转基因抗虫水稻中重金属铅镉铜铬铁含量的测定.docx

1、转基因抗虫水稻中重金属铅镉铜铬铁含量的测定毕 业 设 计 （论 文）题 目：转基因抗虫水稻中重金属铅、镉、铜、铬、铁含量的测定英文题目：Determination of Pb, Cd, Cu, Cr and Fe in Transgenic insect-resistant rice by Atomic Absorption Spectrometry学生姓名 学 号 指导老师 职称 专 业 二 零 零 九 年 四 月 十 日转基因抗虫水稻中重金属铅、镉、铜、铬、铁含量的测定摘要：本实验对转BT抗虫品种的转基因水稻进行湿法消解预处理，处理液采用石墨炉和火焰原子吸收光谱法进行检测，测定重金属铅、镉

2、、铜、铬、铁的含量，并做加标回收实验。按照相同方法处理非转基因水稻，并测定其重金属的含量，通过比较，发现该品种的转基因水稻与非转基因水稻中这五种重金属的含量没有明显差别。关键词: 转基因水稻 ；重金属；原子吸收光谱法 Determination of Pb, Cd, Cu, Cr and Fe in Transgenic insect-resistant rice by Atomic Absorption SpectrometryAbstract ：A simple procedure was developed to determine contents of heavy metals in

3、 BT to transgenic insect-resistant rice varieties. After wet digestion of samples, five heavy metals, Such as Pb, Cd, Cu, Cr and Fe were determined by flame atomic absorption spectrometry (FAAS)or graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS) with regard to their concentrations, respective

4、ly. The experimentsof standard addition were carried out to validate the proposed method, and good recoveries are present. According to theobtained concentrations of Pb, Cd, Cu, Cr and Fe in the transgenic rice and the non-transgenic rice, a conclusion canbe made that there is no obvious difference

5、in the contents of heavy metals between the two types of tested samples. Key word: Transgenic rice ; heavy metals；atomic absorption spectrometry目 录摘要关键词Abstract Keywords绪论 11转BT抗虫品种的转基因水稻的介绍和研究现状. 11.1转BT抗虫品种的转基因水稻的介绍 11.2转基因抗虫水稻的研究进展 22重金属检测方法研究 42.1样品前处理.42.2检测方法.53本研究的目的意义.81 实验部分 91.1仪器和试剂 91.1.

6、1仪器 91.1.2试剂和材料 91.2 实验方法 91.2.1原料处理 91.2.2样品测定条件 91.2.3样品预处理 111.2.4工作曲线的绘制 121.2.5样品测定 121.2.6数据分析 122实验结果与分析 122.1测定条件的优化.122.1.1铅、镉、铜和鉻测定条件的优化. 122.12铁测定条件的优化.142.2共存离子干扰.152.3检出限及精密度.152.4样品测定结果.163结论 164发展前景 17致谢 .18参考文献 19绪论:随着对转基因食品研究的不断深入，人们逐渐认识到转基因食品是一把“双刃剑”，在带来巨大经济效益的同时，也带来一些负面问题，尤其是人们日益关

7、注的食品安全问题1-2。转基因食品中重金属含量的检测及影响也逐渐引起人们的关注。Diopan 等3研究表明，MT- 转基因植物能评价重金属累积的能力；芮玉奎等4借助ICP-MS 测定转基因玉米及其亲本中重金属的含量。结果显示，外源基因的整合导致了转基因玉米重金属(Ni、C u 、Cd 、As 、Cr 、Z n 和Hg) 含量显著低于亲本对照，两对转基因抗虫玉米及其亲本对比结果相似；但是有的重金属(V、Co、Pb)含量与对照相比变化没有明显规律；他还系统研究了转基因棉花和对照纤维中重金属含量影响结果说明，外源基因的导入能够显著改变转基因棉花纤维中微量元素和重金属的累积5。目前我国对水稻的转基因研

