选修五第一章认识有机物第四节研究有机物的步骤和方法色谱法Chromatography.docx

1、选修五第一章认识有机物第四节研究有机物的步骤和方法色谱法Chromatography色谱法(Chromatography)引论1 概述一、色谱法色谱法早在二十世纪初由俄国科学家建立,并用来分离植物色素。后来不仅用于分离有色物质,还用来分离无色物质,并出现了各种类型的色谱法。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。目前色谱法已广泛应用于许多领域,成为十分重要的分离分析手段。各种色谱法共同的特点是具备两个相,有一相不动,称为固定相；另一相携带样品移动,称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分在性质和结构上有差异,与固定相相互作用的类型、强弱

2、就会有差异,因此在同一推动力下,不同组分在固定相滞留时间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出。现以填充柱内进行的吸附色谱为例来说明色谱分离过程。色谱柱内紧密而均匀的固定相,流动相则连续不断地流经其间,将样品一次性注入色谱柱后,各组分就被固定相所吸附,流动相不断地流入色谱柱。当流动相流过组分时,已被吸附在固定相上的样品分子又溶解于流动相(此过程称为解吸)而随流动相向前移动,已解吸的组分遇到新的吸附剂颗粒,又再次被吸附。如此在色谱柱内不断地发生吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程。不同组分其分子结构不同,在固定相上的吸附力也不同,随流动相向前移动的速度也就不同,最后从色谱柱内流出的时间不同,分

3、别用容器盛接,就达到了分离的目的。各组分间的性质差异即使很小,通过改进措施,如加长色谱柱,也可将它们分离。二、色谱法分类1.按两相状态分类流动相为气体的色谱法称为“气相色谱法”(GC),其中固定相是固体吸附剂的称为气固色谱(GSC),固定相为液体的称为气液色谱(GLC)。流动相为液体的色谱法称为“液相色谱法”(LC),同上,液相色谱法也可分成液固色谱(LSC)和液液色谱(LLC)。2.按分离机理分类根据组分与固定相的作用,可分为：吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法等。3.按固定相的外型分类固定相装在柱内的色谱法称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法称为平板色谱。平板色谱又可分为薄层

4、色谱和纸色谱。三、色谱法的特点1.分离效能高 色谱法可以反复多次地利用各组分性质上的差异来进行分离,使得这种差异放大很多倍,因此分离效能比一般方法高很多。2.灵敏度高 可检测g的物质,适于作痕量分析。色谱分析需要的样品量极少,一般只需微克或纳克。3.分析速度快 一般只需几分钟或几十分钟就可完成一个分析周期,一次分析可同时测定多种组分。4.应用范围广 可分析气体、液体和固体物质。色谱法几乎可以分析所有的化学物质。2 色谱流出曲线和有关术语一、色谱流出曲线和色谱峰由检测器输出的电信号强度对时间作图,所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。(如图)如果进样量很小,浓度很低,则吸附或分配符

5、合等温线,色谱峰是对称的。二、基线在所以操作条件下,色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。稳定的基线应该是一条水平线。三、峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离,以h表示。四、 保留值1.死时间t0不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时,从进样到出现峰极大所需的时间称为死时间,它正比于色谱柱的空隙体积。这种物质的流动速度与流动相相近。2.保留时间tr试样从进样到出现峰极大时所经过的时间,成为保留时间。3.调整保留时间他tr保留时间扣除死时间,即为该组分的调整保留时间。即trtr- t0由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所需的时间,

6、所以tr是组分在固定相中停留的总时间。保留时间是色谱法定性的基本依据,但保留时间常受到流动相流速的影响,因此,更常用保留体积来表示保留值。4.死体积V0指色谱柱填充后,柱内固定相颗粒间所剩余的空间、色谱仪中管路和连接头之间的空间以及检测器的空间三项的总和。当后两项很下可忽略不计时,死体积可死时间和色谱柱出口处载气流速F计算,即V0 t0F 5.保留体积Vr指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。有如下关系Vrtr F6.调整保留体积Vr保留体积扣除死体积：VrVr- V0 trF7.相对保留值r2,1某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比,成为相对保留值r2,1

