五种抗糖尿病中药提取物的PPARs激动活性研究本科生毕业论文.docx

1、五种抗糖尿病中药提取物的PPARs激动活性研究本科生毕业论文重庆大学本科学生毕业设计（论文）五种抗糖尿病中药提取物的PPARs激动活性研究Graduation Design (Thesis) of Chongqing UniversityActivation on PPARs of extracts from five anti-diabetic traditional Chinese medicinesUndergraduate: Gao DieSupervisor: Prof.Xia ZhiningMajor: Pharmacy College of Chemistry and Chemi

2、cal EngineeringChongqing University June 2012学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位论文

3、的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名： 日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日摘 要本文通过研究具有抗糖尿病或利尿生津作用的中药金线莲、熟地黄、生地黄、地骨皮以及芦根的提取物对PPARs的两个亚型PPAR和PPAR的激动作用，探讨其抗糖尿病的作用是否可能是通过PPARs介导的。本文首先对五种中药进行了提取，得到其石油醚、乙酸乙酯、70%醇提、水提以及水提醇沉五个部分，然后配制不同浓度的各提取物，以0.1% DMSO及水作为对照组，每组作3个复孔的平行对照，在96孔细胞培养板中，针对实验所用的H

4、ela细胞进行了提取物细胞毒性实验，确定了五种中药各个提取物进行PPARs研究实验的浓度范围,接着采用Hela细胞报告基因筛选模型，对中药的提取物进行PPARs的激动实验，将报告质粒和PPAR质粒（或PPAR质粒）共转染Hela细胞，得到大量表达PPAR（或PPAR）的Hela细胞，用不同浓度的提取物作用转染细胞，并分别用0.1% DMSO及水作为阴性对照组，以0.5 g/mL的非诺贝特作PPAR组的阳性对照，以0.5 g/mL罗格列酮作PPAR组的阳性对照。最终进行荧光素酶活性检测，以药物作用组与阴性对照组的比值为参考标准，筛选出对PPAR（或PPAR）有激动作用的提取物 对于PPAR有激动

5、作用的包括金线莲（石油醚部分：200g/mL）、熟地黄（石油醚部分：100g/mL）及芦根（乙酸乙酯部分：200g/mL），激活倍数分别为4.93倍、4.93倍及3.33倍。五种中药对于PPAR均有一定激动作用，激活倍数分别为3.69倍、2.9倍、2.95倍、6.27倍、7.48倍（金线莲、熟地黄、生地黄、地骨皮、芦根）；其中以芦根的乙酸乙酯部分的激动作用最为显著，激活倍数达7.48倍。关键词：糖尿病，中药提取物，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)，天然激动剂ABSTRACTIn the present study, the activities of the crude extract

6、s of traditional Chinese medicines (TCMs) on PPAR and PPAR were investigated. The tested TCMs include Ancecotochilus roxburghii, Radix rehmanniae praeparata, Rehmannia glutinosa, Lycii cortex and Rhizomes phragmitis, which have anti- diabetes or diursis nourish effects. Furthermore, the anti-diabete

7、s mechanism of the tested TCMs, which may act on PPARs, is also discussed. Firstly, the five extracts of petroleum ether, ethyl acetate, 70% ethanol, water and water extraction and alcohol precipitation for each TCM were prepared. Then using a 96-well plate, the MTT toxic test was done on different

8、concentrations, while 0.1% DMSO and water were used as control groups. Each sample repeat for three-cells and the range of preferable administration concentrations for the TCM extracts on the PPARs screening model were chosen. At last, transfecting the report plasmid and the report plasmid with PPAR

9、 (or PPAR) expressed plasmid (screening cell model of PPAR or PPAR agonist) into Hela cells ( known as not expressed PPAR), in order to get a mass of Hela cells, which expressed PPAR plasmid (or PPAR). The experiment was done with different concentrations of the TCM extracts, using 0.5 g/mL rosiglit

10、azone and nuobei fidels as the positive drugs for PPAR and PPAR, respectively. And 0.1% DMSO and water were used as the negative control groups. Luciferase activity in the report plasmids was measured to evaluate the activation level. By compared with the result of negative control groups, the PPAR

