免疫分析核心技术基本原理.docx

1、免疫分析核心技术基本原理免疫分析技术基本原理运用抗原、抗体之间特异性结合来测定、分析特定物质办法抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答物质。按其引起免疫应答能力分半抗原、抗原、超抗原。抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质免疫球蛋白。分IgG、IgM、IgE、IgA、IgD五个亚型。不同亚型针对同一抗原表位结合位点构造相似。不同亚型浮现先后顺序不同，在血清中含量不同，在机体中浮现地点不同。 抗原抗体反映特性1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物过程是一种动态平衡，其反映式为：Ag+AbAgAb抗体亲和力（affinity），可以用平衡常数K表达：K=AgAbAgAb ,AgAb解离限

2、度与K值关于。高亲和力抗体抗原结合点与抗原决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后抗原或抗体均能保持原有构造和活性2特异性 抗原抗体结合发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。化学构造和空间构型互补关系，具备高度特异性。 测定某一特定物质，而不需先分离待检物。3最适比例 4敏感性化学比色法敏感度为mg/ml水平。酶反映测定法敏感度约为5-10g/ml。免疫测定中凝胶扩散法和浊度法敏感度与酶反映法相仿。标记免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。固相免疫测定原理基本:抗原或抗体固相化及抗原或抗体酶标记。加入酶反映底物后，底物被酶催化

3、成为有色产物，产物量与标本中受检物质量直接有关，由此进行定性或定量分析。双抗体夹心法原理此法合用于检查各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。双抗原夹心法原理用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因而其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg检测常采用本法。本法核心在于酶标抗原制备，应依照抗原构造不同，寻找适当标记办法。间接法原理间接法长处是只要变换包被抗原就可运用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体办法。竞争法原理小分子抗原或半抗原缺少可作夹心法两个以上位点

4、，因而不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中抗原和一定量酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上酶标抗原愈少，最后显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。俘获法原理IgM检测惯用于传染病诊断。用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中IgM（其中涉及针对抗原特异性IgM抗体和非特异性IgM）。此法惯用于病毒性感染初期诊断。生物素亲合素法：固相支持物；：固相化抗原；：特异性IgG（待检物）；：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）；：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）；：底物及显色剂；：显色。阳性/假阳性阳性（posit

5、ive，P）：在给定某一鉴定原则下，某一测量成果符合存在条件称为阳性。例如ELISA实验中规定，标本测量成果不不大于界值鉴定为阳性。假阳性：真实成果不满足存在条件，由于某些因素干扰，导致测量成果满足存在条件称为假阳性。在表述阳性或者假阳性时，测量办法、测量对象和合用范畴一定要详细。例如，咱们经常说某人HCV阳性，严格说这是一种不规范说法。由于可以理解为这样多意思：此人是丙肝患者；此人HCV抗原阳性；此人HCV抗体阳性（也许是患者也也许不是患者）；此人HCV RNA阳性；等等等等。阴性/假阴性阴性（Negtive,N）：在给定某一鉴定原则下，某一成果不符合存在条件称为阳性。假阴性：真实成果满足存

6、在条件，由于某些因素干扰，导致测量成果不满足存在条件称为假阴性。在表述阴性和假阴性时，和表述阳性/假阳性同样，测量办法、测量对象和合用范畴一定要详细。样本/标本/临床标本样本：在记录里，咱们把所要考察对象全体叫做总体，其中每一种考察对象叫做个体，从整体中所抽取一某些个体叫做总体一种样本。样本是一种记录学概念，样本往往不只包括一种个体。标本（Sample，S）：在给定考察或测量办法中详细测量对象，往往和记录学个体等价。例如在ELISA实验里，HCG有测血样也有测尿样，相应血样或尿样叫这个测量办法标本。临床标本：在检查技术中，直接从机体采集，通过解决而合用于临床检查标本。例如从人体采集抗凝血清叫临