7、 tr2/ tr1 Vr2/ Vr1由于保留值常受到许多因素的影响,而相对保留值只与柱稳和固定相性质有关,而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关,因此在色谱法中,特别是在气相色谱法中,广泛用作定性的依据。在定性分析中,通常固定一个色谱峰作为标准(s),然后再求其它峰的相对保留值,此时可用符号表示,即 tri/ trstri为后出峰的调整保留时间,因此总是大于1的。又称选择因子。五、区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一,其表示方法有三种1.标准偏差即0.607倍峰高处谱峰宽的一半。2.半峰宽W1/2为峰高一半处的峰宽：W1/22.3543.峰底宽度W为色谱峰两侧底部的宽度W4六

8、、分配系数K和分配比k1.分配系数K 分配系数K又称平衡常数,是指在一定的温度和压力下,组分在两相间达到分配平衡时,组分在固定相中的浓度与在流动相中的浓度之比,即Kcs/cm分配系数是每一个溶质的特征值,它与固定相和温度有关。不同组分的分配系数的差异是实现色谱分离的先决条件,分配系数相差越大,越容易实现分离。2.分配比k 分配比又称容量因子,它是指在一定温度和压力下,组分在两相间达分配平衡时,分配在固定相和流动相中的质量比,即kms/mm(cs Vs)/(cm Vm)Vm 为柱中流动相的体积,Vs为柱中固定相的体积。 k值越大,说明组分在固定相中的量越多,相当于柱的容量大。3.K与k的关系K

9、cs/cm(ms/Vs)/(mm/Vm)k(Vm/Vs)k称为相比率,它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。3 色谱法基本理论色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离,组分要达到完全分离,两峰间的距离必须足够远,分离是分析的前提。要使两组分能完全分离,首先是两组分的分配系数必须有差异；其次是色谱峰不能太宽,否则两色谱峰还是容易重叠。这些因素都可由色谱理论来说明。一、塔板理论塔板理论是将色谱柱比作蒸馏塔,把一跟连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内,一部分空间为固定相占据,另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后,就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分

10、配平衡,这样一个小段称为一个理论塔板,一个理论塔板长度称为理论塔板高度,用H表示。经过多次平衡,分配系数小的组分,先离开色谱柱,分配系数大的后离开色谱柱。由于色谱柱内的塔板数相当多,即使组分的分配系数只有微小差别,仍可获得好好的分离效果。理论塔板数用n表示,当色谱柱长为L时,其塔板数n为nL/H 或 HL/n当L确定时,n越大,或H越小,表示柱效率越高,分离能力越强。由塔板理论可求出理论塔板数n的计算公式n5.5416通常填充色谱柱的n在103以上,H在1mm左右；毛细管色谱柱n105106 , H在0.5 mm左右。由于死时间t0包括在tr中,而实际死时间不参与柱内的分配,所以n值尽管很大,

11、H很小,但与实际柱效相差很大,因而提出了将死时间t0扣除的有效理论塔板数neff和有效塔板高度Heff作为柱效能指标neff5.5416Heff同一色谱柱对不同物质的柱效率是不一样的,因此在说明柱效时,除注明色谱条件外,还应指出是对何物质而言的。塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程,导出流出曲线的数学模型,并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置,还提出了计算和评价柱效能的参数。二、速率理论塔板理论在解释流出曲线的形状、组分的分离及评价柱效等方面是成功的,但是由于它的某些假设与实际色谱过程不符,如组分在塔板内达到分配平衡及纵向扩散可以忽略等。事实上,流动相携

12、带组分通过色谱柱时,由于分子速度较快,组分在固定相和流动相间不可能真正达到分配平衡。组分在色谱柱中的纵向扩散也是不能忽略的。塔板理论没有考虑各种动力学因素对色谱柱内传质过程的影响。因此,塔板理论无法解释柱效与流动相流速的关系,也不能说明影响柱效有哪些主要因素。1956年荷兰学者van Deemter等在研究气液色谱时,提出了色谱过程动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论在塔板高度的概念,并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程,从而在动力学上较好地解释了影响塔板高度各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。van Deemter方程的数学简化式为HA+Cu式中u为流动相的线速度；A,B,C为