11、of PPAR active extracts of the tested TCMs can be found.In conclusion, Ancecotochilus roxburghiis petroleum ether extract (200 g/mL), Radix rehmanniae praeparatas petroleum ether extract (100 g/mL), Rhizoma phragmitiss ethyl acetate extract (200 g/mL) can activate PPAR with the activating multiple o

12、f 4.93 times, 4.93 times and 3.33 times, respectively. Furthermore, all the tested TCMs can activate PPAR with the activating multiple of 3.69 times, 2.9 times, 2.95 times, 6.27 times and 7.48 times for Ancecotochilus roxburghii, Radix rehmanniae praeparata, Rehmannia glutinosa, Lycii cortex and Rhi

13、zomes phragmitis extracts, repesctively. Rhizoma phragmitiss ethyl acetate extract had the strongest effect with activating multiple of 7.48 times.Key word: Diabetes; TCMs; Peroxisome proliferation activation receptors (PPARs); Natural agonists目 录中文摘要 IABSTRACT II目 录 IV1 绪论 11.1五种中药的抗糖尿病作用研究概况 11.1.

14、1金线莲的抗糖尿病作用研究概况 11.1.2熟地黄及生地黄的抗糖尿病作用研究概况 21.1.3地骨皮的抗糖尿病作用研究概况 21.1.4芦根的抗糖尿病作用研究概况 21.2 PPARs对糖尿病等疾病的作用概况 31.3 PPAR及PPAR的功能简介 31.3.1 PPAR的功能 31.3.2 PPAR的功能 31.4 关于PPAR及PPAR激动剂的研究现状 41.4.1PPAR的激动剂研究现状 41.4.2 PPAR的激动剂研究现状 51.5 小结 62 实验部分 72.1 实验材料 72.2 主要仪器 72.3 试剂 82.4 中药不同极性组分的提取 92.5 中药提取物的MTT细胞毒性实验

15、 122.5.1 含胎牛血清双抗的培养基（DMEM）的配制 122.5.2 MTT细胞毒性实验具体操作步骤 122.6 中药提取物激动PPAR及PPAR的研究内容 132.6.1 基本实验 132.6.2 中药提取物对PPAR与PPAR 的激动作用实验 163 结果及分析讨论 183.1 MTT细胞毒性实验结果及分析讨论 183.2 中药提取物对PPARs的激动作用实验结果及分析讨论 203.2.1 阳性药激活倍数 203.2.2 中药提取物对PPAR的激动作用 213.2.3中药提取物对PPAR的激动作用 263.2.4 总结 30结 论 31参考文献 32致 谢 361 绪论糖尿病是一种常

16、见病，现在随着社会的发展及人口增加等原因，发病的人数越来越多了。发达国家糖尿病的患病率最高已达10%，我国的糖尿病的患病率也已达3%。根据病因学的不同，糖尿病分为三类，即I、II及妊娠型。其中，型糖尿病是一种代谢上的疾病,其主要的特征是高血脂血糖、胰岛素耐受。病人一般经历以下的病理过程：发生肥胖的症状细胞PPARs进行调节胰岛素产生耐受高血胰岛素的产生胰岛B细胞受损及受压胰岛素的释放量减少最终导致发生高血糖。整个过程的核心环节是过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators activated receptors，PPARs）的失活引起的胰岛素耐受1。本论文主要从

17、II型糖尿病方向展开，从传统的有抗糖尿病作用或利尿生津的中药出发，通过抗糖尿病中药与PPARs的关系出发进行研究和探讨。1.1五种中药的抗糖尿病作用研究概况金线莲、熟地黄、生地黄、地骨皮及芦根是传统的民间中药，据民间研究，五种中药均具有抗糖尿病或利尿生津作用，它们参与了许多与降血糖有关的过程，如参与脂肪代谢，免疫调节，改变胰岛细胞状态等过程，现在就五种中药的抗糖尿病作用进行简要概括。1.1.1金线莲的抗糖尿病作用研究概况金线莲(Anoectochilus roxburghii) 是兰科开唇兰属的植物，是一种多年生珍贵稀有的中草药，在我国主产于福建，广西.又名金蚕、金线虎头蕉、金石松、金线兰、金

