中药天然药物免疫毒性研究技术指导原则第二稿.docx

1、中药天然药物免疫毒性研究技术指导原则第二稿【Z】GPT4-1指导原那么编号中药、天然药物免疫毒性过敏性、光敏性研究的技术指导原那么第二稿二00三年十二月十七日概述4一、定义和意义4二、三、背景和目的4四、五、适应范围4六、七、重点内容6八、根本内容 .6一、根本原那么6二、免疫毒性6（一）适用范围和评价指标7（二）（三）试验中应考虑的问题8（四）三、超敏反响9一试验中应考虑的问题9二I型超敏反响.101定义.102主动皮肤过敏试验103主动全身过敏试验104被动皮肤过敏试验115抗体滴度检测11三II、型变态反响12四型变态反响.12四、光敏试验.12一皮肤光变态反响试验13三光变态反响试验中

2、应考虑的问题13五、数据分析及评价六、常见问题及处理.15七、不同剂型的中药、天然药物的一般要求.17参考文献 18附录 19一、主动皮肤过敏试验19二、三、主动全身过敏试验21四、五、被动全身过敏试验22六、七、型超敏试验23八、九、型超敏试验24十、（一）Buehler分析和豚鼠最大值法.24（二）（三）啮齿类局部淋巴结试验.25（四）（五）小鼠迟发型变态反响试验.26（六）十一、皮肤光变态反响试验27十二、起草说明 27著者 30概述一、定义和意义免疫毒理学是毒理学中一门重要的分支学科，其目的是探讨外源性化合物对机体人和实验动物免疫系统产生的不良影响及机理。外源性化合物对机体免疫系统的损

3、伤作用包括两类，一是免疫抑制，即免疫系统的广泛抑制，可致机体对感染的易感性增加及肿瘤发生率增高；另一是免疫增强，即免疫系统反响性过度增强，而导致机体过敏反响变态反响和自身免疫性疾病。过敏反响又称变态反响，是指机体受同一抗原再次刺激后产生的一种异常或病理性免疫反响。按抗原与抗体或细胞反响的方式和补体是否参加等，将变态反响分为、四型。其中型变态反响是了解得最多的一种变态反响，目前采用的过敏试验方法多数是根据型变态反响发病机制的不同环节而设计建立的。光敏反响包括光毒反响和光过敏反响光变态反响两类，光过敏反响为IV型变态反响的特殊类型，是局部给药和全身给药后，分布在皮肤中的药物中所含的感光物质与光线产

4、生复合作用使得用药后皮肤对光线产生的不良反响。中药、天然药物为一种外源性物质，也可作为变应原引机体产生发变态反响。本指导原那么仅就中药、天然药物对机体变态反响和光敏反响进行讨论。二、背景和目的从70年代后期开始，欧美等先进国家开始研究药物对机体免疫系统的毒性研究。90年代以来，逐渐将免疫毒性作为药物平安性评价的一项重要内容。随着中药走向世界，许多高新技术也广泛应用于中药新药的研发过程。其研究内容也日趋与国外化药新药研究接轨。中药作为一种外源性化学物质，进入机体后，同样对机体免疫系统产生不同程度的毒副作用。在中药新药研究过程中，研究其对机体免疫系统的影响及机理，是中药临床前平安性研究及评价的一项

5、重要内容。以往中药新药的平安性研究中，很少关注或检查免疫系统，故也极少发现受试物的免疫毒性作用。因免疫系统方面的功能改变能在某种意义上预示药物的不良反响，且免疫系统对毒物具有很高的敏感性。因此，需在新药评价过程中，逐渐建立一套评价方法，在常规的平安性研究中探索并发现药物的免疫毒性以及及引起的免疫系统的功能性改变等。传统观念认为，中药平和、平安，但近年来，伴随中药及其新制剂的不断增多，如注射剂品种的不断增加，使用范围的日益扩大，由中药引起的不良反响特别是变态反响也在逐年增多。以下几方面可能是导致中药变态反响发生的主要原因：1中药自身的特点：中药成分复杂，按生理活性可分为有效成分、辅助成分、无效成

