酶活测定方法.docx

1、二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求 了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。二、基本原理多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多 种简单酚类物质氧化形成醌类化合物， 醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、 棕 色或黑色的聚合物。 在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中, 果蔬出现的组 织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在 420 nm 处有最大光吸收峰。因 此,可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、苹果、马铃薯等。（二）仪器及用具 研钵、高速冷冻

2、离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容 量瓶（ 100mL、1000 mL）。（三）试剂1100 mmol/L、pH 5.5 醋酸缓冲液母液A （200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。母液B（ 200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至 1 000 mL。取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释 至 1 000 mL。2提取缓冲液（含 1 mM PEG、4% PVPP和 1% Triton X-100）称取340 m

3、g PEG 6000 （聚乙二醇6000）、4 g PVPP （聚乙烯吡咯烷酮， Polyvinyl -polypyrrolidone ），取 1 mL Triton X-100，用 100 mmol/L、pH 5.5 醋酸 缓冲液溶解、稀释至 100 mL。350 mmol/L 邻苯二酚称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入 5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条 件下研磨成匀浆，于4C、12 000 g离心30 min,收集上清液即为酶提取液，低 温保存备用。（二）活性测

4、定取一支试管，加入 4.0 mL 50 mmol/L、 pH 5.5的醋酸缓冲液和 1.0 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100 Jl酶提取液，同时立即开始计时。将反应 混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应 15 s 时开始记录反应体系在波长 420 nm 处吸光度值作为初始值，然后每隔 1 min 记 录一次，连续测定，至少获取 6 个点的数据。重复三次。五、实验结果与计算1将测定的数据填入下表重复次数样品重量W（g）提取 液体积V （mL）吸取 样品液 体积Vs（mL）420 nm吸光度值样品中PPO活性-1 -1(OD420min gFW)O

5、D0OD1OD2OD3OD4OD5OD计算平均值标准 偏差1232 计算结果记录反应体系在420 nm处的吸光度值，制作 OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值 OD420。然后以每克鲜重（FW）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位（U），则U =-1 -1OD420 min g FW。计算公式：多酚氧化酶活性（U） = UDEV心t汉Vs X W式中：OD420反应混合液的吸光度变化值；t酶促反应时间，min;V 样品提取液总体积，mL;Vs测定时所取样品提取液体积，mL;W样品重量，goPPO活性还可以每分钟反应体系在波长 420 nm处

6、吸光度值变化增加1时所 需的酶量为1个活性单位（U），表示为U = OD42min-1 mg-1蛋白质。酶提取液 中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。六、注意事项应进行预实验，测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化（初级反应）的时间段。这样，只测定某一段时间内反应溶液的 初始吸光度值（OD。）和最终值（ODt）这两个数据，就可以计算每分钟吸光度 值变化的增加量。七、思考题随着反应时间的延长，多酚氧化酶活性将呈现什么样的变化？（四）超氧化物岐化酶活性测定一、目的要求学习果蔬组织中过超氧化物歧化酶活性的测定原理和方法。二、基本原理超氧化物歧化酶（Superoxi

7、de dismutase SOD）普遍存在于动、植物与微生 物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的 SOD: Mn-SOD和 Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧自由基（。2-）,它与CAT、POD等酶协同作用来 防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对有机 体的毒害。超氧阴离子自由基（02）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。 S0D能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和02。H2O2再由CAT进一步催化生成H20和02。超氧化物岐化酶催化以下反应：202 - -2 .2C）2 - 02由于超氧自由基非常不稳定，寿命极短

8、，一般利用间接方法测定S0D活性。本实验依据S0D抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。 在有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下被还原。被还原的核黄素在有氧条 件下极易再氧化而产生02-。当加入NBT后，在光照条件下02-又可将NBT还原为 蓝色的甲腙，后者在560 nm处有最大光吸收。当加入S0D时，S0D可通过清除02-而抑制了 NBT的光还原反应，使蓝色甲 腙生成速度减慢。于是，进行光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈 低，反之酶的活性愈高。抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正 相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制 50%的NBT光

