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1、肼杂质限度论证及控制策略研究以水合肼用于药物合成工艺实际运作为例摘 要为了将化学合成类新药的安全风险控制在可接受状态，进行杂质遗传毒性评估判断十分重要。遗传毒性杂质极低的限度要求，对工艺和检测分析提出了更高的挑战，也成为药品进入欧美市场的技术挑战和潜在壁垒。国内目前合成类首创新药相对较少，若是合成药产业继续发展首创新药的比例提高，监管机构将来可能会有这方面关注与考量。设定遗传毒性杂质的可接受限度，需考虑研发所处的阶段，包括风险管理，适当的检测仪器与技艺精湛的检验人员，对杂质的认识和对工艺的理解，熟悉相应的法规与指南。本论文以肼杂质为例，检索文献数据，对杂质认识评估归类，运用风险管理工具，确定其

2、可接受限度。遗传毒性物质分两种情况：一种情况是无法获得试验数据支持某一阈值的，通常基于风险的TTC（毒理学关注阈值）；另一种情况是已有文献试验数据阈值支持某一限度的。第二种情况表明细胞自身保护机制能起作用，遗传毒性风险相对要小，允许摄入的限度通常比TTC更高。若是出现推算结果比TTC更低的情况，需理解这些数据的含义，结合其它领域的信息，论证应用TTC 限度的合理性。通过分析归纳总结，肼杂质按TTC 控制可满足要求。再基于药品最大日剂量以及具体生产工艺，明确风险控制限度目标，确定控制策略。为选取合适的合成工艺，识别关键质量属性、确定关键工艺参数，规避或控制遗传毒性杂质方面的风险提供参考。关键词:

3、遗传毒性；肼杂质；可接受限度；毒理学关注阈值（TTC）StudyontheControlStrategiesandJustificationfortheAcceptanceLimitsofHydrazinesinActivePharmaceuticalIngredients-HydrazineHydrateUsedinSyntheticProcessasPerspectiveInordertoassessandcontrolthesafetyriskofnewchemicallysynthesizeddrugs,itisverycriticaltoinvestigateanddetermine

4、thepotentialgenotoxicimpurities,whichwillrequirethewell-controlledmanufactureprocessandwell-developedanalyticalmethodologiestosupport.EvaluationandinvestigationofpotentialgenotoxicimpuritiesisbecomingacriticaltechnicalchallengeandpotentialbarrierfornewdrugsenteringintotheUSandEUregulatorydrugmarkets

5、.AlmostallofthechemicallysynthesizeddrugsmarketedinChinahadalsobeenapprovedbyEUand/orUSandmarketedformanyyearsandbeenprovedtobesafe,andSFDAhasnotpaidtoomucheffort/attentiontothistopicoverthoseapproveddrugs.Howtosetupanappropriategenetoxicimpurityacceptancelimitduringthedrugdevelopmentphaserequiresal

6、ltheconsiderationsrelatedtodrugdevelopment,includingriskcontrolconcept,adequateequipments,skilfulanalysts,understandingtheregulationandguidelines,investigatingandevaluatingtheimpurity itself,fullknowledge to the manufacture process.Inthisarticle,thegenotoxichydrazinesisusedasanexampletodemonstratean

7、ddiscusshowtoclassify,qualitycontrolandsetupanacceptablelimit.Therearetwoconsiderablesituationsindealingwithgenotoxiccompounds:oneiswithoutsufficient(experimental)evidenceforathreshold-relatedmechanism;anotheristhegenotoxiccompoundswithsufficient(experimental)evidenceforathreshold-relatedmechanism.U

8、sually,aThresholdofToxicologicalConcern(TTC)isestablishedforthefirstsituation,andapermissibledailyexposure(PDE)iscalculatedfromthenoobservableeffectslimit(NOEL)orthelowestobservedeffectlevel(LOEL)forthesecondsituation.IfahigherthanTTCacceptancelimitlevelcouldbesupportedbytheNOELorLOELdata,thenthisac

9、ceptancelimitisconsideredtobewelljustifiedandacceptable.IfahigherlimitcouldnotbesupportedbyNOELorLOEL,then,additionalinformationshouldbeprovidedtojustifywhether the impurity can becontrolled by TTC.Ingeneral,controllingtheindividualhydrazinesimpuritybyTTClimitisacceptable.Andthen based upon the TTC

10、limit andthemax dailydosage, itisvery important to designanddeveloptheprocessandstudyingtherelationshipofthegenotoxicimpuritycontrolduringthechoiceofsynthesisroute.Alloftheseworkswillprovideimportantinformationtoestablishtheanalyticalproceduresanddeterminethegenotoxicimpuritiescontrolstrategy.Keywor