6、分、组织物及杂质等，其中不乏有导致机体的过敏物质，如动、植物蛋白，多肽，多糖等大分子物质，它们同时具有免疫原性和反响原性,属于完全抗原，可直接刺激机体免疫系统产生免疫应答,使机体产生抗体或致敏淋巴细胞,最后导致变态反响；一些小分子化学物质属于半抗原，进入人体后与蛋白质结合成全抗原而致敏。2中药及其制剂中的致敏原，除药物本身成分外，其制剂中的添加剂、助溶剂、稳定剂、着色剂、稀释剂及在制备过程中产生的杂质和药物本身的氧化、复原、分解、聚合等形成的杂质均能成为过敏原而致机体过敏，从而诱发各种类型的变态反响。3中药复方制剂：复方制剂包含多种不同药物，混在一起制成煎剂、注射剂、丸剂及外用制剂等。各种药物

7、成分在体外就有可能发生相互作用,进入体内后在消化、吸收及体内转化过程中,也会有互相作用发生,这无疑也会成为发生不良反响的原因。鉴于此，中药免疫毒性特别是变态反响的研究是不可无视的临床前平安性评价的重要内容之一。 三、适用范围该技术指导原那么适用于拟用人和/或已上市的中药、天然药物的免疫毒性研究。这些药物指非口服给药途径的中药、天然药物，包括中药注射剂及其他局部用药的制剂。四、重点内容本技术指导原那么的重点内容主要包括免疫毒性、变态反响试验和光敏试验的相关内容。根本内容一、根本原那么免疫毒性研究过程必须执行?药品非临床研究质量管理标准?GLP。在进行试验设计中，应遵循随机、对照、重复的统计学原那

8、么。应在遵循平安性评价普遍规律的根底上，运用具体问题具体分析的方法，结合受试物的自身特点，充分考虑和结合药学、药效学、其他毒理学长毒、急毒及拟临床应用情况等信息，表达整体性、综合性的原那么，在说明其研究方法或手段科学、合理的前提下进行标准性试验，对试验结果应进行全面分析和综合评价，以到达免疫毒性研究的目的。二、免疫毒性1234药物对机体的免疫毒性常涉及免疫器官、免疫细胞和免疫分子。药物暴露后的免疫毒性可表现为淋巴细胞器官重量或组织学的改变，或骨髓及外周淋巴细胞的改变。药物对免疫系统影响的评价与免疫反响性有关，不能仅通过组织病理学和血液学的方法对淋巴组织进行单一检查，一般认为组织病理学变化通常不

9、是敏感药物诱发免疫毒性的指标，而仅见于相对较高的剂量时，且并不一定与功能性免疫改变相对应。因此，检测免疫毒性要通过多项指标来进行综合性评价。实验方法应建立在公认的免疫学理论和免疫实验技术根底之上；实验观察指标应标准、灵敏、系统、全面；通常由多剂量毒性实验、病理组织学和/或免疫组化方法完成。一、适用范围及评价指标需进行免疫毒性评价的受试物：由于免疫系统是一增生活泼的系统，因此对毒物非常敏感，但每一种化学物质都有其特定的靶器官，因此不必盲目地对所有受试物进行免疫毒性监测，而是选择性地对某些受试物特别是以免疫系统为靶器官的毒物进行研究。用于某些适应症的药物，因其作用机制的特殊性，对人体免疫系统可能产