18、线入骨消等 2全草药用,具有清热凉血、强心、利尿生津、降血压等功效 3。据有关文献报道金线莲对糖尿病有一定的治疗作用4。陈卓等通过研究STZ及四氧嘧啶所致的糖尿病小鼠模型，发现金线莲的水提物具有降血糖作用5。他们还对金线莲的各种提取物进行了降血糖作用的研究，发现金线莲的大极性成分特别是水溶性的物质为降血糖的主要有效部分。初步估计为其多糖类物质在起作用 6。王航探讨了其降糖的有效成分及其作用机制，发现金线莲的有效成分可以调节脂肪代谢，降低模型小鼠的TG、TC等，最终达到降低血糖的效果，此作用可能与其保肝作用有关7。研究还发现，Kinsenoside，野生金线莲中的丁酸苷类化合物，其对PTP1B有

19、一定的抑制活性，其抑制的能力明显强于其对照及化合物methyl4-D- glucopyranosyl- butanoate，说明其可以作为PTP1B抑制剂，或先导物用于治疗型糖尿病和肥胖症等疾病8。以上研究说明金线莲有抗糖尿病活性，但是其作用机制还有待研究。1.1.2熟地黄及生地黄的抗糖尿病作用研究概况熟地黄是玄参科植物地黄的块茎，相对生地黄，其炮制方法不同，一般为酒炖法或蒸法加工而成9。熟地黄在临床上应用较为广泛，用于心悸怔忡、血虚萎黄、崩漏下血、肝肾阴虚、腰膝酸软、骨蒸潮热、眩晕、利尿生津等10。据报道，熟地黄对链脲佐菌素（STZ）致糖尿病小鼠具有降血糖及血脂作用11。生地黄是地黄( re

20、hmannia glutinosalibosch) 的干燥的块根。有养阴生津，凉血清热等功效。生地黄传统上就用于治疗糖尿病，对目前中医治疗糖尿病处方中使用药物的统计也表明生地黄的使用频率居第三位1213。现在用于治疗糖尿病的中成药的组成组分中许多都含有生地黄，如其常与知母，黄芪连用用于治疗糖尿病，常用的降糖乐中也含有生地黄 14。有研究表明生地黄对糖尿病大鼠肾病病变有一定的保护作用，能有效的降低血胰岛素抵抗的作用，对resistin及脂肪代谢有改善作用，还具有改善胰岛细胞的功能，减低肝葡萄糖-6-磷酸酶活性等作用15。1.1.3地骨皮的抗糖尿病作用研究概况地骨皮为枸杞的干燥的根皮，类属于茄科植

21、物 16。药理研究表明，地骨皮对糖尿病模型小鼠的血糖量有一定的降低作用，还能降低糖尿病小鼠的葡萄糖的含量和肾上腺素性高血糖的值，其作用的效果与苯乙双胍降糖作用效果相似 ，并且剂量越高或时间越长其作用的效果越明显1718。通过研究表明，地骨皮促进胰岛细胞分泌胰岛素的作用效果超过黄芪的作用效果，还可以让糖尿病大鼠的血清中的肝糖元含量和胰岛素含量增加19。魏智清等通过研究发现地骨皮的水煎剂具有降低血糖的作用效果，且牛磺酸为其降低血糖的一种有效成分20。1.1.4芦根的抗糖尿病作用研究概况芦根(Rhizoma Phragmitis)类属于芦苇科植物，是芦苇的根茎，又名苇根、芦茹根等，具有清除体内毒素、

22、调节免疫，调节机体代谢、维持体液的平衡、利尿生津等作用21。据研究表明，芦根对链脲佐菌素诱导制备的糖尿病小鼠的肝脏及骨髓组织中Cu、Se、Ca、Zn、Mg元素含量有影响，芦根的醇提物可降低糖尿病小鼠肝组织中Cu 、Se、Ca、Mg的含量，有文献表明糖尿病小鼠微量元素代谢紊乱，芦根的醇提物对其微量元素代谢具有一定的改善作用22。张默函等通过研究发现，糖尿病小鼠的肝脏线粒体出现了氧化应激的变化，芦根的乙醇提取物对这个变化具有一定的改善作用23。1.2 PPARs对糖尿病等疾病的作用概况过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators activated receptor

