绿色荧光蛋白GFP基因的克隆与表达.docx

1、绿色荧光蛋白GFP基因的克隆与表达分子生物学综合实验论文题 目:绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达中国黄石2010年12月 绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达胡丽丹（湖北师范学院生命科学院0803班 湖北 黄石 43500）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28经过BamHI和Not I双酶切连接后，得到pET-28-pEGFP-N3重组质粒。取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌E. coLiBL-21大肠杆菌感受态细胞中。重组有GFP基因的E.

2、 coLi BL-21，在含有1L/mL的卡纳霉素的LB培养基上培养。当A600达到0.7时，用终浓度为0.8mM的异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆 荧光蛋白 水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight,College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstr

3、act：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,has been found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28was harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treatin

4、g the two targeted plasmids withBamHIand Not I,the recombinant plasmid,namely pET-28-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis.Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(BamH I and Not I).The recombinant plasmid leftin

5、g would be transported to E. coLi BL-21the competent cells. E. coLi BL-21containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 L/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL -D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the

6、incubation was continued an addition 3 h.Key words:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin 前言：1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）1.1.1 GFP研究背景绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光1。日本科学家下村修 1962年第一次从一种水母中发现了绿色荧光蛋白, 如图一所示。这种蛋白在紫外线光中呈现绿色, 这种水母体内含有一种生物发

7、光蛋白质aequorin，但它本身发蓝光,通过对光谱的研究, 下村修提出了发光景水母所发的绿光是因激发的水母素向绿色荧光蛋白图一：夜晚水母体内GFP显色4 Figure1 Chromogenic GFP in Fellyfish at night4 发生的荧光能量转移所致。即水母素作为一种能量供体, 而绿色荧光蛋白成为能量受体。水母素和绿色荧光蛋白都有重要的应用, 但水母素是荧光酶的一种, 它需要有荧光素底物, 经过酶促反应后发光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。其在阳光下呈绿色、 钨丝下呈黄色、 紫外光下呈现强烈绿色2。1987年，道格拉斯普莱沙（D

8、ouglas Prasher）克隆出了GFP的基因序列。1993年，在普莱沙的基础上，马丁沙尔菲（Martin Chalfie）成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物（如大肠杆菌等）也能产生GFP，这不仅证实了GFP与活体生物的相容性，还建立了利用GFP研究基因表达的基本方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。此后，谢尔盖路基亚诺夫（Sergey A. Lukyanov）又从一种珊瑚中分离出了与绿荧光蛋白类似，但能发出红色光的荧光蛋白，预示着荧光蛋白可以有不同的颜色。美籍华人钱永健（Roger Y. Tsien）系统地研究了绿荧

9、光蛋白的工作原理，。钱永健还对绿色荧光蛋白进行了颜色突变。不同颜色可以同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构。多种颜色的绿色荧光蛋白的出现, 为研究蛋白之间的相互作用、蛋白分解等提供了无限的可能性。现在世界各地实验室使用的 GFP , 都是经过改造优化了的, 而钱永健是这方面的先驱和领先人物2。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二. 长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是

10、由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成2。图二：GFP晶体结构 图三: 质粒pEGFP-N35Figure2 Crystal structure of GFP Figure3 pEGFP-N352001年1月11日，美国科学家宣布培育成世界上首只转基因猴, 这是世界上首次培育成功转基因灵长类动物. 添加在这只名为安迪的猴子体内的就是这种标志基因。1.1.2 GFP研究应用在生物学研究中，科学家们更多的是利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原

11、本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。但传统的荧光标记在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导至被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性”。因此，在GFP发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构。相反，绿色荧光蛋白对生物体无毒无害, 分子量小, 方便构建载体, 同时在多种非水母的生物体中均可稳定表达并易于检测, 所以, 作为一种生物分子标记, 具有广泛的应用前景 3。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能, 是一种现成的荧光蛋白质，荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。本实验是利用实验室提供的质粒

12、pEGFP-N3,其结构如图三所示.其上有所用酶的酶切位点。1.2基因的克隆与表达基因克隆（分子克隆molecular cloning）-通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。如下图四所示:所需元件:限制性内切酶:BamH I和Not I（BamH I的切点为：5-GGACC-3 Not I的切点为 5-GCGGCCGC-33-CCTAGG-5 3-CGCCGGCG-5载体: E. coLi DH5a（1.易于接纳外源DNA。 2.无特异的内源性核酸内切酶 3.载体复制、扩增不受阻 4.与质粒有互补性)受体细胞: E. coLi