10、生影响，如感染HIV的病人，免疫系统已遭到严重损伤，故对用于AIDS的治疗剂进行免疫毒理学评价极为重要。另外，当受试物是的免疫调节剂的情况，或在平安性评价过程中初步发现对免疫系统有明显影响的药物也应进行免疫毒性的评价。在何种试验中进行免疫毒性的观察：建议在现有的长期毒性试验中，增加免疫系统损伤的评价指标。现长毒试验中对免疫器官变化关注的较少，进行病理组织学检查的主要是脾脏和胸腺。对脾、胸腺、淋巴结的详细检查，包括重量及病理组织学检查及骨髓的病理组织学检查更能反响出对免疫系统的损伤作用。即应将临床前平安性试验与确定药物对免疫系统功能影响的特殊评价结合起来， 应合理选择综合性评价指标。进行免疫毒性

11、评价时，通常需对免疫器官、免疫细胞、免疫分子包括细胞因子等进行分析。一种化合物或其代谢产物对淋巴细胞存活的直接效应，可通过受试物与特定的淋巴细胞体外共培养确定，并在不同时间里监测细胞活力。如果某些受试物体内给药能减少一种或多种细胞类型，而在体外培养时无此作用，那么可能间接的作用于淋巴细胞。有些化合物可能抑制免疫功能而不显著影响细胞数目，因此有必要对免疫功能进行分析。如用吞噬细胞摄取颗粒的能力和肿瘤活性的能力来评价某些受试物对其的影响。NK细胞抗肿瘤活性的测量，通常用标记YAC-1的肿瘤细胞作为靶细胞分析51Cr-的释放量来评价。淋巴细胞的信号传递途径和增殖能力，可通过有丝分裂原或者生理活性因子

12、激活细胞来评价等。即应结合具体情况，选择适宜的评价指标。二、试验中应考虑的问题1、动物选择用于检测潜在免疫毒性的临床前试验的受试动物应为健康动物，通常用啮齿类动物。受试动物在试验前应在试验场所进行适应性饲养。免疫毒性试验设计中要充分考虑到动物免疫系统的成熟程度等。2、给药途径应与拟用临床途径一致如有特殊情况，需说明。3、给药剂量建议设置三个剂量，低剂量应不低于药效试验有效剂量。应考虑出现免疫毒性的剂量和引起其他毒性的剂量的关系；注意观察出现免疫毒性的可逆性。4、给药时间每日给药，连续1个月或与长毒试验周期一致。5、检测指标用于检测受试物引起动物免疫毒性的指标应包括以下两级：1第一级：血液学如白

13、细胞计数等、重量如体重、脾重、胸腺重、肾脏重和肝重等、脾细胞数和骨髓细胞数、淋巴器官组织学观察、IgM抗体形成空斑细胞PFCS、T淋巴细胞转化、混合淋巴细胞反响、B淋巴细胞转化和NK细胞活性；2第二级：B淋巴细胞、T淋巴细胞外表标志、IgG抗体形成空斑细胞计数、T淋巴细胞的细胞毒效应、ADCC作用、I型超敏反响全身或局部、迟发性超敏反响及宿主对实验性感染或肿瘤移植的抵抗作用等。6、环境因素特定环境的环境，如群养、单养、温度、禁食、禁水、光照、固定、手术、给药方法和应激都会对实验动物的免疫系统产生影响。应尽量注意防止。在任何免疫毒性研究中，受试物的剂量、给药时间、给药方式应与发现不良反响的实验相

14、一致。7、免疫功能的检测方法见后 包括皮肤被动过敏试验、皮肤主动过敏试验、全身主动过敏试验及抗体滴度测定等。 包括淋巴细胞增殖反响，K细胞、NK细胞、巨噬细胞、抗原递呈细胞功能，以及宿主抵抗力试验对抗原的抵抗试验及肿瘤细胞攻击试验等。三、超敏反响试验一、试验中应考虑的问题中药、天然药物应进行何种变态反响研究，可根据药物自身特点、临床适应症和给药方式确定。通常局部给药发挥全身作用的药物如注射剂和透皮吸收剂等需考察型变态反响，如注射剂需进行全身主动过敏试验和皮肤被动过敏试验，透皮吸收剂需进行皮肤主动过敏试验等。和型变态反响可在进行长期毒性试验中选择相关指标进行观察，如观察动物的体征、一般表现及免疫