7、床标本，而通过稀释或浓缩标本只能称为稀释标本或浓缩标本而不能称之为临床标本。医学决定水平医学决定水平（Medicinedecidelevel，MDL）：是指不同于参照值另某些限值，通过观测测定值与否高于或低于这些限值，可在疾病诊断中起排除或确认作用，或对某些疾病进行分级或分类，或对预后作出预计，以提示医师在临床上应采用何种解决方式，如进一步进行某一方面检查，或决定采用某种治疗办法等等。随着检测技术进步，某一检测指标检测敏捷度提高，临床意义变化，往往能变化某一疾病医学决定水平。例如某些激素项目超敏试剂盒能协助医师鉴定疾病进程及解决对策。金原则金原则：既有条件下最科学最精确原则。在检查学中指是某种

8、疾病标志物确证明验。如菌体培养，组织切片，组织活检，抗体条带免疫印迹（WB），核算诊断等等。 ELISA办法往往只检查某种疾病众多表征或标志物中最具代表性或最具操作性一种或几种，即普通所说初筛实验，追求是敏捷、简便和迅速，而这些表征或标志物检出不能确证患病与否，因此需要更进一步确证明验。对照实验对照实验（control experiment ）：普通进行某种实验以阐明一定因于对一种对象影响和解决效应或其意义时，除了对实验所规定研究因子或操作解决外，其她因素都保持一致，并把实验成果进行比较，这种实验称为对照实验。目是通过对比实验成果找到想要研究因素对实验影响作用，从而为科学研究提供事实根据和直接

9、证据。对照实验有对照组和实验组。有如下常用类型：1.空白对照：即不作任何实验解决对照组。2.自身对照：即实验与对照在同一对象上进行，不另设对照组（普通意义上重复）。3.条件对照：即给对象施以某种实验解决，但这种解决不是实验假设所给定实验变量。例如咱们普通在进行配方改进时候，所变化条件相对于本来配方来说就属于条件按对照。空白（blank,BL）1.空白实验（blank test）和空白样品：空白实验指对不含待测物质样品用与实际样品同样操作进行实验。相应样品称为空白样品（简称：空白）。 2.现场空白和实验室空白：现场空白指带到监测现场而模仿现场监测过程空白样品。实验室空白指没有带到监测现场空白样品

10、。 3.原则空白、试剂空白和全程空白：原则空白是指配原则溶液（原则系列溶液）时“零”浓度空白，或不添加原则物质空白。试剂空白是指随同试样分析环节空白样品。全程空白即全程试剂空白，是指经历试样分析所有环节空白样品。本底/非特异结合本底（background ）：亦称背景，指某一测量办法中阴性样本信号值或计数值。非特异结合（nonspecific bind，NSB）：由非待检物产生有用检测信号。体现形式为高本底阴性或阳性。CO值CO值（Cut Off Value，CO）：界值或阳性鉴定值，指某仪测量办法中用于区别阳性和阴性数值。有两种判断方式：一种是不不大于CO值判为阳性，否则为阴性，常用于ELI

11、SA实验中除竞争抑制法以外办法，判断办法较为直观；另一种是不大于CO值判为阳性，否则为阴性，常用于ELISA实验中竞争抑制法，判断办法不直观，规定测量办法稳定且重复性好。CO值计算方式：往往以某一常数加上或乘以一种变量，变量变动范畴较小，常数反映本底信号，变量反映多次测量之间差别。例如，我公司HIV试剂盒CO值计算公式：CO=NC+0.1（NC0.05时按照0.05计算）。CO值设定：普通采用数理记录学办法，即测量大量阴性样本，测量成果呈正态分布，取95%或99%为置信区，取置信区上线为CO值。S/CO值或P/N值S/CO值：即样本值和界值比值，相称于一种半定量判断。在ELISA检查中，S/C

