除去消化液后,用10% FCS的RPMI-1640将L929细胞配成1105/ml,加入96孔细胞培养板中,每孔100l。2、取100l不同稀释度的IL-1

6、标准品和待测品,分别加入各孔中,每孔设3个复孔,置37,5% CO2温箱孵育56h。3、用PBS溶解MTT为5mg/ml,用0.22m膜滤器除菌及杂质。4、上述培养体系取出后,每孔加入10l MTT(5mg/ml),37继续培养4h。5、从每孔吸出100l上清弃去,加酸化异丙醇或加DMSO 100l/孔,充分混匀以溶解底物。酸性条件使培养液中酚红指示剂变为黄色,以利于对MTT-甲 转化物的测定。6、将微量测定板置室温数分钟,保证转变的底物结晶被溶解。7、用酶标光度计以检测波长为570nm,参考波长为630nm分别测量OD值。测定应在酸化异丙醇加入后1h内完成。OD570nmOD 630nm,再

7、减去培养液对照的OD值。8、用IL-1标准品各稀释度IL-1含量(X)和各稀释度对应的OD值(Y)作直线回归,按上述概率单位分析法计算待测样品IL-2的活性单位(u/ml)。（三）注意事项1、IL-1诱生剂的浓度,培养条件和细胞浓度对结果均有明显影响,应进行预试验以确定最佳实验条件。2、培养器皿和研磨条件：24孔培养板培养细胞活率较高,但生长稍慢。玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡,故应注意采取相应措施。大量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作中的污染。研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网。二、TNF的检测(免疫学测定法,双抗体ELISA夹心法)（一）原理 选用两种针对rHuTNF-

8、分子不同表位的单克隆抗体,一种单克隆抗体作为包被抗体,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TNF-,则形成抗体-TNF-酶标抗体复合物,通过酶催化底物显色,亦可根据标准品OD值绘制标准曲线,从标准曲线上查出待检标本中TNF-的含量。（二）材料和试剂1、包被抗体: 使用时用包被缓冲液作适当稀释。2、酶标抗体: 使用时用稀释液作适当稀释。3、标准品: rHuTNF-(10ng/ml),使用时用稀释液作倍比稀释。4、阴性对照液(未免疫鼠Ig)。5、ABTS底物:2,2-Azino-bis-(3-ehtylbenzthiozoline 6-sulfonic acid),2,2-连氮基-双(

9、3-乙基苯并噻吡咯呆-6磺酸)。6、96孔ELISA板。7、0.15mol/L,pH7.4 PBS:配其它液体用。8、包被缓冲液: 0.05mol/L,pH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液。9、洗涤液: 0.05Tween 20-PBS。10、稀释液:4PEG-洗涤液(用于稀释标准品和酶标抗体)。11、底物缓冲液:0.1mol/L,pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。12、3H2O2。13、血清、枸缘酸盐或EDTA抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,后者应作适当稀释。14、ELISA读数仪等。（三）操作步骤1、包被 将稀释好的包被抗体加入ELISA板,100l/孔,4放置24h或

10、48h。2、加待检标本洗涤液冲洗ELISA板3次,加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品,100l/孔,37,1h.标准品稀释方法:取标准品150l(10ng/ml)倍比稀释7个浓度:5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml和78pg/ml。3、加酶标抗体:洗板3次,加入稀释好的酶标抗体,100l/孔,37,1h。4、显色:洗板3次,加入配好的ABTS显色液,100l/孔,室温或37显色1530min。5、ELISA读数仪测410nm处OD值,绘制标准曲线。6、从标准曲线查得待测样品中的TNF-含量。四、注意事项1、血清或血浆中残

11、存凝块或红细胞须经离心去除,勿用溶血或脂肪过多的血清。2、标本在28可储存3天,超过3天应放入-20或-70,避免反复冻融.3、分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉。4、叠氮钠(NaN3)对辣根过氧化物酶(HRP)有灭活作用,在本实验系统中应避免使用。5、底物显色液必须临用时配制,双氧水应放置在28,保存6个月以内。附: 试剂配制1. 0.15mol/L,pH7.4 PBSKH2PO4 0.2gNa2HPO412H2O 2.9gNaCl 8.0gKCl 0.2g双蒸水加至 100ml2. 包被缓冲液Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g双蒸水加至 1000ml3. 洗涤液PBS

