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1、基因组学知识点整理讲解AC/DS转座 Ac/Ds系统是玉米转座子系统之一。Ac是自主控制因子（autonomous element），或称激活因子，长4563bp，含有一个转座酶基因和一段与转座酶的近末端重复区域邻接的、短的不完整的反向重复序列。Ac缺失后能形成不同形式的Ds。Ds-a和Ac相似，只缺失了部分转座酶基因。这点可解释Ds自身不能发生转座的原因。Ds-b的缺失片段较长，仅保留了转座酶基因的一个小片段。Ds-c仅剩有Ac因子中反向重复序列和与转座酶结合的近末端重复区域。这些区域和片段都是Ds-c在Ac指导下转座所必须的靶位点。Ac能自主转座，并形成不稳定的基因突变，但不使染色体断裂，

2、它能使Ds因子活化、转座，并通过Ds控制结构基因的表达，有剂量效应，当Ac剂量增加时，相关的遗传效应延迟发生。Ds是非自主因子（nonautonomous element），又称解离因子，是与Ac属于同一家族的控制因子，Ds是由Ac因子中间序列的缺失而形成的，从而失去转座酶功能。当Ac因子存在时，能活化Ds，使其在基因组内转座或插入结构基因之内，导致基因失活或改变结构基因的表达水平，也可使染色体特定部位断裂，引起缺失或重组。玉米Ds的存在能抑制邻近基因的表达。Ac-Ds的转座通过非复制型机制发生，且总是转移到邻近的位置，当插入新靶位点后，原来位置上即失去Ds因子，结果可造成染色体断裂或重排，由

3、此可引起显性基因丢失，隐性基因表达。（小结）Ac是自主控制因子，Ds是非自主因子，Ac因子能自主转座并形成不稳定的基因突变，但不使染色体断裂，它能使Ds因子活化、转座，并通过Ds因子控制结构基因表达。Ac因子中间缺失后能形成不同形式的Ds因子，无转座酶功能。Ac因子能活化Ds因子，使其在基因组内转座或插入结构基因内导致基因失活或改变基因的表达水平，也可使染色体特定部位断裂，引起缺失或重组。Ds因子必须由Ac提供转座酶才能转座，Ds因子或多或少缺失Ac因子中的部分片段。所有的Ds因子要实现转座，必须由一对IR和与其比邻的一段短的可被Ac转座酶识别的序列。Ac-Ds的转座通过非复制型机制发生，且总

4、是转移到邻近的位置当插入新靶位点后，原来位置上即失去Ds因子，结果可造成染色体断裂或重排，由此可引起显性基因丢失，隐性基因表达。非编码RNA（siRNA和miRNA的产生过程、相同点、不同点）小的干涉RNA（small interfering RNA; siRNA） 和微小RNA（microRNA；miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小RNA的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。本文主要介绍这两种小RNA分子及其作用机理。siRNA介绍 RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，通过

5、这种方式，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现2125nt 的dsRNA 的出现对转基因导致基因沉默十分重要，而在转基因正确表达的植株中则未出现。随后，Hammond 等进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了小分子RNA在RNAi 中的作用，这些小分子RNA就是由

6、dsRNA形成的siRNA。siRNA 的3-末端2-nt 的突出对靶点识别的特异性起一定的作用，可将其限定在第一个碱基对相邻的不成对碱基的位置。两个研究小组以数以千计的人类和老鼠基因为目标创建RNAi库的进展，科学进展已清晰地表明：在哺乳动物中利用小的干涉RNA和短发夹RNA（short hairpin RNAs，shRNA）来进行RNA干涉以使基因沉默已经成为强大而有力的生物工具。例如，在基因操作较困难的神经元中，也有成功进行RNAi的报道。Krichevsky等将化学合成的21nt siRNA通过阳离子脂类转染试剂导入原代培养的大鼠神经元，显著抑制内源靶基因和转染基因的表达。抑制神经元N

7、O合成酶表达能有效降低疼痛，在Korneev的实验中设计的双链RNA成功地抑制了中枢神经系统NO合成酶表达，获得RNA干扰的成功。RNAi能在极低浓度（nmol范围）siRNA存在下显示出特殊有效性。miRNA介绍miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4，2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7，2001年10月science报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的li

8、n-4的小RNA基因，称为microRNA。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生(Kim, 2005)。miRNAs是一种2125nt长的单链小分子RNA，其结构特征如下：广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的miRNA，5端有一个磷酸基团，3端为羟基，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA

9、（双链）但是和siRNA密切相关。成熟的miRNA 5端的磷酸基团和3端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA独有的特征是其5端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。miRNAs的表达方式各不相同。线虫和果蝇当中的部分miRNA在各个发育阶段都有表达而且不分组织和细胞特性，而其他的miRNA则表现出更加严谨的时空表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）

10、只有在特定的时间、组织才会表达。细胞特异性或组织特异性是miRNA的表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。在科研上，一个小RNA分子要成为miRNA，需要符合以下条件：a）表达需要

11、用Northern-blot来证实；b）小RNA分子必须是处在具发夹结构的前体RNA分子中远离环或膨胀部分的一端才行；c）小RNA分子必须在系统发育上具备相当的保守性。d）前体RNA分子会在Dicer功能下降时积累起来（该项标准由于实践较难，只做参考）。这些标准单独一条不足以证明一个未知小RNA分子是否就是是miRNA，具体地，如果小RNA分子符合上面的a（表达）和b（结构）两条标准；或者a（表达）和c（保守性）；如果表达量很低难以检测，那么如果可以用cDNA克隆的方法得到目标分子，并符合c（保守性）；小RNA分子如果不是通过cDNA克隆的方法得到的，那么就必须符合a（表达）和前体RNA分子结

12、构和保守性的标准才行；如果小RNA分子被推测为miRNA，那么符合c（系统发育保守性）和d（累积性）标准也行；这样我们就可以认为该小RNA分子就是miRNA分子。寻找miRNA的方法：这里我们简单看一下分子信息学的方法：应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。2004年6月，吳政道在前述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA靶位点的方法。用这种方法筛选miRNA的原理：该方法的出发点为前体的发夹状结构及miRNA在物种间的保守性。miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反意义链）及远离任何已知基因的基因

13、间区域。一些时候，几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起.Uwe Ohler, Chris Burge等人给出了一些可以提高寻找miRNA基因的准确性的一些附加条件：1）上游和下游保守序列的数量；2）候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在。MIT的Bartel and Chris Burge报道了一种可以用来探测miRNA与其作用的靶基因之间的关系的新的计算机的方法TatgetScan。他们针对已知的每一个miRNA，扫描mRNA的数据库DNA转译为蛋白的生化信息，搜索与miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分，推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的

14、靶基因。RISC介绍RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex; RISC）的组装是在RNAi和miRNA通路中最为复杂的过程。它涉及到小RNA的生产器（Dicer）；小RNA螺旋结构及相应的RLC组装；解螺旋后对称/不对称的RNA螺旋结构及对应的特异性的AGO蛋白质的招募活动。刚产生的siRNAs和miRNAs都是双链结构，这种双链结构需要解螺旋才能被组装到RISC中发挥作用。组装后的复合物分别称为siRISC和miRISC。通过对链两端的热力学稳定性分析，可以将siRNA分为两大类：对称性siRNAs和非对称性siRNAs。对称性siRNAs有着相同

15、稳定性的末端；从而两条链有着同等结合到RISC中的机会(Schwarz et al., 2003)。与之不同的是，非对称性siRNAs的一端稳定性会比另外一端差些。因为稳定性较差的一端容易解螺旋，因此，偏向性地产生一条链结合到RISC复合物上，这个过程我们称之为“RISCs的非对称性组装(Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003)”。不同的AGO蛋白质使得RISCs有着不同的功能，这可能是由AGO蛋白质上PIWI结构域决定的。根据AGO蛋白质的不同，我们将RISCs分成两种：切割型RISC和非切割型RISC。但具体到一个RISC是否切割一个目标mR

16、NA分子，情况就更为复杂些，一般的以下五个方面决定(Tang, 2005)：a）必须是切割型RISC；b）小RNA分子和目标的mRNA的配对情况要达到一定的水平；c）特定生物/组织/细胞中的RISC的切割速率情况（就是说在不同的细胞中是那种形式占据主导地位，是切割还是抑制）；d）小RNA分子的来源背景；e）目标mRNA的特性（数量，更新速率，结构，翻译能力）。siRNA的生成及作用机制dsRNA 引起的RNAi 大致可分为3个阶段即启动、剪切、倍增:1、启动阶段 研究发现体内dsRNA 除外源性导入外，可能来源于病毒激活、转座子活化及特异重复序列或其他未知途径。研究证实dsRNA 在体内通过2123 个核苷酸(nt) 片段即小干扰RNA ( siRNA) 发挥其抑制作用。RNase 是为数不多的对长dsRNA 显示特异性的核酸酶，依据区域结构可将其分为3 个类型，其中第3 类以果蝇的CG4792 和线虫的K12H4. 8 为代表，二者在RNA 干扰过程