12、O值判断办法比将样本值和CO值直接比较更具科学性，在不同厂家试剂对比实验时往往用S/CO值而不是OD值。做长期动态观测时（例如做质控图），用绝对OD值做质控图不能精确反映实验环境给实验带来影响，而S/CO值则能尽量减小这种影响。P/N值：有两种说法，一种是标本值和阴性对照比值，是初期采用定性判断办法；另一种是患者测量值（阳性值）和正常人测量值（阴性值）比值。第二个个概念比较有用，它反映是试剂阴阳反差，即有用信号和背景信号区别能力，一定限度上体现了试剂敏捷度高低。校准品/原则品原则品：1、国际原则品：由WHO或相应组织标定，用必定、公认、精确物理或化学办法测定定值材料。如FDA原则品。2、国际生

13、物学活性原则品：依照生物学反映由WHO或相应组织标定国际活性单位材料。3、参照原则血清：国标化组织依照国际原则化生产法定材料。可用于鉴定仪器和鉴定办法精确性。如HBsAg国标血清盘。校准品： 使测量值具备可比性对照物质。对于测量血清标本检查手段来说，最佳校准品应当是用决定性办法定值新鲜混合血清。校准品具备系统专一性，不同系统校准品不能混用（例如不同厂家或者不同批次“原则品”不能替代使用）。咱们定量产品中普通所说原则品严格以上来说应当叫校准品，校准品往上溯源才是原则品。 ISO17511对控制品有较为详细阐明。 质控品/内控品质控品（control）：是已有靶值对照物质，在每次常规检查中加入一份

14、或数份，通过所得成果来理解本次检查状况。质控品检查成果如能控制其误差在一定范畴内，就阐明该检查没有发生不容许误差。如果浮现超过容许误差范畴异常成果，提示该检查不合格，应寻找因素，纠正后，重检待测标本。IVD行业中，普通使用质控品有卫生部临床检查中心（NCCL）提供定值质控品。在临床实验室中，经常使用各省疾控中心（CDC）发放定值质控品。各临床实验室每年还在第三方（普通由各省有关领导部门担任）组织下进行室间质评，以评价实验室总体检查水平。内控品：由实验室参照权威机构原则品或质控品自己标定对照物质，用于控制本实验室实验误差。质控品和内控品都要保证其溯源性！成品成品：通俗来说就是符合客户规定和满足法

15、律法规规定，可以直接交货或售卖产品。 例如试组装完毕、检查合格，贴上合格签试剂盒。对于国家批批检产品，必要还要有国家有关检查机构出具合格检查报告，并通过有关机构做出合格标示试剂盒才干算成品试剂盒。成品与半成品是公司内对生产流程分类，可是对外，就没有什么成品和半成品之分了，如果客户要买你“半成品”，那么“半成品”也就变成你们成品了，如果客户不买你“成品”，那么你“成品”则连半成品也不是！ 因此咱们一定要把东西卖出去。半成品/中间品半成品：通俗来说，品质规定已达到客户规定，但还需要通过一道或几道后序加工程序才干成为成品产品，普通后序加工程序指是组装。例如：检查合格包被板，分装并检查合格酶结合物和原

16、则品等。 中间品：半成品生产过程中所处合格形态。例如：包被后检查合格包被板，分装前检查合格酶结合物和原则品。无论是成品、半成品还是中间品，必要强调检查合格概念！质量检查质量检查：对产品一种或各种质量特性进行观测、测量、实验，并将成果和规定质量规定进行比较，以拟定每项质量特性合格状况技术性检查活动。质量检查职能：鉴别、把关、防止、报告、监督。质量检查环节(1)检查准备。熟悉规定规定，选取检查办法，制定检查规范。在检查准备阶段，必要时要对检查人员进行有关知识和技能培训和考核，确认能否适应检查工作需要。(2)测量或实验。按已拟定检查办法和方案，对产品质量特性进行定量或定性观测、测量、实验，得到需要量