12、1000mlTween 20 0.5ml4. 稀释液洗涤液 100ml鸡蛋清 0.6mlPEG (聚乙二醇,MW6000) 2.0gNaCl 2.9g5. 底物缓冲液Na2HPO412H2O 1.79g拧檬酸 1.29g双蒸水加至 100ml6. ABS显色液ABTS 5mg底物缓冲液 10ml3H2O2 20l三、IL-2的检测(基因的检测)细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达的检测,常用的方法有Southern印迹,斑点印迹,PCR,原位杂交及原位PCR等,Northern印迹及RT-PCR。本文介绍IL-2mRNA的测定(斑点杂交法)。将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上

13、,可用手工操作点样,也可用斑点式点样器点样,再与特异性探针进行杂交。本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。由于其操作比Northern印迹简单、迅速,所需样品量少,且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测,故很适合于临床应用。亦可用于DNA的检测。但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。（一）主要试剂1. RNA提取试剂:TRIZOL试剂(Gibcol,No.15596-026),DEPC水(Fluka,No.980210)2. 质粒提取试剂盒:(Promega:Wizard Minipreps DNA,No.117)3. DNA片段提取试剂盒:(La Jolla)4. 地高辛标

14、记和检测试剂盒:(Boerhinger Mannheim,No.1093657)5. IL-2 DNA探针6. 其他试剂（1) STE溶液 0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)（2) 溶液 50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)10mmol/L EDTA(pH 8.0)可配100ml,高压灭菌15min,贮存于4（3) 溶液 0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液稀释)1%SDS (配20%贮存液)盖紧瓶盖,颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物.于室温放置510min（4)

15、 溶液 5mol/L 乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L ,对乙酸根是5mol/L（5) 含相应抗生素的LB培养基（6) 氯霉素(0.25g/2ml)-终浓度170g/ml（7) 溶菌酶(10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl pH8.0) 1ml（8) 无水乙醇(部分-20预冷).异丙醇.75%乙醇(部分4预冷)（9) TE缓冲液(pH8.0)（10)5mol/L LiCl 1.5ml（11)RNA酶,RPMI-1640,胎牛血清(FCS),ConA(刀豆蛋白A)等（12)500l 含13%(W/V)聚乙二醇(PEG 800)的1

16、.6mol/L NaCl（13）3mol/L NaAc、饱和酚、氯仿:异戊醇(24:1)（二）主要仪器CO2培养箱:美国Forma Scientific产品;无菌操作台:苏州净化设备公司产品;图象处理分析仪:同济医大太阳公司产品;低温高速离心机:上海离心机械研究所.（三）IL-2质粒DNA探针的大量制备1、含IL-2质粒DNA探针的提取取含IL-2质粒DNA的单个菌落置两个25ml LB培养基(含100g/ml Amp)37 220r/min 振摇过夜(约16h)取10ml菌液加200ml LB培养液(含100g/ml Amp)37 150r/min 振摇4h加氯霉素(终浓度170g/ml)3

17、7 220r/min 振摇3h菌液倒入300ml离心管中离心4 5000r/min10min离心弃上清除去残液(吸水纸无菌)每管加40ml STE溶液(冰预冷)悬浮细菌后,用移液管转入到50ml离心管中4 5000r15min离心弃上清,加 5ml溶液(冰预冷)悬浮细菌,加1ml新配制(pH8.0)的溶菌酶(10mg/ml)轻摇,室温静置5min加10ml溶液,盖上盖子,将离心管小心颠倒数次混匀液体,不要用旋涡振荡器冰浴10min,且勿摇动加7.5ml溶液(冰预冷),轻振荡离心管数次使之混合冰浴2030min,使沉淀完全,4 12000r/min20min离心取上清到另一50ml离心管中,加0

18、.6体积异丙醇,混匀,室温静置15min室温 5000r/min15min离心弃上清用75%乙醇洗涤沉淀一次(不将沉淀悬浮),倒出乙醇,倒置吸水纸上,使乙醇挥发用1.5mlTE(pH8.0)将沉淀溶解,加等体积冰预冷的5M LiCl,混匀后置冰浴10min4 12000r/min10min离心取上清至新EP管, 加等体积的异丙醇(约3ml),充分混匀,室温静置15min室温 12000rmin10min离心(回收沉淀的核酸)小心去上清,将管倒置以使最后残留的液滴流尽,用75%乙醇洗涤沉淀,流尽乙醇,用吸纸吸去附于管壁的液滴,将管倒置在纸巾上数分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发用500l TE(p

19、H8.0)溶解DNA沉淀,移至新EP管中,加入RNA酶(终浓度100g/ml)37水浴30min加等体积(500l)含13%(W/V)PEG(800)的 1.6mol/L NaCl,充分混合4 12000r/min5min离心吸去上清,用400l TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀加等体积饱和酚(400l)混合12000r/min10min离心吸上层水相移至另一EP管,加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)剧烈混匀呈乳白状12000r/min10min离心吸上层水相移至另一EP管,加等体积氯仿:异戊醇(24:1)混匀12000r/min10min离心吸上层水相移至新EP管(硅化),加入