13、 BL-21（1.易于接纳外源DNA。 2.无特异的内源性核酸内切酶 3.载体复制、扩增不受阻 4.与载体有互补性）目的基因:pEGFP-N3选择标记基因：pET-28（同时含有抗kana的基因有助于后面选择，和-半乳糖苷酶基因可被异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达目的基因GFP）连接：平末端连接（相同酶切产生互补的粘性末端，再通过碱基互补配对连接）图四：基因克隆的过程Figure4 Process of gene cloning原核基因表达系统（Gene Expression）： 由于目前对原核生物基因结构了解的要透彻一些，所以一般将目的基因导入到原核生物中。将外源基因引入原核细胞

14、，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。如图五所示。为提高GFP表达的效率，我们一般可从以下三个方面考虑：1.基因水平上:尽量选用受体细菌细胞的偏爱性密码子62.载体水平上:通过核外质粒构建合适的操纵子、增强子6,如本实验的-半乳糖苷酶操纵子基因,故通过异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达目的基因GFP表达3.作为受体细胞上:根据DH5a和E. coLi BL-21结构特点不同,前者对外援质粒扩增阻碍作用很小,故作为克隆菌;后者易于外源基因表达,故选用表达菌。图五：基因克隆与表达Figure5 Gene cloning & expression本实验是应用已学

15、过的分子知识和查阅一些参考文献，来设计老师给定的实验课题。第一，是学习运用科学理论知识指导设计实验使用方法；第二，学习科学严谨的实验操作；第三，查阅文献了解并学习了绿色荧光蛋白基因（GFP）相关特性和研究进展，巩固理论知识的同时也开拓了我们的视野。本实验我们做了以下工作：将绿色荧光蛋白基因（GFP）插入pET-28构建pET-28-pEGFP-N3重组质粒，将重组质粒导入E. coLi DH5扩增，用碱法提取质粒。核酸电泳检测质粒是否成功导入大肠杆菌，再酶切鉴定所提取质粒是否为重组质粒。将提取的质粒导入E. coLi BL-21感受态中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白（Green

16、fluorescent protein,GFP ）。本试验通过做实验过程中，王老师细心地指导及斧正以及同组同学的协商配合，最终实验结果大抵让人满意。在表达菌E. coLi BL-21中表达了我们期望的结果绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP ）。但此试验在LB培养基平板上生长效果不是很好，酶切效果也不是那样完美，在以后的实验设计中要进一步完善这两部分的工作。2.实验试剂及实验仪器：2.1实验试剂与材料：1.克隆菌株EcoLi DH5(8311实验室提供)2.表达菌株EcoLi BL21(8311实验室提供)3.LB培养基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、

17、10 g氯化钠，溶于950 mL中，用NaOH调节pH至7.0，补加蒸馏水至总体积为1 L，分装后高压蒸汽灭菌。（对于固体培养基加入10-15 g琼脂粉后再加热灭菌）4.溶液: 50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCL(pH 8.0)，10 mM EDTA(pH 8.0）。1 M Tris-HCL(pH 8.0）12.5 mL，0.5 M EDTA（pH 8.0）10 mL，葡萄糖4.730 g，加ddH2O至500 mL。在10 Lbf/in2高压灭菌15 min ，贮存于4 。5.溶液：0.2 M NaOH，1% SDS。2 M NaOH 1 mL，10%SDS 1 mL，加ddH2

18、O至10 mL。使用前临时配置。6.溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加ddH2O至500 mL。4 保存备用。7.TE：10mM Tris-HCL(pH 8.0)，1 mM EDTA(pH 8.0)。1 M Tris-HCL（pH 8.0）1 mL，0.5 M EDTA（pH 8.0）0.2 mL，加ddH2O至100 mL。15 Lbf/in2高压湿热灭菌20 min，4 保存备用。8.氯仿（1:1）9.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）10.50TAE：Tris 碱54 g，硼酸27.5 g，EDTA-Na22H2O 4.65 g，

19、加ddH2O 至1000 mL。15 Lbf/in2高压湿热灭菌20 min，4 保存备用。11.溴化乙锭（EB）：10 mg/mL12.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10 mg/mL，TE配制，沸水加热15 min，分装后贮存于-20。13. 6Loading buffer（上样缓冲液）：0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。14.0.8% 琼脂糖凝胶：称取0.4 g琼脂糖于三角烧瓶中，加50 mL 1TAE，电热套加热至完全溶化，冷却至60 左右，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静