13、常数,分别代表涡流扩散相系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。1.涡流扩散项A在填充色谱柱中,当组分随流动相向柱出口迁移时,流动相由于受到固定相颗粒障碍,不断改变流动方向,组分分子在前进中形成紊乱的涡流,故称为涡流扩散。在填充柱内,由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性,使同一组分的分子经过多个不同长度的途径流出色谱柱,一些分子沿较短的路径运行,较快通过色谱柱,另一些分子沿较长的路径运行,发生滞后,结果使色谱峰变宽。其程度由下式决定A2dp涡流扩散相与固定相的颗粒大小、几何形状及装填紧密程度有关。此式表明,A与填充物的平均直径dp的大小和填充物不规则因子有关,与流动相的性质、线速度和组分性

14、质无关。为了减小涡流扩散,提高柱效,使用细而均匀的颗粒,并且填充均匀是提高柱效的有效途径。对于空心毛细管,不存在涡流扩散,因此A0。2.分子扩散项B/u(纵向扩散项)当样品组分被载气带入色谱柱后,以“塞子”的形式存在于柱的很小一段空间中,由于存在纵向的浓度梯度,因而就会发生纵向的扩散,引起色谱峰展宽。分子扩散项系数为B2 Dg式中 是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素,称为弯曲因子。Dg为组分分子在流动相中的扩散系数(cm2/s)。弯曲因子与填充物性质有关,由于在填充柱内有固定相颗粒存在,使分子自由扩散受到阻碍,扩散程度降低。而在空心柱中,扩散不受到阻碍, 1。分子扩散项(1)与组分在流动相中的

15、扩散系数Dg成正比,而Dg与流动相及组分性质有关：分子量大的组分Dg小,Dg反比于流动相分子量的平方根。Dg与柱温、柱压有关,随柱温升高而增大,随柱压增大而减小。所以采用分子量较大的流动相,控制较低的柱温,可使B项降低。(2)与组分在色谱柱内停留的时间有关,流动相流速小,组分停留时间长。因此采用较高的载气流速。对于液项色谱,组分在流动相中的纵向扩散可以忽略不计。3.传质阻力项Cu组分在固定相和流动相之间的分配比然有一个组分分子在两相间的交换、扩散过程,这个过程称为质量传递,简称传质。当组分进入色谱柱后,由于它对固定液的亲和力,组分分子首先从气相向气液界面移动,进而向液相扩散分布,继而再从液相中

16、扩散出来进入气相。这个过程叫做传质过程。传质过程需要时间,而且在流动状态下,不能瞬间达到分配平衡。当它返回气相时,必然落后于随流动相前进的组分,从而引起色谱峰变宽。这种情况就如同这一部分受到了阻力一样,因此称为传质阻力,用C表示。(1)对于气液色谱,气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行浓度分配。对于填充柱,气相传质阻力系数Cg为Cgk为容量因子。气相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比,与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比。因此,采用粒度小的填充物和分子量小的载气,可使Cg减小,提高柱效。液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动到液相内

17、部,达到平衡后再返回相界面的传质过程。液相传质阻力系数Cl为Cl固定相的液膜厚度df薄,组分在液相的扩散系数Dl大,则液相传质阻力就小。降低液膜厚度df,但同时也会减小k,又会使Cl增大。所以可采用增大比表面积的方法(减小粒度)来减小Cl。但比表面积太大,又会造成拖尾峰。一般可通过控制适宜的柱温来减小Cl。对于气液色谱,传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项,即CCg+Cl(2)对于液液分配色谱,传质阻力系数C包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs,即CCm+Cs对于Cm,固定相的粒度愈小,微孔孔径愈大,传质速率就愈快,柱效就愈高。对高效液相色谱固定相的设

