精氨酸激酶的表达及纯化解析.docx

1、精氨酸激酶的表达及纯化解析精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 报告题目精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名班级学号0904/2009114020402指导教师完成时间2012年9月生物学实验教学中心目 录引言 41实验材料、试剂、仪器 72 实验方法 92.1配制LB液体培养基 92.2 活化菌种 92.3 扩大培养 92.4 IPTG诱导AK的表达 92.5蛋白质提取 92.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 102.7 上样和洗脱 102.8 SDS-PAGE电泳鉴定纯化程度 103 结果与分析 113.1层析谱图 113.2 SDS-PAGE电泳带型分析 12总结 13参考

2、文献 14精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 指导老师：摘 要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 g/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养。当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM的异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。通过CM-Cellulose阳离子交换层析，SephacrylTM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的精氨酸激酶。 关键词：精氨酸激

3、酶 表达与纯化Expression and Purification of Arginine KinaseAbstract： Argininekinase（ATP：L-arginine phosphotransferaseEC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate. E. coli Rosetta which contains recombinant AK gene was grown in LB medium containing kanamycin (Final conc

4、entration: 25 g/mL). When absorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropyl -D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the incubation was continued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, then the crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified by fol

5、lowing three methods in turn: CM-Cellulose positive ion exchange chromatography, SephacrylTM-100gel filtrate chromatography, and Q-Sepharose anion exchange chromatography. A purified AK was found to be homogenous by SDS poly -acrylaminde gel electrophoresis. Key words: arginine kinase expression and

6、 purification 精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 引言无脊椎动物的精氨酸激酶（Arginine kinase, AK）（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）类似于脊椎动物中的肌酸激酶（creatine kinase ，CK）（ATP:N-肌酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）， 是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用 。AK在体内催化反应方程式如下：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究

7、过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有

8、四个亚基，分子量为150-160KD。某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK是由一个小的螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结构域组成的，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域相似，8股串起来的反平行折叠被7个螺旋所包绕2。过渡态类似物的结合部位不在两个结构域之间，而是在C端结构域的内部3。如下图所示4：图1. 结合有过渡态类似物的AK的晶体结构我们已经克隆有精氨酸激酶基因的菌株，宿主菌含表达质粒pET28a, pET28a含：强启动子序列，两个lac操纵序列；精氨酸激酶基因，核糖体结合位点，多克隆位点，复制起点。在工程菌株中，导入抗Kana青霉素的pET28a质粒，菌株中原有质粒产生

9、阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与pET28a的LacO操纵基因结合，阻止外源基因的表达。当加入IPTG诱导时，IPTG与阻遏蛋白结合，解除了阻遏蛋白与pET28a操纵基因结合的抑制作用，使pET28a上面的外源基因能够顺利表达5。IPTG是一种乳糖类似物，我们的主要目的是诱导表达并纯化精氨酸激酶，为后续研究其在蛋白质折叠和分子伴侣中的功能做准备亲和层析法 依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋

10、白的抗体。 当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。电泳电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polya

11、crylamide gel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。本实验我们做了以下工作：用含卡那霉素的LB液体培养基活化并扩大培养菌种，利用IPTG诱导精氨酸激酶（AK）的表达，经离心、超声波破壁获得AK粗提液。粗提液用His-tag Ni 亲和层析纯化，用SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。1实验材料、试剂、仪器1.1 材料 工程菌种：Ecoli工程菌株Rossta2.2 试剂LB培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，Nacl 10 g，溶于950ml水中，用NaOH调节PH至7.0，

12、加蒸馏水，定容总体积至1L，分装后高压蒸汽灭菌。5 Binding Buffer : Tris(20 mM)，Nacl(500 mM)，加Hcl调PH至8.0，加蒸馏水定容至1L。IPTG（1M）：称取2.3831gIPTG，定容到10ml无菌水。12 %的分离胶（5 mL）: 成分体积（mL）水1.6030 %丙烯酰胺2.001.5 M Tris (PH 8.8)1.3010 % SDS0.0510 % 过硫酸铵0.05TEMED0.002浓缩胶 （2 mL）成分体积（mL）水1.4030 %丙烯酰胺0.331.0 M Tris (PH 6.8)0.2510 % SDS0.0210 % 过硫