23、s，PPARs）是核受体家族的配体活化转录因子的组员24。研究表明PPARs参与了包括胰岛素敏感、调节血脂激活基因转录、炎症反应、脂质代谢、细胞增殖等重要生物调节过程及生化反应25，它和人类的许多的慢性疾病有着密切的关系，包括肥胖症、动脉粥样硬化、糖尿病、心血管疾病等代谢上的疾病和癌症26。所以，PPARs以其作为新药开发的靶点分子而备受关注，特别是对于糖脂代谢方面的疾病，现在已针对II型糖尿病开发了各种的PPARs的激动剂。 PPAR、PPAR、PPAR为PPARs的三种亚型，在这三种亚型中激活PPAR的能够调节脂质代谢及刺激脂肪酸进行表达；PPAR则主要在脂肪细胞及免疫细胞中进行表达，不但

24、与胰岛素抵抗，机体免疫及脂肪细胞的分化有关，还参与了许多细胞过程的功能调控，如体内的脂质平衡与否，有炎症发生与否等均与其有关系；现在研究还发现，PPAR也可以作为调节血脂的因子27。现在就PPAR、PPAR进行了讨论。1.3 PPAR及PPAR的功能简介1.3.1 PPAR的功能PPAR是一个研究的比较多的亚型。它能够让多种细胞的增殖和分化过程得到调节。现在研究表明，对于脂肪细胞，PPAR的激活能够促进或抑制其进行分化，比如能够促进或抑制3T3-L1细胞的分化，这与其作用后得到的效果有关，如抑制肥胖或促进糖代谢28；可以通过下调与甘油三酯的合成和甘油三磷酸的生成所关联的酶的表达，从而降低FFA

25、从脂肪细胞中流出来，进而使血脂浓度得到降低29；还可以让GLUT-4的表达得到促进，进而促进脂肪组织摄取葡萄糖，同时降低肝脏糖异生使肝脏、骨骼肌及脂肪细胞对葡萄糖的摄取量增加，最终使胰岛素的抵抗得到改善30；其还可以改善TNF-因子的状态，进而导致胰岛素发生抵抗31；还有治疗高血压、减少炎症的发生、对抗动脉粥样硬化、对癌症进行治疗等作用3233。1.3.2 PPAR的功能PPAR能够刺激脂肪酸进行氧化及导致胆固醇进行逆向的运输。现代研究表明，PPAR主要的作用是能够改变血脂的分布，可以调节脂肪细胞进行分化、脂肪的贮存及葡萄糖代谢过程。而且它的激活可以负调节促炎症反应的基因进行表达，对葡萄糖代谢

26、及脂蛋白代谢进行调节，能减轻体重等34。1.4 关于PPAR及PPAR激动剂的研究现状1.4.1PPAR的激动剂研究现状早期，黄莺等在总结了市场上的PPAR激动剂，有噻唑烷二酮类（如吡格列酮，罗格列酮），非噻唑烷二酮类（如基于酪氨酸的苯丙酸衍生物，苯乙酸衍生物等）27。这些药物均有良好的激动PPAR的活性，同时也存在许多副作用，如导致患者发生水肿，导致其体重增加，还增加了患者罹患心肌梗塞的风险35，但是它们仍可以为以后寻找PPAR激动剂提供对照，也增加了探寻新的激动剂的意义。现在关于PPAR激动剂的研究正在不断发展，特别是关于天然药物的PPAR激动作用。研究表明：大黄中的存在一种活性物质-大黄

27、素，它是PPAR的一种天然的激动剂，其能够明显的降低直至核心区同脂质斑块胶原蛋白间的含量比，也能够显著的抑制MMP-9和GM-CSF的表达，并且能够诱导增加其斑块中PPAR-表达的量，对用脂肪喂养的缺陷了载脂蛋白的实验小鼠中存在的动脉粥样硬化斑块有一定的稳定作用，能够防止其恶化36。通过研究表明，通过采用表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）这门技术，证实大黄素是PPAR的具有高亲和力的激动剂37。在其早期的研究中发现，在大于50 M/L的浓度时,大黄素会降低胰岛素所刺激的葡萄糖的吸收,而在小于50/L浓度时，大黄素能够明显的促进3T3-L1前脂肪细胞的分