18、计就是基于这一考虑。对于Cs,传质过程与液膜厚度平方成正比,与试样分子在固定液的扩散系数成反比。4.范式方程曲线 如果以塔板高度对流动相线速度作图所得的双曲线,就是所谓的范式方程曲线。或称Hu图。(1)对于一定长度的柱子,柱效越高,理论塔板数越大,板高越小。但究竟控制怎样的线速度,才能达到最小板高呢？根据van Deemter公式分别作LC和GC的Hu图,见图a(b)。由图a和(b)不难看出：LC和GC的Hu图十分相似,对应某一流速都有一个板高的极小值,这个极小值就是柱效最高点； LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上,说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多LC的板高最低点相应流速比起GC的

19、流速亦小一个数量级,说明对于LC,为了取得良好的柱效,流速不一定要很高。 (2)分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献 由图可见,较低线速时,分子扩散项起主要作用；较高线速时,传质阻力项起主要作用；其中,流动项传质阻力项对板高的贡献几乎时一个定值。在高线速度时,固定相传质阻力项成为影响板高的主要因素,随着速度增高,板高值越来越大,柱效急剧下降。5.固定相粒度大小对板高的影响 固定相粒度对板高的影响是至关重要的。实验表明不同粒度,Hu曲线也不同图粒度越细,板高越小,并且受线速度影响亦小。这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作固定相的根据。当然,固定相颗粒愈细,柱流速愈慢。只有采取高压技术,流动相流速才

20、能符合实验要求。 。10.4 分离度 在色谱分析中常常遇到的是难分离物质对的分离问题。欲将难分离物质对的两组分进行分离,首先是两峰间的距离要大,即两组分保留时间有足够大的差值；其次是峰要窄。选择性反映了色谱柱对物质保留值的差别,柱效率反映了峰扩展的程度,但都不能表示色谱柱的总分离效能。为了综合考虑保留值的差值和峰宽对色谱分离的影响,需要引入分离度的概念。一、分离度定义如图,图中第一个,两色谱峰距离近并且峰形宽,两峰严重重叠,这表示选择性和柱效都很差。第二个,虽然两色谱峰距离拉开了,但峰形仍很宽,说明选择性好,但柱效低。第三个分离比较理想,选择性和柱效都较好。由此可见,单独用柱效或选择性不能真实

21、地反映组分在色谱柱中分离情况,故需引入一个综合性指标分离度R,又叫分辨率,它是色谱图中相邻两峰分离程度的量度。要求它既能反映柱效又能反映选择性的指标。两峰间的分离程度受两峰间的距离和两峰各自峰宽的制约。若保持峰宽不变,加大峰间的距离则分离程度加大,即分离度与两峰的保留时间之差成正比；若保持两峰间距离不变,使峰的宽度减小,两峰分离宽度也将增大,即分离度与峰宽成反比。因此,分离度为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽之和一半的比值。R.(1)在计算R值时,组分的保留值与峰底宽度要采用相同的计量单位。两峰的保留值相差越大,峰越窄,分离度越大。在一般情况下,由于色谱柱中溶质的浓度较低,可以认为

22、分配系数K为常数。K为常数时所进行的色谱过程为线性色谱。对于线性色谱,色谱峰时对称的呈高斯分布,其峰底宽度等于4。对于相邻两峰,可以认为其峰宽大致相等,故：一般说,当R1时,两峰有部分重叠；当R1时,峰间距离等于4,称为4分离,峰有2%的重叠,分离程度可达98%这已适合多数定量分析的需要,；当R1.5时,峰间距离等于6,分离程度可达99.7%,可以认为两峰已完全分开了。通常用R1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当然若R只值更大,分离效果会更好,但会延长分析时间。 在峰形不对称或两峰有重叠时,峰底宽度很难测定,此时可用半峰宽代替峰底宽,并认为wb2w1/2,则式变形为.(2)（1） 和(2)