11、ds:Genotoxicity,Hydrazines,AcceptanceCriteriaLimit,ThresholdofToxicologicalConcern(TTC)第1 章前 言 5第2章综述及背景介绍 82.1 杂质的概念及相关指南 82.2 选题背景 92.3 研究的意义 10第3章杂质风险评估流程 12第4章杂质结构评估与归类 144.1 杂质结构毒性风险归类 144.2 肼结构杂质归类 18第5章肼物质现行认可限度 205.1 药典现有产品的检索 205.2 肼的允许暴露量 205.3 分析检测方法 21第6章其它途径摄入肼的允许限度 276.1 工作场所空气中的肼 276.

12、2 呼吸途径日摄入量 27第7章肼杂质可接受限度及控制策略 297.1 肼物质的毒性实验文献数据 297.2 风险工具及风险因素分析 307.3 控制策略确定 32第8章分析局限与结论 348.1 分析局限 348.2 结论 34第1章前 言研究背景:风险是现代世界的现实的基础，损害健康的风险等于物质毒性与暴露量的乘积1。近年来，质量源于设计(QbD,QualitybyDesign)方法在欧美的推广，以及风险评估管理概念的引入，使得医药工业界对新药品中杂质的遗传毒性关注与控制得以实现。对遗传毒性杂质来讲，有些物质在与DNA 直接结合前就失去毒性，有些在很低的暴露量就可能与DNA 直接作用产生严

13、重的后果，即使通过动物实验也很难获得一个确定的阈值。基于整个广泛接受的生命周期较为保守的致癌风险增加概率（10-5）提出了毒理学关注阈值（TTC,ThresholdofToxicologicalConcern）。根据这一风险工具控制的限度，针对人体致癌可能性未知的杂质，按假定70 年的生命期，其致癌概率为十万分之一。但对那些强致癌性遗传毒性高度关注的物质，TTC是不适用的，必须要尽最大可能避免引入。而对于只是具有警示结构（structural alerts），并且该结构是与药品本身结构相关的杂质，因药品本身结构在研发时已经充分的进行了安全性的评估，这类杂质可按普通杂质控制，没有必要采用TTC进

14、行控制2。因此，对于有潜在遗传毒性的杂质，需要依据化合物的结构-毒性相关性关系，按结构与毒性分类，然后按照类别，确定其不同的控制方式。针对合成类小分子药物，进行杂质遗传毒性方面的评估判断，是企业选取工艺路线，控制产品风险的需要，也是进入欧美药政市场的技术要求之一。研究目的:本文以肼杂质为例，结合毒性研究数据，初步确定在结构-毒性相关性分类中的类别，结合行业针对特定杂质的监管限度，药品的最大日剂量以及用药期限，进一步确定最大允许的日摄入量，保证特定杂质的风险得到控制，使药品的安全满足患者的需求，满足监管技术标准的要求。肼杂质的联氨结构（NH2-NH2）是警示结构，具有潜在的遗传毒性，例如常见的水

15、合肼，欧洲化学品署（ECHA）公布的注册信息体现，欧洲每年的消耗量在1 万吨到10 万吨，其中很大一部分用作制药原料，在合成氨基脲、异烟肼、呋喃西林、百生肼等原料药的工艺中会出现肼结构的原料或中间体，形成潜在的肼结构杂质。肼杂质在合成反应过程中也可由医药中间体二苯甲酮腙等物质而生成。针对可能存在肼杂质的药品，为控制药品的遗传毒性风险，肼杂质的残留量需要检测，其可接受的限度需要论证。在此以肼杂质为例，研究其杂质遗传毒性的评估方法以及设定可接受限度，以此作为确定控制产品中遗传毒性杂质水平尺度的一个参考。从而有针对性地选取检测方法，评估所设计的工艺对特定杂质的去除能力，采取合适的控制策略，保证药品的

16、遗传毒性风险在可接受的范围内，以符合监管部门的要求和考量。USFDA(USFoodandDrugAdministration)以及EMA(EuropeanMedicinesAgency)的指南文件都为如何控制新药中遗传毒性杂质提供了风险评估的工具。具体应用时需理解这一风险评估工具的适用范围，检索收集分析处理所评估杂质毒性安全性方面尽可能详细的信息，决定是否采用该风险工具来评估工艺对杂质的去除能力。文献对比评估、计算机辅助评估符合特定的条件时，绝大多数杂质不需耗费资源用来进行Ames实验（细菌突变实验），更不必针对杂质进行动物体内、体外试验。研究方法:首先通过搜集文献和总结分析关于肼杂质的毒性研