17、值和成果。测量和实验先后，检查人员要确认检查仪器设备和被检物品试样状态正常，保证测量和实验数据对的、有效。(3)记录。对测量条件、测量得到量值和观测得到技术状态用规范化格式和规定予以记载或描述，作为客观质量证据保存下来。质量检查记录是证明产品质量证据，因而数据要客观、真实，笔迹要清晰、整洁，不能随意涂改，需要更改要按规定程序和规定办理。质量检查记录不但要记录检查数据，还要记录检查日期、班次，由检查人员签名，便于质量追溯，明确质量责任。(4)比较和鉴定。由专职人员将检查成果与规定规定进行对照比较，拟定每一项质量特性与否符合规定规定，从而鉴定被检查产品与否合格。 质量控制/质量保证质量控制（Qua

18、ility Control，Q.C）：质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持原则化现状一种管理过程。这一过程是通过一种反馈环路进行。1）拟定控制对象；2）规定控制对象原则（预期值）；3）制定或选取控制办法和手段；3）测量实际数据；4）比较或较对实际数据与预期值之间差别，并阐明产生这一差别因素。超过预定误差范畴，报警系发出信号，反馈通道中断。5）采用行动，解决差别。恢复原状（原原则状态）手段发挥作用。质量保证（ quality assurance ，Q.A ）：提供质量规定会得到满足信任一系列活动 。 质量保证核心词是“提供信任”，提供信任对象对内可以是管理者，对外可以是顾客；“提供信任

19、”办法是需要提供可以证明质量规定会得到满足证据。 对内或对外提供产品质量保证文献、过程监控记录、质量手册或认证证书，都可以作为“提供信任”办法。 基质效应基质效应（matrix effect）：基质指是样品中被分析物以外组分，基质经常对分析物分析过程有明显干扰，并影响分析成果精确性，这些影响和干扰被称为基质效应。 基质效应体当前两个方面：1.标本中除分析物以外其她成分对分析物测定值影响。2.基质对分析办法精确测定分析物能力干扰。广义说来，基质效应也应涉及已知干扰物（如Chol测定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但当前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性物质或因素（如粘度、pH等）

20、影响。 基质偏差（matrix bias） 基质效应所致分析成果偏差称为基质偏差。 用作校准物质或质控物通过解决混合血清，由于血清基质理化性质在解决过程中变化，在常规测定上往往浮现基质偏差。 基质偏差浮现也与分析系统（涉及办法、试剂及所用仪器设备）关于，因此有人将基质效应定性为办法、材料与基质特异性反映。 国外已有不少文献指出某些在制备过程中通过加工或添加某些成分(如制备LDL)参照血清，会在某些分析系统中浮现基质效应(matrix effect)，而使标本(新鲜血清)分析成果浮现明显偏差。用新鲜血清为参照材料是最抱负，但显然是不现实，因此对参照材料研制又提出了新难题。Naito等（1993年

21、）提出过减少基质效应研究方向，至今仍有参照价值：改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清。 改进仪器设计及试剂构成。 选取办法及办法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物（校准物、室间质评样品与质控物）基质确切性质不敏感。HOOK效应高值钩镰效应（HD-HOOK） 在二位点夹心ELISA中，其剂量反映曲线高剂（HIGH DOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），MILES（1974）依照此现象写实性地称之为“HD-HOOK”效应。 在一步法和两步法中均有HOOK效应一步夹心法HOOK效应事实上是一种“浓度效应”，待测物中抗原数量

22、过高所致次要因素：标记抗体与被捕获抗原交叉重叠结合而导致抗原变构只要靶抗原正常值与病理值之差不不大于3个数量级，均应警示由于 严重“HD-HOOK效应”而发生假阴性，假低值两步夹心法HOOK效应仅发现于少数具备多重抗原决定簇大分子蛋白质抗原如：SF、AFP、PSA、HCG等）。随着杂交瘤单抗问世，Femando等设计了一种堪称当代典型实验模式， 使这一课题研究获得了突破性进展。所选用实验办法是二步IRMA,靶抗原是一种已知其WM为22kDa、仅有 二个不同抗原簇人生长因子(hGH)。一种单抗用于包被,另一 个作125I标记 作二抗。用此实验系统,测定单体hGH抗原时,没有发现“HD-HOOK效