15、系统损伤的评价指标等。经皮给药制剂包括经皮给药发挥全身作用或局部作用的药物应进行IV型变态反响试验。具体试验方法的选择应根据给药途径、过敏反响发生机制、影响因素和临床意义等为根底进行选择，如皮肤主动过敏试验、全身主动过敏试验、皮肤被动过敏试验、小鼠耳廓肿胀试验MEST、啮齿类局部淋巴结实验LLNA、Buehler分析法、豚鼠最大值法GPMT等，也可采用其它的检测方法，但需说明其合理性并说明具体方法及操作流程。过敏试验均应设立阳性对照和阴性对照。可选择多个剂量进行试验，尽可能找出无过敏反响的剂量，以提示临床进行脱敏处理的起始剂量；也可防止因剂量过低而出现假阴性结果；另外，可帮助判断阳性结果是否因

16、强刺激反响而引起。二、型超敏反响试验1、定义型超敏反响又称速发型，药物分子本身为变应原,进入机体刺激免疫系统产生相应的IgE抗体,IgE抗体附着在肥大细胞及嗜碱性细胞上使之致敏,当同一变应原再次进入机体后,即与肥大细胞及嗜碱性细胞外表的IgE抗体发生抗原抗体反响,导致肥大细胞及嗜碱性细胞脱颗粒并释放生物活性介质,作用于不同的组织和器官,产生不同的病理生理反响。临床表现为过敏性休克、支气管哮喘、变应原鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反响等。型超敏反响通常用皮肤主动过敏试验ACA、全身主动过敏试验ASA和皮肤被动过敏试验PCA等考察，对于吸入途径药物常采用呼吸道敏感性检测。2、主动皮肤过敏试验Active

17、Cutaneous anaphylaxis, ACA 皮肤过敏是一种受试物产生免疫学传递的皮肤反响。当动物初始接触受试物后至少1周，再进行受试物的激发接触，有可能导致过敏状态。本试验的目的就是要观察受试物经皮肤重复接触受试物后，机体免疫系统反响在皮肤上的表现，即有无过敏反响及过敏强度如何。3、主动全身超敏试验Active systemic anaphylaxis, ASA当药物作为抗原或半抗原初次进入体内，刺激机体产生相应的抗体IgE。当同样药物再次进入机体，抗原与抗体结合形成的抗原抗体复合物，刺激肥大细胞及嗜碱性细胞释放活性介质，从而引起局部水肿、抓鼻、竖毛、呼吸困难、窒息、痉挛，甚至休克死

18、亡。本试验的目的即观察受试物给药后对动物引起的过敏反响。中药注射剂引起的过敏反响临床上较多见，尤其是引起全身性过敏反响，甚至过敏性休克等非常严重的副反响。因此，中药注射剂全身主动过敏试验更显得有特殊意义。4、被动皮肤过敏试验Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA被动皮肤过敏试验是一种较敏感的测试特异抗体滴度的方法。将受试物致敏动物的血清含丰富的IgE抗体给正常动物皮内注射，IgE的Fc端与皮肤的肥大细胞外表的特异受体结合，形成IgE的复合物，使肥大细胞致敏。当抗原攻击时，抗原与肥大细胞外表上IgE的Fab端结合，导致IgE分子结构的改变，引起肥大细胞脱颗粒，释放过

19、敏介质如组胺、慢反响物质等，使皮肤局部血管的通透性增加，使静脉注射抗原的同时注入的伊文思蓝染料在该皮肤处渗出着色。根据局部皮肤蓝染范围或程度，可判定血管通透性变化的大小，继而判定皮肤过敏反响的程度。5、抗体滴度测定IgE是引起I型变态反响的主要原因，检测血清或体液中的IgE水平对明确是否存在I型变态反响和认识药物诱发变态反响的机制具有重要意义。IgE的检测可利用放射免疫法RIA等进行。如取静脉血，别离血清后，可用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定Enzyme-linked immunosorbent assay。有研究认为临床理想条件下，血清IgE检测和皮肤试验两者的结果具有较好的相关性，因此认为两

