REACH法规 第四卷译稿33.docx

1、REACH法规 第四卷译稿33B.33综合慢性毒副作用与致癌作用的检测1. 方法1.1. 引言见引言总章B部分1.2. 定义见引言总章B部分1.3. 参考物质无1.4. 测定方法描述长期综合慢性毒性致癌测定的目的是确认晡乳动物长期使用测定物后致癌因素的影响。致癌性测试结尾部分是用致少一个卫星测试组和对照组进行一个补充测定。在致癌测定中给予卫星测试组的最高剂量可能会高于测试最高剂量组水平。在致癌测定中动物做一个总的毒性检查和致癌反应。在测试组，动物做一个总毒性检查。测定物通过一个合理的方法在动物样品样品的主要生命周期中每周七次，每次一组，给多组动物使用。在测试中和测试后，每天观察动物样品的毒性迹

2、象和癌的发展。1.5. 质量标准无1.6. 测定方法描述在测定之前，动物至少要在测定要求的条件下喂养五天以上。测定幼崽被随意的分配到各组。1.6.1. 动物样品较适宜的物种是小鼠。基于先前测定结果的其它动物也可使用。应使用实验室常用的健康幼畜。且在断奶之后立即使用测定物。研究之初，动物样品的体重差异不要超过平均值的20%。如果在长期性的研究之前有预备性的小型实验，那么在研究中应用相同的品系。1.6.2. 数目和性别对啮齿动物，在每一剂量水和对照组小组至少要有100个动物（雌性50，雄性50）。雌性必须是未生育且未孕的。如果期间准备有动物样品的死亡，那么数目应随实验完成之前预备放弃的数目的增加而

3、增加。除了癌之外，还要做病理学研究的副组应包括每种性别20，而其它测试组则每种性别10个动物。1.6.3. 剂量水平和使用频率为了做致癌测定，除了对照组之外，至少使用三个剂量水平。最高剂量应能导致最小的中毒迹象，如少许的体重的减少（少于10%），切除了癌症之外没有其他影响生命周期的影响。最低剂量不应打扰正常生长，发育和动物样品的寿命或引起任何毒性的迹象。总之，不能高于最高剂量的10%。中间剂量界于最高和最低剂量之间。剂量的选择主要考虑到之前毒性的研究和测定的实验数据。为了长期的毒性测定，测定中还应包括一个额外的处理组和对照组。最高剂量应产生直接的毒性迹象。正常使用频率是每天一次。如果药物是掺杂

4、在饮用水或食物中使用必须是连续可得的。1.6.4. 对照组应使用一个除了不使用测定物之外，其它任何一方面都和测定组一样的对照组。在一些特殊情况下，如涉及到喷物剂的吸入性研究或用到乳化剂的无特征生物活动的口饲研究，还必须使用一额外的不使用该处理的对照组。1.6.5. 给药途径三种主要的给药途径是：口饲，皮肤的，呼吸。给药途径的选择主要取决于测定物的物理和化学特性以及可能的在人身上使用的方式。1.6.5.1口饲测定当测定无能被食道吸收，并且该种途径也适用于人类，除非有禁忌症象，这种途径是优越的。可以和食物，溶解在饮用水或胶囊的方式给动物使用。理想上，应该每周七次用量，如果每周五次，在不使用药剂的阶

5、段动物可能恢复并使毒性消失，从而影响结果和后面的评估。然而，基于实际考虑，每周五次的剂量仍可接受。1.6.5.2皮肤性测定皮肤注射可被选用来模拟人类的使用方式且被用作引发皮肤损伤的示范体式。1.6.5.3.吸入性测定因为吸入性比其它流程表现出更为复杂的技术问题，这里给出这种使用方式的更多细节。必须注意，在某些特殊场合下，气管内输入可能有其它的选择。长期服用往往基于人类的使用方式。在测定室浓度平衡后，每周五次，每次6小时，或基于外界的使用，即每周七天，每次22-24小时，并在每天的相同时间一个小时的喂养时间。动物被测定以一定浓度的测定物。间歇使用和连续使用的一个主要的区别是间歇使用时动物每天都有

6、17-18个小时的恢复期，在周末则更长。选择何种使用方式主要取决于研究的目的和模拟的人类使用方式。然而，必须考虑到某些技术难题。例如，连续实验的优点可能由于测定中需不停的喂水和喂实，且需更复杂的喷雾和蒸气的产生和监听技术而取消。1.6.6. 测定室动物样品的测定室应该设计用来取得长期的至少每小时12次换气来确保足够的氧气和均匀的大气氛围。对照组室的设计和建造必须和测定室一致以保证除了在使用测定物之外在其它任何方面都是可比的。测定室里必须维持少许的负压力以防测定物渗出。测定室应尽可能的降低动物样品的密度。总的，为了保持测定室里空气的稳定性，动物样品的总体积不应超过测定室体积的5%。测量和监控包括