23、式不完全等同,但实际上差别很小。利用这两个式子可以从色谱图上计算分离度。二、分离度公式分离度概括了色谱过程动力学和热力学特性,是衡量色谱柱分离效能的总指标。但(1)式不能预言怎样的分离条件会有怎样的分离结果,无法作为改善分离的根据。我们必须知道分离度与色谱分析中的重要参数n、k、的关系,从而通过控制这些参数来达到我们所希望的分离度。设有两个相近的色谱峰A和B,同时假定两峰宽相等,故谱带A和B的理论塔板数相同,以n表示。故： 此式为分离度公式,是色谱法中最重要的方程式之一,它说明了分离度R与重要色谱参数n、k、之间的关系。用分离度公式可以计算给定体系所能达到的分离度。由于理论塔板数n与柱长L成正

24、比,由此可以计算出某一分离度所需要的色谱柱长。通常都希望计算要达到某一预定的分离度所需要的理论塔板数或有效理论塔板数。为此,上式可改写为由上面各式可得到说明用较长的柱子可以提高分离度,但延长了分析时间,三、分离度的最佳化 在色谱分析中,总是希望在较短的时间内获得较高的分离度。究竟要多大的分离度,要根据分析任务来决定。一般说来,在进行定性分析时,需要准确测量tr值,对分离度的最低要求是R0.8,在用峰高法进行定量分析时,要求R1.0；若用测量峰面积法进行定量分析时,则要求R1.25。此外,相邻两组分的响应信号差别越大,所需要的分离度越大。我们知道,分离度R是重要色谱参数n、k、的函数,为了讨论方

25、便现假定这三个参数的变化是各自独立的,下面分别考察其对分离度的影响。(1)分离度与n的关系R与成正比,即n增大为原来的2倍,R只增大到原来的1.4倍。尽管如此,增大理论塔板数是提高分离度的最直接也是最有效的手段。因为R随着n的增大而没有限度。增大理论塔板数有两条途径：增加柱长和提高柱效。N与柱长成正比,增加柱长可以增大理论塔板数。然而柱长增加一倍,则分析时间和柱压也增加一倍。所以设法降低板高,提高柱效,才是提高分离度的最好方法。根据速率理论,为了提高柱效,首先要采用直径较小、粒度均匀的固定相。分配色谱还需控制较薄的液膜厚度。然后需要在适宜的操作条件下工作,如流动相的性质、流速、温度等。(2)分

26、离度与k的关系分离度与k/(k+1)成正比。当k趋于0时,R也趋于0。当k值增大时,k/(k+1)增大,R也随之增大,当k太大时,k增大对R增大的贡献极小,并且分析时间大大延长,导致色谱峰扩展严重,有时甚至造成谱带检测的困难,所以将k控制在合适的范围内。从图可见,当k大于5时,R增大已很慢,当k大于10时,R增大不多,但分析时间已经明显延长。曲线的最小值在k为23之间。因此,从分离度、分离时间和对峰的检测方面考虑,k的最佳值一般控制在25之间。在气相色谱中,增加固定液的用量可使k值增大,降低柱温,k值也增大。在液相色谱中,对k的控制,通常是通过控制流动相的极性来实现的。流动相极性大,k值小。(

27、3)分离度与的关系。R与(-1)/成正比,越大,(-1)/越大,R越大。当1时,R0,不能实现分离。但的微小变化对会对R有很大影响,如从1.1变成1.2时,可以提高分离度一倍,因此增大值是改善分离度的最有力手段。然而问题在于的变化不象n和k那样有规律可循。在气相色谱中,值主要取决于固定相的性质,并对温度有很大的依赖性,一般降低柱温可使值增大。在液相色谱中,主要通过改变流动相和固定相的性质来调整值,温度的作用很小。例1.对下面的三个色谱图,请根据具体情况选择改进分离度的途径。例2：有一1m长的柱子,分离组分1和2,得到色谱图。图中横坐标l为记录笔走纸距离。若欲得到R1.2的分离度,有效塔板数应为多少？色谱柱要加到多长？解：可求分离度R1R10.8neff116161239由得： neff22788 , Leff2788/123912.25(m)