9、还原反应时 所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。三、材料、仪器及试剂（一）材料苹果、梨、番茄等。（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、光照箱（反 应试管处日光灯照度为4 000 LUX）、指形玻璃管、容量瓶（100 mL、200 mL、1 000 mL）。（三）试剂1 提取缓冲液：（1）100 mmol/L、pH 7.8 磷酸缓冲液母液 A （200 mmol/L Na2HPO4 溶液）：称取 35.61 g Na?HP04 2H2O 或 53.65 g Na2HPO4 7H2O 或 71.64 g NaHP04 12H2O，用蒸馏水溶解，定容至 1 00

10、0 mL。母液 B （200 mmol/L NaH2PO4 溶液）：称取 27.6 g NaH2PO4 H2O 或 31.2 g NaH2PO4 2H2O用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。取91.5 mL母液A和8.5 mL母液B混合后，调节pH至7.8,然后稀释至 200 mL,即为 100 mmol/L、pH 7.8 磷酸缓冲液。（2）提取缓冲液称取77 mg DTT，5 g PVP，加入100 mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲液，定容至 100 mL，摇溶，即得提取缓冲液（含 5 mmol/L DTT和5% PVP），低温（4C） 贮藏备用。2. 50 mmol/L、pH 7.8

11、磷酸缓冲液3. 130 mmol/L甲硫氨酸（MET）溶液称取1.94 g L-蛋氨酸，用50 mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL， 充分混匀（现用现配）。低温保存，可使用12天。4. 750 mol/L氮蓝四唑（NBT）溶液称取61.3 mg NBT，用蒸馏水溶解，定容至100 mL，充分混匀（现配现用）。 低温避光保存，可用23天。5. 100 mol/L EDTA-Na 2溶液称取37.2 mg EDTA-Na2，用蒸馏水溶解，定容至100 mL,使用时稀释100 倍。低温避光保存可用810天。6. 20 mol/L核黄素溶液称取75.3 mg核黄素，用蒸馏水溶

12、解，定容至100 mL,使用时稀释100倍。 低温避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，随用随配。四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0 g果蔬样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入到离心管中，于4G 12 000材离心30 min，收集上清液，低温保存备用。（二）活性测定用5支指形玻璃管进行测定。按照表19所列内容加入各种溶液。注意最后 加入核黄素溶液。其中3支为测定管，2支为对照管。混匀后将1支对照管置于 暗处，其它各管置于4 000 LUX日光灯下反应15 min后，立即取出，置于暗处 终止反应。以不照光管做空白参比，于560 nm处分别

13、测定其它各管的吸光度值。表19.测定SOD活性各试剂加入量试剂（酶）用量（m L）终浓度（比色时）50 mmol/L磷酸缓冲液1.7130 mmol/L MET 溶液0.313 mmol/L750 mol/L NBT 溶液0.375 mol/L100 mol/L EDTA-Na 2 溶液0.310 mol/L20 mol/L核黄素溶液0.32.0 mol/L酶液0.1对照2支管以缓冲液代替总体积3.0五、实验结果与计算1.将测定的数据填入下表重复次数样品重W（g）提取液体 积V （mL）吸取样品液 体积Vs （mL）560度值吸光样品中SOD活性（U）ODcODs平均值标准 偏差1232. 计

14、算结果显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值（ ODs）和照光对照管 反应混合液的吸光度值（ODc）。以每分钟每克鲜重（FW）果蔬组织的反应体系 对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%时为一个SOD活性单位（U）表示。SOD活性（U）=(ODc-ODs) V0.5 ODc Vs t W式中：ODC 照光对照管反应混合液的吸光度值;ODs样品管反应混合液的吸光度值；V 样品提取液总体积，mL ;Vs 测定时所取样品提取液体积， mL；t 光照反应时间， min ；W 样品重量， g 。也可以用以每分钟反应体系对氮蓝四唑 （NBT ）光化还原的抑制为 50%时所 需的酶量为一个 SOD 活性单位（ U）。六、注意事项1需要通过预实验，摸索显色反应所需的时间。2当测定样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶液和核 黄素除外）按比例混合后一次加入 2.6 mL,然后依次加入核黄素和酶液，使终 浓度不变，其余各步骤与上相同。4要求各管受光情况一致， 所有反应管应排列在与日光灯管平行的直线上。反应温度控制在25C左右，视酶活性高低适当调整反应时间。 温度较高时，光照 时间应缩短；温度较低时，光照时间相应延长。5所用指形管要洁净透明，透光性好。用浅底广口的小玻璃皿照光效果更 好。七、思考题1在SOD测