7、：(1) 气流：通过不停的监控保持测定室气流速度适宜。(2) 浓度：在日常服用期间，测定物浓度不应超过平均值的15%，在该项研究周期间，每天浓度应尽可能保持一致。(3) 温度和湿度：对啮齿类动物，温度控制在222。C，室内湿度在30-70%，除非使用水将测定物悬浮在空气中。不停控制使两者适宜。(4) 粒子尺寸测量：测定室里大气中液体或固体喷雾剂粒子的分布必须确定。喷雾剂粒子尺寸应为动物呼吸尺寸。测定室大气中的样本被吸入动物呼吸区。气体样本应能代表动物使用的粒子且应能解释所有的悬浮粒子，即使大部分是不能呼吸的。在体系产生过程中应不间断的分析粒子的尺寸，以确保喷雾剂的稳定性且在测定期间尽可能准确测

8、定动物测定时的粒子分布的稳定性。1.6.7. 测定期间致癌测定过程包括了动物正常生命周期的主要部分，测定期对小鼠和仓鼠来说为18个月，大鼠24个月。然而，对某些寿命更长或自然癌症发生率很低的动物，小鼠和仓鼠的终止期为24个月，大鼠30 个月。当最低剂量组和对照组的生存率达到了25%，终止期可适当延长。分析时，不同性别的反应不同时，应分别考虑。如果只有最高剂量组由于明显的毒性过高而提早死亡时，考虑到毒性显示不对其它组造成影响，不必立即结束测定。对一个可接受的负反应，任何一组不能多余10%由于组织自溶、同类相食和管理问题而死亡。对老鼠和仓鼠来说，每组在18个月时生存率不能少于50%，大老鼠则24个

9、月不少于50%。用来做长期性研究的每个性别20个动物样品的副组和每个性别10的对照组动物至少应存活12个月。这些动物是用来做排除衰老改变之外的测定物相关的病理学检查。1.6.7. 测定步骤1.6.8.1观察每日的笼边观察应包括：皮毛的改变、黏膜的改变，但又不局限于这些，还应包括呼吸、循还、自制力、中枢神经系统和行为方式的改变。测定组动物在合适的间隔就应做一次诊断检查。经常观察动物是必要的。为了保证动物尽可能不因组织自溶、同类相食，放错而在研究中损失经常观察动物是必要的。一旦发现死亡的动物应立即移走并埋葬。诊断迹象包括：动物神经的和眼球的变化及死亡都应记录。癌症的观察必须特别仔细：开始时间、位置

10、、大小和外型。每一可见或可触的肿瘤都必须记录。在最初的13周必须记录食物的消化如果测定物掺在水中水的消耗量也必须记录），然后是大约每三个月的间隔，除非动物样品的体重明显改变。在最初的13 周内所有动物样品的体重都应记录，每周一次，以后每四周一次。1.6.8.2诊断血液检查在三个月，六个月做一次血液检查（如：血红蛋白含量，细胞体积，总的血红细胞，总的白细胞，血小板，凝结能力的测量），以后大约每个六个月做一次。终止时，每组每个性别10个大鼠的血液样本做血液检查。如果可能，每次样本来自同批大鼠。如果笼边观察显示研究过程动物样品的健康有明显的恶化，那么必须做一个区别性的血检。最高剂量组和对照组的样本都

11、做一个区别性的血液检查。当最高剂量组和对照组有明显的差异或病理学研究需要才在相邻的较低剂量组做血液检查。尿检从所有的非啮齿目动物和所有组中每种性别各10只小鼠身上提取尿样，如果可能，在同样的时间间隔从同样的小鼠中收集以供血液学测定分析。以下各项测定应在个体动物或啮齿目动物组中每一性别的集中样品中进行：- 外观: 个体的动物体积和密度,- 蛋白质，葡萄糖 , 酮类, occult血,(半-定量)- 沉淀物的显微放大.(半-定量)临床化学大约每隔六个月一次和在结尾，要从所有的非啮齿目动物和所有组中每种性别各10只小鼠身上抽取血样以供临床化学测量，如果可能,每次从相同的小鼠上抽取。除此之外，应从非啮