13、酸铵0.02TEMED0.002样品缓冲液：考马斯亮蓝R-2501.3主要实验仪器 紫外分光光度计U4300（Sweden/GE） YC-1型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司） CXG-1型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司） ORION pH计（美国orion公司） HD-3紫外检测仪（上海沪西分析仪器厂有限公司） TGL-16LA，GL-2M型冷冻离心机(湖南星科仪器有限公司） GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司） 超声破壁仪（上海之信仪器厂有限公司） 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司） 超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司） 低温恒温槽DH-2120（

14、上海嘉鹏科技有限公司） 电泳仪DYY-5（北京市六一仪器厂） 电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司） BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂) SW-CJ-1FD单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司） 3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱 高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）2 实验方法2.1配制LB液体培养基称取NaCl 1 g 、蛋白胨 1 g、酵母提取物 0.5 g ，加入蒸馏水，配制成100 mL的LB液体培养基，放入高压灭菌锅中灭菌。2.2 活化菌种取50 L表达菌种接入6 mL的LB液体培养基（含有卡那青霉素，其工作浓

15、度为50 g/mL）中，于37 摇床振荡培养8-12小时。 2.3 扩大培养向100 mL LB液体培养基中加入100 uL 50 mg/mL卡那霉素(工作浓度为50 ug/mL)，再加入6 mL活化的菌液，于37 摇床中震荡培养23小时。2.4 IPTG诱导AK的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时，加150 l的 IPTG至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。 2.5蛋白质提取（1）将菌液置于离心管4 ，6500 r/m离心10 min；（2）弃上清液，向沉淀中加入蒸馏水，用漩涡混合器重旋混匀；（3）在天平上配平后置于

16、离心管4 ，6500 r/m离心10 min；（4）弃上清，向沉淀中加入1Binding Buffer，重旋；（5）在冰上进行10 min（工作时间为2 s，间隔为3 s）的超声波破壁，一共三次，每两次间间隔5 min；(6) 于4 ，12000 rpm，离心10 min，取上清，得到AK的粗提液。 2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白（1）用2 M盐酸胍10 mL与树脂打散混合洗涤；蒸馏水洗10min。（2）用Stripping Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟；（3）1.5 M盐酸胍洗30分钟，蒸馏水洗30分钟；（4）用1 M NaOH洗1小时；用Binding Bu

17、ffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟；（5）用1.5 M NaCl洗20分钟；用Binding Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟；（6）Ni柱再生：150 mL 0.1 M NiSO4洗蒸馏水洗（穿流液无色）Binding Buffer平衡。 2.7 上样和洗脱（1）插A280滤光片，调A值（0）、T值（100）；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。将粗提液45 mL上柱，流速约为1.6-1.8 mL/min。（2）上样完后，继续用Binding Buffer （pH=8.0）淋洗。待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（20 mM、40 mM、80 mM、

18、100 mM、200 mM）洗脱。在280 nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。 2.8 SDS-PAGE电泳鉴定纯化程度（1）安装双垂直板电泳槽；（2）配12 %的分离胶5 mL，浓缩胶2 mL；（3）制样：取样品30 L与样品缓冲液30 L混合，100 加热5分钟；（4）上样：用微量注射器加样。15孔的样品分别取自未诱导粗提液、诱导粗提液、穿流液、10Mm咪挫洗脱液、250mM咪挫洗脱液;（5）电泳：在凝胶上加60 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm，继续电泳直到染料到达底部;（