20、0.1体积的3mol/L NaAc(pH5.2)和2体积的-20预冷的无水乙醇,混匀(可见沉淀出现),置-20 2h或0 20min4 12000r/min15min离心弃上清,加75%乙醇(4预冷)200l,稍加振荡,离心洗涤2次4 12000r/min5min离心去上清敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽溶沉淀于11l TE溶液中 取1l电泳 其余进行酶切2.、经0.7琼脂凝胶电泳,确定有质粒DNA后,用XhoI进行酶切。酶切反应体系:质粒DNA 10lXhoI 6l10*Buffer(H) 6lDW 38l-总体积 60l 37消化过夜3. 用WizardTMPCR纯

21、化试剂盒回收IL-2 DNA片段1)将60l酶切反应体系经1%琼脂糖凝胶电泳2)紫外灯下切下IL-2 DNA片段,挑出凝胶到EP管中,加1mlResin使凝胶溶化3)用5ml一次性注射器将Resin/DNA mix转移到WizardTM Minicolumn中,用2ml80%异丙醇洗涤Minicolum,12000g离心20s, 加50lDW到Minicolumn中,12000g离心20s,收集DNA。（四）用DNA 标记和检测试剂盒对IL-2探针进行地高辛标记 地高辛是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中的类固醇半抗原,又称异羟基洋地黄毒甙配基,地高辛精可以通过一个11个碳原子的连接臂与尿嘧啶核苷

22、酸嘧啶环上的第5组碳原子相连接形成地高辛精标记的尿嘧啶核苷酸,Boehringer Mannheim公司出售的地高辛精标记核苷酸有dig-UTP,dig-dUTP,和dig-ddUTP,它们分别适用于RNA探针,DNA探针和寡核苷酸探针的标记。地高辛精标记核苷酸主要通过酶反应标记核酸探针,用标记探针做原位杂交,杂交体用特异性抗地高辛精抗体通过免疫组化技术检测。在适宜的标记反应条件下,一般每2025个核苷酸中带有一个标记的核苷酸。这一标记密度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记的抗地高辛精之间的反应。因为一个标记抗体大约复盖20个核苷酸。Boehringer Mannheim公司生产的地高辛精DNA标记

23、试剂盒和地高辛检测试剂盒在分子杂交中的应用愈来愈广泛。现介绍地高辛标记cDNA探针随机引物延伸法。1.、将DNA(1g3g)加热95(或100) 10min,随即在冰/NaCl中骤冷。DNA充分变性对探针标记十分重要。5l对照DNA作为对照。2、将离心管置于冰上,按顺序加入下列试剂:1g3g新鲜变性DNA;2l六聚核苷混合物(试剂5);2l dNTP混合物(试剂6),加入蒸馏水使总体积达到19l,再加入1l Klenow聚合酶。3、离心片刻后,将离心管置37恒温箱内孵育60min。延长孵育时间可长达20 h,可使标记量增加。4、加入2l 0.2mol/L EDTA (pH8.0 )终止酶反应。

24、5、加入2.5l 4mol/L LiCl和75l 预冷(-20)的乙醇,混匀置-7030 min或-202h,使标记探针沉淀。6、离心(16500r/min),弃上清液,用50l 70 冷乙醇轻洗沉淀物。7、将沉淀物置于真空干燥仪内干燥后,溶解于50l TE缓冲液,-20冰箱保存。（五）培养细胞RNA的提取(采用Trizol试剂盒提取RNA)1、收集培养细胞,用RPMI-1640培养液离心洗涤3次,第二次离心洗涤时用RPMI-1640培养液调整细胞数至51061107细胞。2、最后一次洗涤时吸1ml细胞悬液至1.5mlEP管中,在台式离心机离心,弃上清,加入1mlTRIZOL试剂,用移液器轻轻

25、吹打细胞数次,充分混匀,室温(1530)静置5min后,加入0.2ml氯仿,快速摇动15s,室温静置23min。3、于28离心14600r/min15min,上层无色水相(RNA溶于此层中)约占整个细胞匀浆液的60。4、小心吸取其中400移至另一Eppendorf管中,加入0.5ml异丙醇,轻柔混匀,室温静置510min后。5、于28离心14600rmin10min,在管壁下底处可见一乳白色小沉淀块,即为RNA。弃上清。6. 用冰冷的75乙醇1ml洗RNA沉淀(不用吹打沉淀),然后于28,11500r/min离心5min,去除上层乙醇后于无菌环境(或真空)风干RNA沉淀,但不要使沉淀过于干燥,