12、齿目动物中收集一个预测试样品。从这些样品中制备血浆。随后的测定包括:- 总蛋白质浓度,- 蛋白质浓度,- 肝功能测试 ( 例如：碱性磷酸酶的活动, 谷氨酸丙酮酸转氨酶10活动和谷氨酸丁酮二酸转氨酶11活动),谷氨酰转肽酶, 鸟氨酸脱羧酶,- 糖代谢 , 比如快速的血葡萄糖,- 肾功能测试 , 比如血尿素氮。完整的解剖应该在所有的动物上实施完整的尸体剖检，包括那些在实验中死去的或因被发现将死而被杀掉的。在死亡之前,应从所有的动物中收集血样,以供血球数差别测定。所有可见的肉体损伤，肿瘤或疑似肿瘤的损伤都应该被保存。应尝试使用显微镜研究以联系所有的观察。所有的器官和组织应该被保存以供组织病理学测定。

13、 这通常与下列各项器官和组织有关: 脑12( 延髓/脑桥 ,小脑皮层，大脑皮层 ),垂体, 甲状腺 ( 包括副甲状腺),胸腺，肺(包括气管),心,主动脉,唾液腺，肝脏(3)，脾脏，肾脏(3)，肾上腺(3)，食管,胃,十二指肠，空肠，回肠，盲肠 ，结肠，直肠 ,子宫 ,尿膀胱,淋巴结,胰脏，生殖腺 (3),附属生殖器,雌性的乳腺，皮肤,肌肉组织,周围神经，脊髓 (颈，胸,腰的), 胸骨及骨髓，大腿骨(包括关节)和眼睛。用固定剂使肺和膀胱胀大是最理想的保护这些组织的方法;在吸入研究中扩张肺是必要的以供组织病理学研究。在特殊的研究 ,比如吸入研究中,整个的呼吸器官都应被研究,包括鼻子，咽和喉。如果实

14、施了其他的临床测定,从这些程序获得的信息应在显微测定前可得到，因为它可能对病理学有重要的指导。组织病理学慢性毒性测试部分：高剂量卫星测试组和对照组的所有动物的所有保存的器官都应进行详细的检查。如果高剂量卫星测试组发现与测试物有关的病理，那么任何其他高剂量测试组的所有其他动物的目标器官都要进行全面详细的组织学检查，这与测试终止时的致癌性测试部分的兴奋组一样。致癌性测试部分：（a） 在测定期间死亡或放弃的动物和最高剂量组和对照组的动物都应做全面的组织病理学检查。（b） 在所有组中任何肿瘤或被怀疑可能引起肿瘤的损伤均应做仔细的显微镜检查。如果损伤发生率在高剂量组和对照组存在明显的差异，在其它组该器官

15、或组织应用组织病理学检查。（c） 如果高剂量组的存活率明显少于对照组，那么相邻较低剂量组应仔细观察。（d） 如果在高剂量组有能引起肿瘤反应的毒性的诱发或其它影响，相邻较低剂量组应仔细检查。 （e） 如果有显著的证据表明最高剂量组能够导致毒性或其它影响癌症反应的效果发生，则下一剂量水平应当被全面检查。2. 实验数据实验数据应总结成表格的形式，表明每个测定组在测定开始时动物样品的数目，在测定中被探知有肿瘤或毒性效应的动物数目，探测时间，死后被发现有肿瘤的动物样品的数目。结果应用合适的统计方法评估。可以使用任何经过证明的统计方法。3. 实验结果报告3.1. 实验结果报告如果可以的话，实验结果报告应包

16、括以下内容：- 种类，种族，来源，环境状况，食物；- 实验条件；3.1.1. 接触仪器描述包括设计，种类，尺寸，颗粒及烟雾产生系统，空气调节方法，废气处理，关在测定房内的动物样品的饲养方法。测量温度湿度的器材，需要的话，描述烟雾浓度和颗粒大小。3.1.2. 接触实验数据将实验数据列成表格形式，列出平均值，实验数据的变化尺度（如标准差），同时包括以下内容：1 吸气器材的气流量；2 空气温度，湿度；3 名义浓度（进入吸气装置的测定物总量除以空气体积）；4 使用的赋形剂特性；5 颗粒平均大小(合适的)- 试剂等级（包括用到的赋形剂）和浓度；- 肿瘤发生率实验数据，包括性别，剂量和肿瘤类型；- 研究周期间动物样品的死亡时间，或动物是否幸存，包括附属群；- 中毒情况，包括性别和剂量；- 描述中毒或其它作用的作用；- 反常现象的出现时间和随后的发展；- 眼球出现的症状；- 食物和体重实验数据；- 所使用的血液病理学测定和结果；- 所使用的临床生化测定和结果（包括所有的验尿结果）；- 详细描述组织病理学上的所有现象；- 结果的统计学处理和所用方法的描述；- 结果讨论；- 结果说明；3.2. 实验结果评估和解释见描述部分B4. 参考文献见描述部分B