28、化，促进其GLUT1和GLUT4的 mRNA的表达、促进葡萄糖的吸收及成纤维细胞的增殖等，而此过程的一些功能又是与PPAR有一定的关系的，如GLUT1和GLUT4的mRNA的表达38。张翼鸿等在他们的研究中探讨了白藜芦醇如何对糖尿病模型大鼠进行作用以使其在脂肪代谢中有作用，通过western blot等技术，检测了大鼠脂肪组织中的各项指标，如PPAR、TG、ISI及葡萄糖转运蛋白4的表达水平，知道了白藜芦醇可以激活PI3K途径，上调了模型鼠的脂肪组织中的GLUT-4蛋白及PPAR-的表达，有改善ISI及降低血糖的作用39。姜黄属于姜科姜黄属，是一种多年生的草本植物，其中含有多种化学成分，具有通

29、经止痛、破血行气等功能，传统中医用于风湿疼痛、胸胁刺痛、闭经，其具有良好的药用价值和经济开发前景40。姜黄素是姜黄属植物中多酚性成分，对氧化应激有一定作用，还在抗肿瘤、降低血脂等药理方面有一定的效果41。刘敬等构建了过氧化小体增殖剂激活型受体（PPAR）激动剂筛选的细胞模型，证实了姜黄素为PPAR的天然的激动剂 42。姜黄素还能通过上调PPAR，抑制炎性细胞因子及TNF -的表达和释放，还对细胞的凋亡及败血症的治疗有作用4344。中药丹参中存在一种二萜类化合物丹参酮IIA，其为脂溶性的。丹参酮IIA传统上用于治疗心血管疾病、降低血脂、减轻体重45。有研究表明其治疗肥胖是通过拮抗PPAR来进行的

30、，通过实验发现其可以抑制3T3-L1前细胞的分化，用丹参酮IIA进行治疗能够降低LDL与HDL的比值，减少脂肪量，改善糖耐量，并对糖尿病患者的糖代谢问题有影响46。据研究表明，番石榴叶具有降低血糖的作用47，刘美凤等通过Discovery Studio 2. 1软件，以其三萜皂苷（如番石榴香豆酸）、黄酮（如无色矢车菊素）和鞣质类化合物（如糅花酸）作为配体，与PPAR进行对接，发现黄酮和鞣质类化合物与PPAR 作用活性较高。可以说明番石榴叶中的有些有效成分具有激动PPAR的作用，这可能是其降糖的有效途径之一48。柚皮苷是柑橘中的一种有效成分，实验证明其对心肌的PPAR有一定的调节作用，通过建立糖

31、尿病心肌病的大鼠模型，发现柚皮苷可以通过调节PPAR来减缓大鼠的心肌结构功能的损伤49。 据研究表明，对于糖尿病，黄芪多糖对其免疫调节有一定的作用。对糖尿病小鼠模型中的小鼠给予黄芪多糖的治疗后，小鼠脾脏中的血糖水平及Th1 /Th2 细胞因子比得到下调，血清中胰岛素的浓度及PPAR 的基因表达上调，胰岛细胞数量有所增加，其凋亡的百分率得到降低50。而且从黄芪中分离得到的芒柄花黄素，能够促进3T3-L1前脂肪细胞进行分化，还有激动PPAR 的驱动受体的基因的作用51。在日本，Saito等发现水稻中的一种抗毒素，樱花素，其为一种黄酮类多酚物质，能促进3T3-L1前细胞的分化，并能让分化的3T3-L1细胞中的葡糖糖的吸收的能力有所增强，能维持机体葡萄糖水平，主要是能够激动PPAR，以上的作用可能与激动PPAR有关系52。此外，还有一些复方药物对PPAR也有一定的激活作用。如用参芪复方（由人参、黄芪、生地黄和丹参等组成的）给早期糖尿病模型大鼠口服，32天后检查其对白脂肪受体的PPAR的影响，结果显示参芪复方高剂量及低剂量组都能能够增加其下游的靶基因的脂联素的mRNA的表达及明显上调及活化PPAR53。补阳