23、应”问 题奇怪是,用同样实验系统,测定非共价结合二聚体(D)-hGH则呈现了 “HD-HOOK效应”。 据此实验成果,推导出一种新理论:即标记二抗介导被捕获抗原分子发生分子变构(Confromational change),使之形成标记二抗与变构抗原分子复合物，从固相一抗上解离，最后产生反映信号减低“HD-HOOK”效应。这种“抗原分子变构理论”核心是抗原“质”问题。理论根据i.一方面,大分子蛋白质抗原可变构性是决定性内因。其中构象性决定簇是几条肽链(非持续性)提供氨基酸组合而成,比线性(持续性)决定簇稳定性差,易发生变构(见图2)。 另一方面,蛋白质分子内非共价结合键,也是发生分子变构内在因

24、素。从既有资料看,仅报道铁蛋白、AFP、PSA及HCG等,具备多重决定蔟大分子抗原,在二步法中产生“HD-HOOK效应”。小分子抗原则否。表白抗原“质”特性是核心性因素。ii.另一方面,抗体分子是介导抗原分子变构重要外因。已知Igs分子在遇到相应抗原时,为了执行其固有(本质性)生物学功能,其分子Fab臂可环绕铰链区,作变角折弯(100)、锥形转动以及最N末端可变区,依托Fab恒定区作微小“球穴”摆动(见3)。 当其与被捕获抗原分子之间,发生交差重叠结合之后,由于“立体效应(steric effect)”,加之标记二抗亲和力不不大于一抗等辅助因素,是可以迫使已被捕获抗原分子从一抗上解离洗涤出去。

25、很也许与下列因素关于：i.包被-抗体亲和力低ii.洗涤不适当iii.酶标抗体局限性iv.过度孵育v.其她非特异性反映窗口期窗口期（window period）：病毒感染后病毒出当前血液中直到可以检出足够多相应病毒标志物（抗原或抗体）前时期。在这段时间内，血清中无法检测出相应抗原抗体标志物。各种病毒窗口期是不同样，普通所称窗口期指是检测到病毒抗体时间，但抗原以及核酸检测同样存在窗口期，但时间大大缩短。H B V、H C V、H I V窗口期时间分别为56、70和22天，P24抗原窗口期平均为15天，而应用核酸技术，可分别将H B V、H C V、H I V窗口期缩短为41、12、11天。由于检测

26、技术局限，某种检测成果为阴性并不意味着就没有感染，因而定期复查是非常重要。相信随着检测病毒标志物不同，检测技术提高，可大大缩短窗口期时间。 心理窗口期尚有一种很重要“心理窗口期”。由于医学上还没有绝对明确窗口期，有个别朋友甚至2年后来还在检查，不懂得她们还要在恐惊中多久才干找到回家路！因此，每个人都应当在深思熟虑后为自己拟定一种明确心理窗口期，也就是说，过了这个期限还是阴性就可以彻底放心，之后任务就是如何恢复到此前生理和心理状态，回到自己此前生活中去。 潜伏期潜伏期（incubation period）是指病原体侵入机体到最初浮现症状和体征之间这段时期。各种疾病潜伏期长短不一，短者数小时，长者

27、可达数月或数年。如禽类禽流感潜伏期从几小时到数天，最长可达21天。人类患上禽流感后，潜伏期普通为7天以内。非典型性肺炎潜伏期普通在410天，临床报告最短病例为1天，最长有20天，甚至有极个别病例达到28天。普通以为潜伏期长短与感染病毒种类或者型别、病毒致病性、病毒数量、感染途径、被感染机体免疫力以及其她非生理因素等关于。例如艾滋病病毒，经输血感染剂量普通较大，因此潜伏期相对较短，而性接触感染艾滋病病毒剂量较小，因而潜伏期相对较长。HBV感染后潜伏期普通为20天至6个月，也有报道28160天，平均7080天；HCV感染后临床体现普通较轻，常为亚临床型，但输血后感染潜伏期普通为20天至6个月，也有