8、究相当活跃，水稻的遗传转化技术也已经比较成熟6。水稻作为人类主要粮食作物之一，直接参与人的食物链，也就是说水稻中的重金属也会进入人体并有可能蓄积。国内外学者曾对非转基因的水稻进行过研究7，但有关转基因水稻中重金属含量的研究目前尚未见报道。本实验采用湿法消解-原子吸收光谱法测定转BT抗虫品种的转基因水稻中的铅、镉、铜、铬、铁五种重金属的含量，并做了加标回收实验。用相同的方法处理及测定非转基因水稻中五种重金属的含量，通过两者结果进行比较，分析它们积累重金属的能力差别，以此为转基因水稻的食用安全性提供基本的参考依据。转BT抗虫品种的转基因水稻的介绍和研究现状转BT抗虫品种的转基因水稻的介绍 在过去的

9、30 多年中,国际水稻所对30 000 多份水稻品种资源进行了抗虫鉴定,但没有发现一份理想的抗螟虫材料。随着植物细胞生物学和分子生物学的发展,利用生物基因工程技术将外源抗虫基因导入水稻,使水稻自身产生抗虫蛋白而达到抗虫目的成为可能,这项研究吸引了国内外众多科学家。生物工程技术是传统作物改良方法的补充和完善,它使得任何两个物种都可自由地得到彼此基因库的基因而不受进化方式或血缘关系的限制。国家自然科学基金会把转基因技术列为我国植物遗传学和植物遗传改良的近中期战略目标与研究重点8 。在本世纪80 年代初,人们克隆了几种苏云金杆菌基因,并把这些基因导入了烟草、西红柿等高等植物,但由于所得转基因植株的B

10、. t . 毒蛋白基因转录的mRNA 不稳定,以及翻译水平低等原因,转基因植物的杀虫能力较低。90 年代以来,科学家们对B. t . 毒蛋白基因进行了修饰,逐步提高了B. t . 基蛋白基因在转基因植物中的表达水平911 。苏云金杆菌( Bacillus thuringiensis ,简写为B. t . ) 是一种能产生杀虫晶体蛋白的土壤杆菌。这种细菌作为一种生物杀虫剂已使用了近30 年。B. t . 能产生一种使害虫消化道丧失功能的蛋白质,害虫取食后在碱性的肠道中被溶解为前毒素单体,然后经肠道蛋白酶活化降解成具有毒性的多肽,活化的毒素作用于中肠上皮细胞,从而引起明显的病理变化,例如肠细胞壁破

11、裂,肠壁崩裂12 。目前,从B. t . 克隆的Cryl (A) b 和Cryl (A) c 基因用于导入水稻,这两个基因仅3端的495 个碱基存在差异10 。转基因抗虫水稻的研究进展比利时Adang 在1985 年首次报道了转B. t . 基因的烟草植株 ,之后美国孟山都公司、中国农科院以及江苏农科院经作所也先后把B. t . 基因导入棉花。1989 年中国农科院生物技术中心杨虹等首次报道了用原生质体电融合技术将B. t . 基因导入水稻“台粳209” ,1991年谢道昕又用花粉管通道技术将B. t . 基因导入水稻栽培品种“中花11 号”。杨虹、谢道昕所用B. t . 基因是直接从苏云金杆

12、菌中分离纯化得到的,经分子生物学检验,证明B. t . 基因已整合到水稻基因组中13 。但是,这些开创性的研究未见后续报道。日本植物研究科学家Fujimoto1993 年用原生质体电激法获得了转B. t . 基因粳稻植株,并检测出B. t . 蛋白量占可溶性总蛋白的0. 05 % ,对水稻二化螟和纵卷叶螟二龄幼虫的最高致死率分别达45 %和55 % ,并首次报道了经修饰的Cryl (A) b 基因能在转基因植株中高效表达,并能稳定地遗传到R2代,也首次提出了昆虫对B. t . 基因产生抗性的预防策略 9 。瑞士苏黎士植物科学研究所Wnn1996 年报道了用基因枪法将Cryl (A) b 基因导