17、究数据，演算推导出一个允许的日接触量。再检索获取行业监管部门现行的可接受水平，进一步掌握其它途径可能摄入肼杂质的允许限度。运用归纳对比以及风险评估控制的手段，确定按TTC（毒理学关注阈值）设定肼杂质的可接受限度是否合适，进一步根据检测评估结果以及具体的工艺步骤，确定合适的控制策略，为分析方法研发以及工艺设计控制肼杂质提出对策与建议。研究结果:根据文献总结的毒性数据，结合行业现行监管可接受水平，以及其它途径允许摄入量，归纳总结，肼结构杂质具备动物体内的试验阈值（NOEL，No-observed-effectlevel）文献数据，体内不与DNA 直接作用，没有人体强致癌毒性的报道，可以归为五类中的

18、第二类，杂质分子结构中肼结构以外没有其它警示结构并存的情况下，风险评估角度提出的TTC（毒理学关注阈值）适用于肼杂质的控制。进一步按产品中肼杂质残留评估结果以及工艺对杂质去除能力的大小，相应地采取日常检测，或者多批检测后的定期检测，甚至在多批检测符合规定后不订入放行规格的三种控制策略。研究结论:从最早针对药品纯度的控制，发展到针对杂质系统分析控制，以及近年来针对新申报小分子药品，遵循风险评估来对遗传毒性杂质极低限度的控制，所有这些的改变对新研发的生产工艺以及分析检测方法逐渐提出了更高要求。制药业不断发展，对遗传毒性风险杂质的关注度也会发展提高，生产者在确定工艺的过程中，需要从风险控制角度出发，

19、列出所有可能的潜在杂质，再依据杂质结构识别出具有遗传毒性警示结构的杂质。进一步了解其毒性数据，针对既有人体强致癌毒性又有遗传毒性的杂质，通常需要靠改变工艺去避免。确定只具有遗传毒性的杂质，需要确定其具体可接受限度，建立与监控水平相匹配的检测方法。与此相关的文献、药典以及其它现有行业标准，基于结构-毒性相关理论的计算机辅助软件，以及毒理毒性方面的文献数据，可加以引用来加强对杂质的了解和认识，最终决定是否采用USFDA 和EMA 指南中基于风险给出的遗传毒性杂质日允许摄入量TTC（毒理学关注阈值），生产工艺上来控制并结合检测评估，判断工艺对遗传毒性杂质的去除能力，根据其产生的步骤和带入成品中可能性

20、大小，来确定采取合适的策略，使杂质的风险处于可控的状态。基于研究评估结果，水合肼应用到合成工艺中，可以参照TTC来进行成品中肼杂质的控制，从结构-毒性相关性理论，结构类似的物质，毒性数据可以相互引用。只具有肼基团警示结构的杂质，都可以参照TTC 来进行控制。新药或新合成路线生产获得的药品，其潜在的遗传毒性杂质可以采用类似的方式进行评估。所有这一切的目的是保证患者的安全，以及满足监管部门的技术标准和对于遗传毒性杂质的可接受风险考量的要求。第2章综述及背景介绍2.1杂质的概念及相关指南杂质限度论证的一般概念在原料药ICH指南（Q3A，新原料药中的杂质指南)，或制剂ICH指南（Q3B，新药品中的杂质

21、指南）中进行了详细的描述，杂质具有导致副作用的潜在可能性，对病人的安全具有潜在的毒性风险，起始物料、中间体、试剂、溶剂和催化剂都是潜在杂质的来源。在Q3A-C中对限度合理性的论证被理解为是获取与评估限度的过程，被评估的杂质在这个限度上是能保证病人安全的。但是如果该杂质具有潜在的遗传毒性，确定其可接受限度是一个十分关键的问题，关于这个问题，欧洲EMA3和美国USFDA4的监管部门都已经有相关的指南为制药界提供了一些解决问题的思路和方法，ICH在2013 年初发布了关于遗传毒性杂质的指南草案M7，提出了一些更切合实际的途径来解决遗传毒性杂质问题。不仅针对新药，对于改变工艺或者已上市药品进行新的申请