19、6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；（7）脱色处理：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。3 结果与分析3.1层析谱图图1微电脑记录仪显示的His-tag Ni亲和层析法纯化AK的谱图分析以上的谱图知：上样之前用1Binding Buffer走基线，使吸光度降为零并稳定15分钟；00:05时开始上样，吸光值基本上是沿直线上升的，直达至峰值，后用Binding Buffer淋洗，吸光值逐渐下降，表明AK粗提液流经穿流柱后有部分蛋白质（杂蛋白）被洗下来；最后，再分别用10 mM、250 mM的咪唑液洗脱，得到两次的峰值，显示目标蛋白AK已经被洗脱下来了，

20、而且250mM的咪唑液洗脱出来的目标蛋白（AK）纯度相对更高。3.2 SDS-PAGE电泳带型分析图2 SDS-PAGE电泳图15号孔分别为：未诱导、诱导粗提液、穿流液、10mM咪挫洗脱液、250mM咪挫洗脱液。分析以上电泳图知：（1）箭头所指的为AK相对应的相对分子43KDa质量处。（2）第1孔中的样品（未诱导粗提液）未经IPTG诱导，故AK的表达量很少；（3）第2孔中的样品是经IPTG诱导得到的粗提液，含有大量的目的蛋白和杂蛋白；（4）第3孔中的样品是穿流液，大量目的蛋白挂到Ni柱上，所以含大量的杂蛋白和少量的目的蛋白；（4）第4孔中的样品是用低浓度的咪唑液作用得到的洗脱液，蛋白含量很低；

21、（5）第5孔中的样品是用高浓度的咪唑液洗脱下来的，AK的量大而且纯度很高，故第5组在箭头所指处条带的颜色很深。总结由于精氨酸激酶基因的菌种是保存于甘油中，我们在进行接种扩大培养到含卡纳霉素的LB培养基锥形瓶中，首先要把原菌液接种到含LB培养基的小试管中进行活化812小时。由于不同的菌种的生长情况有差异，故所需的IPTG浓度不同。根据参考文献得出，诱导AK基因表达最适宜的OD600值为0.60.8 ，另外，我们通过实验得出，IPTG诱导时间为5小时，且IPTG终浓度为0.5mM因为诱导AK表达的IPTG的浓度在小于1 mM的情况下，不易产生包涵体，因此，我们在后面的破壁、离心、分别取上清和沉淀，

22、分别用测活和电泳检测，发现沉淀中几乎没有AK。通过本次实验，我熟练地掌握了表达及纯化AK的基本流程，也熟悉了一些基本仪器的操作，了解了实验的原理，我感觉这次的综合实验与平时做的实验有很大的不同，平时做的基本上都是老师讲的多，自己动手的比较少，而且一个流程下来还没有搞清楚做这个实验的目的在哪里，原理不太清楚，以致于感觉做实验给我的感觉就像是当做任务一样完成，缺乏实验中需要的探究、发问、思考等重要习惯。参考文献1 France R M, Sellers D S and Grossman S H. Purification characterization and hydrodynamic prop

23、erties of arginine kinase from gulf shimp (Penaeus aztecus). Arch Biochem Biophys, 1997, 345(1): 73-782 Zhou G, somasundaram T,blanc E,et al.Transition state structure of arginine kinase:implications for catalysis of bimolecular reaction .Proo Natl Acad sci USA,1998,95(15):357-3593 Tsou C L. Configu

24、rational flexibility of enzyme active sites. Science, 1993, 262(5132): 380-3814潘继承 精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究 博士学位论文 北京：清华大学 F2004(4):1-25 美J.萨姆不鲁克 D.W.拉萨尔 分子克隆 科学出版社 上册 15章（12171259）。6France,Richard Morris ,Ph.D Purification and phicical characterization of arginine kinase from Penaeus aztecus: Evidence for a molten globule folding intermediate. Univercity of South Florida,1994(1)7Yu Z,Pan J and Zhou H.M A direct continuous pHspectrophotometric assay for arginine kinase activity. Protein and peptide letters,2002.9 (6) 545-552.