20、置冷却30 min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1TAE），即可上样。15.双酶切体系：DNA sampLe 8 L, BamHI 0.5mL（大连宝生物公司提供）, Not I 0.5mL（大连宝生物公司提供）,BufferH 2 mL,Triox-100(0.1%) 1uL,BSA(0.1%) 1 L, ddH2O 6 L16.10Buffer H：100 mM Tris-HCL PH7.5,100 mM MgCL2,10 mM Dithiothreiol500 mM NaCL17.0.1 M CacL218.IPTG，kana固体粉末2.2实验仪器：ORION pH计（上海

21、公司）,HD-3紫外检测仪（日本有限公司）GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司）电泳仪DYY-5（北京市六一仪器厂）电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司）BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂)高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司），手持式紫外灯双面紫外超净工作台（苏州净化设备有限公司）,电热套3.实验方法3.1质粒提取方法:方法分别有以下几种：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或

22、离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。对于本实验要求提出大量的质粒，且为使操作简便故选用SDS碱裂解法。其基本原理：（1）当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。（2）在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于

23、分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样）其具体操作步骤如下：1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20 mL LB（含Kana1L /mL）液体培养基中，37 、200rmp振荡

24、培养过夜（约14h）。2. 取1.5mL培养液倒入1.5 mL eppendorf管中，10000rmp离心1min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上，使液体尽可能流尽。3、菌体沉淀重悬浮于200 L溶液中, (需剧烈振荡，使菌体分散混匀。)室温下放置3 min。4、加入新配制的溶液300 L，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴3 min。5、加入200 L预冷的溶液，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3min。 12000rmp离心3min。溶液为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，

25、同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。6、上清液500 L移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀, 12000rmp离心10min。（500 L的苯酚/氯仿/异戊醇。）7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心10000rmp2min。8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1mL 70乙醇洗沉淀一次，10000rmp离心10 min。9、 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。10、将沉淀溶于20 L TE缓冲液(pH8.0储于-20冰箱中。)3.2琼脂糖凝胶电泳及回收:实验原理：琼脂糖

26、凝胶电泳的原理概述 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是d-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（1）DNA分子的大小 双链DNA分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移的越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（2）琼脂糖浓度 给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关。（3）DNA的构象 超螺旋环状（型）、切口环状（型）和线状（

27、型）DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和型超螺旋绞紧的程度或密度。一些条件下，型DNA比型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。（4）所用的电压 低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm。（5）电泳缓冲液 DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电导率降低，DNA或者不动或者迁移很慢。高离子强度时（如10buffe

28、r），电导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性。具体操作步骤：1.1.0.8%琼脂糖凝胶的配制：精确称取0.4 g琼脂糖加到三角瓶中，加50 mL 1TAE缓冲液于三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，冷却至60 左右，2.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；3.轻轻旋转琼脂糖凝胶以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4.室温下45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6.在DNA样品中加入10体积的载样缓冲液

29、（Loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般100V电压，电泳40min即可；8.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。 10.同原质粒一起琼脂糖凝胶电泳鉴定回收片段。根据亮度可以估计回收的量。11.待回收的DNA段经电泳分离后，从琼脂糖凝胶上切下所需DNA段，放在1.5 mL EP管中；12.加入3 倍（请准确估量凝胶的体积）体积的溶胶液（

30、以100 L 体积胶加入300 L溶胶液为一次标准反应），室温下放置5分钟或50 保温3分钟，其间轻摇EP管几次使胶完全融化；13.加入10 L玻璃奶（玻璃奶使用前请充分摇匀），颠倒混匀，冰浴下放置10分钟。每隔23分钟混匀一次，12000rpm离心30秒，吸弃上清；14.加250 L漂洗液（浓缩漂洗液使用前，按浓缩漂洗液：无水乙醇= 3：7配制成工作浓度），用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀，12000rpm离心30 秒，吸弃上清；15.重复步骤4（尽量吸尽漂洗液）。吸取完漂洗液后再离心10秒钟，用Tip头将最后一点儿漂洗液吸干净。然后，放置于37烘箱干燥直至沉淀呈白色，约1520分

31、钟；16.加适量洗脱缓冲液即无菌水（20 L为一次标准反应），混匀，60 水浴5分钟，12000rpm离心1分钟，回收上清备用。重复步骤6，能提高回收率。3.3酶切及连接：实验原理：迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。5-GAATTC-33-CTTAAG-5II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别GAATTC；Hind III识别AAGCTT;Bam HI识别GGATCC; Not I识别GCGGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如BgL I识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：(i)两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoR I酶切后产生末端；(ii)两条链的断裂位置处在一个对称结构5