26、以免影响RNA的溶解,用20l DEPC处理的双蒸水溶解RNA沉淀。置-80冰箱备用。（六）RNA的斑点杂交1、RNA变性： 20l RNA 溶液（2g RNA）4l 20SSC14l 37% 甲醛 （formaldehyde）40l 100%甲酰胺-60温育30min,水浴冷却样品在上述RNA液体中每100l液中加210l 20SSC(共310l),每孔加150l。2、纤维素膜处理过程：硝酸纤维素膜（0.45m）水中浸泡min,再用20SSC室温浸泡h。3、滤器的处理及点样：用0.1N NaOH浸泡（洗）多孔过滤加样器,再用灭菌水彻底冲液。将纤维素膜压在多孔加样器的上层板的上面,再压在下层板

27、上,赶去气泡,然后两部分夹紧,点样前,先用20SSC（200l）洗一遍每个孔,真空抽吸干净后,再分别点样。如有未点样孔须用150l的20SSC封住其孔,然后用真空泵抽吸干净,再用20SSC清洗一次,待流体滤过纤维膜后,继续抽吸min以干燥滤膜。4、取出膜,80烤23h,膜保存于-20配20SSC 标准柠檬酸盐 pH 7.0NaCl 175.3gNa.Citrat 88.2g（柠檬酸钠）H2O 至 1000ml用10N NaOH or 10N HCl 调pH至7.0,高压消毒1N NaOH 约 0.5ml5、杂交(1)预杂交1)预杂交液：5SSC, 0.75%(W/V)封闭剂, 0.1%(W/V

28、)N-lauroylsarcodine, 0.02%(W/V) SDS2)先将预杂交液热至 60。3)将带有目的RNA的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的塑料袋,加入预杂交液,按每100cm2滤膜加20ml。4)尽可能除净袋中的空气,用热封口器封住袋口,将其置60水浴过夜,其间不断翻动塑料袋。(2)杂交1)杂交液(DIG Easy Hyb(20ml/100cm2)预温轻振荡30min2)将标记探针DNA(525ng/ml)煮沸变性5min,迅速置冰水中冷却,3)加入到预温的DIG Easy Hyb(2.5ml/100cm2)中混合,避免形成汽泡4)然后每张膜上注入预杂交液和滴加探针/DIG Easy

29、 Hyb5)振荡孵育至少6h,在微量DNA时,建议16h,使其杂交。6)2SSC,0.1SDS清洗2次,每次5min,室温。7)68振荡条件下,0.1SSC, 0.1SDS清洗2次,每次15min。（七）免疫测定1、杂交后彻底清洗,将膜置入清洗缓冲液中15min。2.、100ml封闭缓冲液(1)中封闭30min。3、抗地高辛-AP复合物(75mU/ml)用封闭缓冲液(1)110000稀释,4、稀释的抗体溶液20ml与膜孵育30min。5、100ml清洗缓冲液中2次,每次15min。6、20ml测定缓冲液中平衡25min。7、将膜置入新鲜制备的20ml显色液中孵育5min(暗处,即避光),显色过

30、程中避免振动。8、数分钟显色沉淀开始形成,16h后反应完全,可短期在亮处观察显色情况9、如果可见期望的斑点,加TE缓冲液50ml作用5min终止显色(缓冲液4)。（八）图象分析结果 用MPIAS-500多煤体彩色图文分析系统,以0.785m图查点长,在1.715105m2测量窗下测得各斑点的积分光密度值,以标准参数作图查得各样本的数值或将各组积分光密度值进行比较。（九）注意事项核酸探针的标记及杂交是一个很复杂的过程, 步骤多耗时长, 影响因素多。要想获得理想结果, 每一步都应严格操作。1、严格操作 标记和杂交的各种溶液应高压灭菌; 含SDS, Tween20的溶液应经滤膜除菌后加入其它溶液;使用灭菌吸头、干净平皿,每次用前必须严格清洗。操作膜时戴无尘手套;只用无齿镊操作膜的边缘。原位杂交的每步反应均应加盖硅化的盖玻片2、标记反应注意事项(1)随机引物标记前必须将探针变性:100沸水浴10分钟后, 迅即插入冰中,缺口平移则不需变性。(2)DNA片段必须小于10Kb。大于10KB的DNA序列则需要酶切。 最小能为随机法标记的片段是5