22、，通常也需要按照目前指南提倡的方法进行遗传毒性杂质的评估研究。不过从仿制的角度，如果对其合成路线、工艺过程的控制以及所有杂质的概况进行了评价，并且与市场上已经授权销售的同种药物相比较，没有引入新的或更高水平的杂质，评估后或许能支持一个稍高的限度，但评估工作仍需要进行。对于那些已经授权销售的药品，如果认识到新的风险，有时也需要再进行遗传毒性杂质方面的评估，比如2007年，EU官方曾因为药品中甲磺酸和残留乙醇形成遗传毒性杂质甲磺酸乙酯，要求Roche公司进行毒性试验来更好地评估使用过奈非那韦（Viracept）药品的病人的风险5。企业在这方面主动引起足够的重视，具备一个清晰的策略来控制或规避这方面

23、的风险是十分重要的。遗传毒性杂质，主要是指以DNA反应物为主要研究对象的体外（invitro）或/和活体内（invivo）的试验中，若是发现某物质对DNA有潜在的破坏性，就可以称之为有潜在的遗传毒性。若是有足够的后续试验数据来证明体外体内实验的相关性，体外的试验结果可以用作对活体内的遗传毒性的关联性进行评估的间接手段。当缺乏后续试验数据的时候，若体外实验结果显示遗传毒性的物质，经常被认定为体内诱变剂和致癌剂。基于结构-毒性相关性理论，具有某一相同警示结构的化合物，往往其毒性数据可以相互参考，因此可将遗传毒性杂质按结构分类来对待。2.2选题背景出于对患者的安全以及药政监管要求考虑，遗传毒性杂质的

24、控制已经是新开发合成类小分子药品生产工艺设计过程中不可回避的课题，EDQM近年列出的评审问题前十排行中，每年都已经有这个话题的出现，监管机构或行业协会对制药工业界的法规性指南也为进行这方面的研究提供了相关的依据。企业结合具体情况，组织内外的资源，对药品中理论上可能存在的以及确实存在的遗传毒性杂质作出评估，认识风险，制定合适的质控策略，切合实际地加以控制相关的遗传毒性杂质，才能既满足监管的技术标准，又避免过多的检测，确保企业有限的资源集中到对患者安全高度相关的关键性的工作中，确保药品的安全与质量风险处于可接受的状态，并确保企业研发时间及费用的可控性，保证产品研发上市的速度。欧美一些创新药生产企业

25、，在这方面已经开展过不少研究评估，具备较为完善的数据库以及应对措施和方案。默克药厂的GanapathyMohan博士在2009 年的一次讲座课件中6，列出过一些欧美官方关于遗传毒性风险杂质反馈意见的例子：问题1）合理性说明原料药符合CPMP/SWP/8199/02,EMEA/CHMP/QWP/251344/2006关于遗传毒性杂质限度的指南（匈牙利）。问题2）提供关于潜在遗传毒性结构的讨论来说明在生产工艺中可能产生并带入最后原料药中的可能性（西班牙）；问题3）甲磺酸，甲醇，乙醇在起始物料的工艺中经常使用到，请提供免除对该来料或原料药进行甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯检测的理由(美国)；问题4）提供临床

26、试验用原料药批次关于潜在遗传毒性杂质降解物的实际水平；杂质的结构显示有两个警示结构（, 不饱和酮），最大的日剂量11mg/天，RRT1.05的杂质不超过60g/天，当按800mg/天的日剂量时，这个杂质的日摄入量为4,320g/天（美国）；问题5）甲磺酸乙酯和甲磺酸异丙酯是遗传毒性杂质，应该在原料药中设定规格并加以控制。同时应该提供验证过的检测方法。在起始物料新的合成路线中，“苯甲基肼盐”的肼被用到，它是一个遗传毒性杂质，应该在原料药或者起始物料的规格中列出并加以控制，应提供验证过的分析方法（美国）。药政官方目前所关注的主要集中在以下几方面：1）对遗传毒性杂质指南的确认；2）所采用合成路线条件

27、下的潜在杂质；3）对原料/试剂的筛选；4）对所设定限度的合理性说明。本文选取一个方面，基于结构-毒性相关性归类理论，通过检索，分析并归纳总结，对所设定肼的限度的合理性进行论证。2.3研究的意义ICH指南Q3A提到，针对新药中毒性异常高的杂质，需按更低的限度，比如遗传毒性杂质，以确保病人的安全。从2006 年开始，制药业界就开始关注杂质的遗传毒性。EMEA在2007 年1 月发布指南，2008 年2 月要求评估所有已经上市的药品中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，2008年6月和2009年12月，以问答的形式对指南进行解读。USFDA在2008 年12 月发布的指南草案，也为对待原料药和药品中遗传毒性杂