20、种方法联合检测可提高结果判断的敏感性和准确性。过敏试验出现阳性或可疑阳性，以及一些具有潜在致敏性的物质，建议进行本试验。6、试验方法可参见附录中试验方法。三、型和超敏反响型变态反响又称细胞毒或溶细胞型。药物分子进入机体后附着在细胞膜通常是血细胞上，并刺激免疫系统产生相应抗体，参与的抗体主要是IgG和IgM，特点是由抗体直接与靶细胞膜上的抗原结合而导致细胞溶解。临床可表现为药物性溶血性贫血、粒细胞减少和血小板减少性紫癜等。型变态反响又称免疫复合物型或血管炎型。药物分子进入机体刺激免疫系统产生相应抗体IgG, IgM，当抗原抗体两者呈一定比例时形成免疫复合物，沉积于组织的血管基底膜上，导致血管壁的

21、损伤及炎症反响。常见反响如血清病、变应性肾小球肾炎、全身性红斑狼疮样反响等。尚无标准的临床前试验进行预测。当药理学和毒理学试验结果提示有潜在的II和III型超敏反响时，建议可进行进一步的相关试验研究。可参照附录中的试验方法。 四、IV型变态反响试验又称迟发型。药物直接作用于T淋巴细胞使之致敏，当同一药物再次接触已致敏的淋巴细胞，那么激发致敏淋巴细胞释放介质而导致组织损伤。 此类反响无抗体参与，发生较慢，一般在再次接触相同抗原48-72小时后才出现临床表现。主要表现为药疹、接触性皮炎、剥脱性皮炎等。可参照附录中的试验方法。13四、光敏试验光敏反响photosensitivety reaction

22、s是用药后皮肤对光线产生的不良反响，包括光毒反响phototoxic reactions和光变态反响或光过敏反响photoallergic reactions两类，均由受试物所含的感光物质引起，但两者机制不同，实验方法、临床表现及意义亦不同，应分别进行检测。光敏反响可由局部给药和系统给药诱发，并不仅限于局部给药。因此，原那么上所有给药途径的药物，只要有皮肤分布，那么均应进行光敏检测。假设受试物的化学结构或某些组成包括药物和赋形剂文献报道有光敏作用者，或其化学结构与光敏剂相似者，曾有报道具有光敏作用的中药制剂，以及用于皮肤暴露部位的外用制剂，建议作光敏试验。本试验的目的为观察受试物接触皮肤或应用

23、后遇光照射是否有光敏反响。一、皮肤光变态反响试验光变态反响系药物吸收光能后成激活状态，并以半抗原形式与皮肤中的蛋白结合成为药物-蛋白质结合物全抗原，经表皮的郎罕氏细胞Langerhans传递给免疫活性细胞，引起过敏反响的作用。光变态反响属IV型迟发型变态反响，是与结构相关的交叉反响。其发生时间相对较长，且有一定的潜伏期。通常5-10天的连续用药和光照射可诱导免疫系统产生光过敏反响。再次给药时，药物和日照作用24-48小时之内即会有光过敏性反响发生。可参照附录中的试验方法。 二、光变态试验中应考虑的问题1、动物选择建议首选白色豚鼠或家兔。2、照射光源及波长的选择可采用氙灯、石英灯或混合光源包括U

24、VA和UAB或单纯紫外光源UVA。波长宜包括中、长波紫外线280-400nm波段，因结构不同的药物敏感波长不同，应利用对不同受试物敏感的波长段进行试验。通过预试验，对照射剂量、光强度和照射时间及照距等进行确定。3、受试物建议选用临床用药浓度或等效剂量，光变态反响激发浓度可用适当稀释的浓度，以除外光毒反响。4、阳性光感对照物光变态反响可选用溴化水杨酰苯胺。5、给药时间光照前应尽量保证受试物及对照物有足够的时间穿透皮肤角质层，以与表皮细胞发生作用，一般在60min左右为宜。6、给药象限的选择假设为系统给药，那么给药象限及不给药象限，以及阳性对照物象限都应在不同动物组中分别进行。7、结果表述光敏试验