28、资料报道226周，平均8周；HIV感染后1到2个月内也许浮现急性症状和体征，随后进入较长无症状期，持续6，平均8，大量输血可缩短至15年。梅毒潜伏期普通为24周灰区灰区：把定量分析正常值范畴引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以拟定其阴阳性，如仍落在灰区范畴内则报告+（阳性）。 灰区概念对血站系统献血员筛查尤为重要。 灰区设立有二种： 1）C.O（1CV）， CV为该试剂批内CV (普通在15-20%间）； 2）C.O2s，s为实验室做室内质控ROC（受试者工作特性曲线）s。酶免疫吸附实验（EIA）性能指标（定性产品）敏捷度敏捷度（sensiti

29、vity）：某一检测系统检出极低被检物质能力。涉及两层意思：1.检出被检物质最低量能力；2.对大量样品中阳性检出能力。检出被检物质最低量能力：惯用检出最低量被检物含量（即分析敏捷度或最低检出限）来表达。例如0.1ng，0.1mIu，0.1NCU等，意思是在某一检测办法下，检测系统能将有用信号和背景信号区别开来时所相应被检物浓度。但这种区别在当前条件下与否在临床上有确切意义并不能所有必定。评价方式：用原则被检物持续稀释，直到能区别有用信号和背景信号最大稀释倍数。也叫滴度。在ELISA实验里，惯用强阳性混合血清系列稀释，同步用市场反映较好试剂盒同步进行标定，选取这些试剂盒都能检出最大稀释倍数血清作

30、为敏捷度血清，普通会有成系列几种血清。在标定系列敏捷度血清时候要非常注意一种问题：要注意基质效应在不同系统（涉及不同厂家试剂盒、工艺、不同原材料）上对敏捷度血清测量值影响，在变化系统时，必要重新标定敏捷度血清。2.为试剂对人群或大量样品中阳性检出能力（假阴性越少越好），取决于包被物全面性和亲和力。 选取原材料一定要选取亲和力高原料。有些厂家为追求试剂对大多数阳性标本敏捷度，只选取最强一种或少数几种优势表位，而牺牲了在患者人群中较少浮现亚型或者原材料片段，这种做法是非常危险，是对目的人群不负责任。特异性特异性：指试剂对的检定不存在被检物质能力（无假阳性），取决于包被抗原（体）及标记抗原（体）纯度

31、及特异性，生产工艺对试剂特异性也有较大影响。也许影响试剂盒特异性某些因素1.操作因素：交叉污染、洗涤不彻底。2.试剂盒工艺：试剂盒在生产时候被污染了。3.交叉：相似于被检物物质交叉反映，重要由生物原材料不纯导致。4.标本因素：高度溶血、脂血标本。5.血清标本解决：抗凝剂、重复冻融。6.其他存在于血清中物质对检测成果影响，如胆红素、胆固醇、甘油三酯等。精确度精确度（accuracy） ：是指测定成果与真值（或靶值）接近限度。精确度不能以数字表达，往往用不精确度来衡量。在ELISA实验中，真值往往指是用决定性办法（即“金原则”）测量所得到成果。精确度是敏捷度和特异性综合指标，是试剂盒质量最重要指标之一。精密性精密性（Precision ）：是指对同同样本重复测定期，每次测定成果与平均值接近限度，即重复测定值之间符合限度。惯用变异系数来表达。CV=SD/X100%其中，X为检测均值，SD为持续测定原则差。变异系数分为批内变异和批间变异。ELISA试剂普通指其批内变异系数（CV），其值应不大于15%；定量试剂应同步考察线性范畴。 影响检测精密性因素1.操作水平：要对操作者进行规范化操作培训。2.环境影响：要控制实验环境