28、质提供了参考。ICH也已经就这一话题发布了M7 指南草案。针对新申报的小分子合成类药品，欧美药监机构在遗传毒性杂质方面的期望也在不断地提高。随着原创小分子新药或新合成工艺的出现，不远的将来我国的监管机构可能也会将潜在遗传毒性杂质的研究评估作为原创小分子药品安全性方面的要求。因为这是监控安全风险的需要，也是通过合理提高技术标准来抑制恶性竞争的方向之一。遗传毒性杂质的评估，针对新申报的药品，2006年就由欧洲单个国家药政评审开始陆续提出，官方的评审反馈信中也体现，识别和评估杂质遗传毒性的方法有基于结构-毒性相关理论的计算机辅助软件，Ames试验(致突变性检测)，动物体外、体内实验。通过对TTC（毒

29、理学关注阈值）工具背景的了解，针对没有毒性数据的遗传毒性杂质，根据其结构判断并检索是否有确定的人体强致癌性，排除第一类高度关注致癌物杂质的可能，即可采用此风险工具来进行控制，而不需针对杂质进行体内、体外实验。仿制药合成工艺，通常来源于原创药厂商过期工艺专利，合成路线不会有大的变化，作为潜在杂质的中间体，其遗传毒性的风险相对会低一些，但也是需要关注的。制药企业通常不会也没有必要进行巨额花费来对杂质进行动物实验，研究如何利用好现有的数据以及工业界普遍接受认可的标准及方法，对杂质进行认识了解，按遗传毒性风险进行归类，确定其可接受的限度是十分重要的。针对新申报药品或者修改工艺重新申报的药品，从遗传毒性

30、杂质评估方面提出了以下相关的考量：在产品工艺设计阶段和质量评估阶段，如何更有效地侧重于满足药政评审及确保病人用药安全要求、同时考虑到合成工艺和药物分析耗费负担增加，以及新药上市速度可能的延缓，能否在这三者之间找到一个平衡，都具有一定的参考价值。同时就生产工艺，毒理学关注限度和分析方法方面为出发点，如何与质量控制和药监药政方面顺利地完成遗传毒性杂质的评估提出一些设想。在新药的研发阶段和上市过程中都考虑控制遗传毒性杂质是非常关键的，因为有许多影响因素（比如分析方法方面的稳健性等），研发早期开发分析方法来控制遗传毒性杂质是一项十分具有挑战性的工作，指南文件就临床阶段不同的给药期限给出了不同的允许限度

31、。以结构-毒性相关性方面为出发点，从遗传毒性风险角度，制药界已经广泛接受将杂质分为五类并采取不同的对待方式：1）针对第一类，强致癌性的遗传毒性杂质，TTC（毒理学关注阈值）是不适用的。往往通过工艺上避免、原材料控制来规避这类风险，要避免应用到制药工艺中去；2）第二类遗传毒性杂质，有遗传毒性的风险，没有人体强致癌毒性报道，往往原料带入或工艺过程中产生，除了需要尽量限制引入，生产工艺中做好控制并进行评估也是可能的对待方式，TTC风险工具是适用的；3）第三类杂质，具有警示结构，遗传毒性和人体致癌性都未知，需要考虑从工艺上去控制，直接采用TTC 控制或进一步评估确认，通过细菌突变实验，判断其作为第二类

32、或者按第五类普通类杂质来对待；4）第四类与第五类杂质，现有ICH指南Q3A-C 能够进行指导控制。遗传毒性杂质工艺上考虑，需避免有第一类人体强致癌物的直接引入，作为原料中杂质的间接来源，其可能性也需要基于当前的知识进行评估；第二类与第三类杂质，具有遗传毒性风险，没有人体强致癌性的报道，是遗传毒性杂质指南法规文件所重点研究和关注的，也是合成类小分子新药或应用新工艺时所需要重点具体控制的，从工艺上考虑予以去除，选取或开发足够灵敏的方法来进行评估，并确定控制策略；针对新上市的药品中牵涉到的以上各类杂质，有一个清晰的策略来为满足全球药政市场的要求做积极准备是十分重要的。第3章杂质风险评估流程整个评估流程以针对假定的和/或已知的杂质，以对合成路线的评估开始，接着是对已经认为可能存在的杂质进行结构上的评估，若有可能，和其它合成路线的原料与试剂一起进行评估，危害分类，量化和/或安全测试，风险评估并最终选定合成路线，根据需要，建立检测方法并确定控制策略。在USFDA以及EMA所发布的遗传毒性杂质相关指南基础上，结合英国阿斯利康药厂的Charles Humfrey博士所公开的讲义7，现将基本的评估流程以图3.1的方式呈现如下。这只是一个基本的流程，实际应