25、的主要环节均应以照片记录及表示。8、试验系统完善的光敏反响评价系统是评价药物光敏反响的根底。合理的评价系统应依据药物的光敏反响机制，由体外光化学模型、体外生物学模型及实验动物模型共同组成。在光化学反响模型中利用不同波长的UVA照射，先确定受试物发生光敏反响的最敏感波长，以为进一步的生物学评价奠定根底。五、数据分析及评价一、应详细论述实验方法，说明分组、给药剂量、动物数、用药次数等；应详细描述超敏反响的表现、反响持续时间、恢复情况及时间、死亡动物数及病理组织学检查结果，并提供相应的照片，以利用对结果的分析和判断。在主动全身超敏反响试验中出现动物死亡时，应进行解剖，假设有明显病变那么应进行病理组织

26、学检查二、应根据试验结果，按评分方式对不同剂量或浓度下反响发生情况及严重程度进行表述，分析超敏反响的量效关系和时效关系及其可逆性，判断数据变化是否与受试物有关，确定超敏反响剂量、平安剂量及平安范围等。三、结合药效学及其他毒理学试验结果进行综合分析，整体评价，注意不能将动物结果不加分析外推到人，也不能忽略甚至成心舍掉个别出现毒性反响的动物，应实事求是地反映受试物的毒性，根据试验结果得出受试物在临床应用的意义及考前须知等提示。四、引起机体免疫系统的免疫应答过程是一个十分复杂并需要不断认知的过程。因此，观察中药对机体可能存在的免疫毒性作用的研究工作应尽可能全面、深入。试验者不能以个别或少数实验结果来

27、整体评价受试药物的免疫毒性作用，应根据免疫应答的类型、特点，结合不同实验动物的生理特性，选择适宜的动物进行相关试验，以获取较为全面、客观的试验数据。对试验结果应进行综合评判，方可对中药新药是否具有免疫毒性作出合理正确的结论。五、需注意，在任何临床前毒理研究期间如急性毒性试验、长期毒性试验、致畸试验、致癌试验等发现的免疫毒性作用，都应予以评估。六、免疫抑制与肿瘤的关系复杂而有争议。在大多数情况下，假设在长期毒性试验中发现了肿瘤发生率升高，这种作用可能与遗传毒性、激素作用或其他明确的机理相关。然而对一些受试物，致癌作用不易在非临床试验中发现，在此情况下应考虑具有免疫抑制的潜在作用。六、常见问题及处

28、理一、中药注射剂临床应用中发生不良反响的类型较多，如诱发变态反响的类型包括：型超敏反响如过敏性休克、支气管哮喘、过敏性鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反响、型超敏反响，如溶血性贫血、粒细胞减少和血小板减少性紫癜、型超敏反响如血清病、链球菌感染后肾小球肾炎、系统性红斑狼疮及型超敏反响如接触性皮炎、湿疹型反响、移植排斥反响。因此应根据需要，除进行型变态反响试验外，进行-型变态反响试验。二、在免疫毒性评价中，应重视给药剂量和给药速度对动物过敏反响发生的影响等。应区分伪变态反响pseudoallergic- reaction,也称为类变态反响(anaphylatoidreaction) 的概念。其表现有速发反响的特点,但其发生与免疫机制无关,是没有抗原抗体参与的非免疫机制所致。在中药不良反响的分析资料中,符合变态反响临床诊断标准者高达40%66%,但通过对发病有关因素的分析可发现,这些“变态反响中有不少发生于第一次用药，即无用药治疗史,缺乏致敏的时机, 于第一次用