13、入籼稻“IR58”,在R0 、R1 、R2代对鳞翅目水稻害虫有明显杀虫效果,对二化螟、三化螟的最高致死率为100 % ,并从叶片中检测出B. t . 蛋白量占可溶性蛋白的0. 009 % ,还指出B. t . 蛋白表达量随着水稻的生长发育而呈逐渐增加的趋势14 。印度持续农业与农村发展研究中心Nayak 1997 年报道了用基因枪法将Cryl (A) c 基因导入籼稻“IR64”,同时选择了玉米Ubi 基因(玉米泛素转移蛋白基因) 作为Cryl (A) c 的启动子。研究指出Cryl (A) c基因在“IR64”中表达更有效,检测出毒蛋白量约为可溶性蛋白的0. 02 %0. 025 % ,对三

14、化螟的最高致死率为92. 4 % ,并对Cryl (A) c 基因的遗传行为作了研究,F1测交抗感比例为11 ,F1自交F2抗感比例为31 ,故Cryl (A) c 基因表现为单基因显性遗传15 。国际水稻所( IRRI) Ghareyazi1997 年报道了用基因枪法得到转Cryl (A) b 基因的香粳品系“827”,能表达分子量为67KDa 的毒素蛋白,表达量相当于可溶性蛋白的0. 1 % ,T2代植株叶片对一龄二化螟、三化螟有高度抗性,同时, IRRI 的这项研究用玉米C4PEP 羧化酶基因为启动子,并指出该启动子使Cryl (A) b 基因在水稻籽粒灌浆期功能叶片中高效表达,而在水稻

15、籽粒中即胚和胚乳中不表达,这项研究结果对解决人类食用抗虫水稻稻谷的安全性问题提供了思路16 。1998 年加拿大渥太华大学生化系农业生物技术实验室Cheng 等报道,用“农杆菌介导法”将以玉米Ubi 基因为启动子的Cryl (A) b、Cryl (A) c 基因导入水稻,获得了B. t . 蛋白高效表达的转基因植株。在R0代检测出高达1 %3 %的可溶性蛋白含量,较以往的报道高出10100倍,R1代植株高抗二化螟、三化螟,致死率为97 %100 %10 。浙江农业大学1998 年也用农杆菌介导法成功地将加拿大渥太华大学惠赠的B. t . 基因导入水稻栽培品种“秀水11”,并获得稳定的B. t

16、. 转基因品系“Ts5”、“Ts9”,并检测出B. t . 毒蛋白的含量占可溶性蛋白的0. 5 %3 % ,对二化螟、稻纵卷叶螟的15 龄幼虫有100 %的毒杀作用。遗传研究认为转基因表现为单位点显性遗传,并首次报道了转基因已稳定地遗传到第5代11 。渥太华大学和浙江农业大学所得转基因品系B. t . 毒蛋白的高效表达,可能与所用转基因技术、启动子、B. t . 基因中G+ C 碱基含量等因素有关。此外,1997 年国际水稻所植物遗传育种和生物化学系报道了用基因枪法把以水稻Actl 基因作为启动子的B. t . 基因导入粳稻品种“台粳309”,对三化螟高抗,最高致死率为100 %。同年中国中山

17、大学生物工程中心许新萍也报道了将以Actl 为启动子的Cryl (A) b 基因导入“台粳309”。这两篇报道都没有检测转基因植株的B. t . 毒蛋白表达量,对所用的启动子的应用前景未作评价。综上所述,自80 年代以来,国内外的转基因抗虫水稻育种研究发展经历了3 个阶段,即应用野生型B. t . 基因阶段、对B. t . 基因进行修饰阶段和启动子选择阶段,通过这些研究,逐步提高了转基因水稻的抗虫水平。但从事这些研究的人员主要是分子生物学家,缺乏遗传育种和昆虫专家参与合作,故对育种利用有关的遗传问题及开发这些转基因材料的实用价值未作深入研究。重金属检测方法研究 目前,重金属尚没有严格的统一定义

18、,一般指比重大于5 的金属,约有45 种,如铜、铅、锌、铁、钴、镍、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等。尽管锰、铜、锌等重金属是生命活动所需要的微量元素,但大部分重金属如汞、铅、镉等并非生命活动所必需,而且所有重金属超过一定浓度对人体都有毒。在环境污染方面的重金属主要是指汞、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重金属元素。如果重金属元素未经处理就直接排入河流、湖泊或海洋,或者进入土壤中,由于它们不能被生物降解而使这些河流、湖泊、海洋和土壤受到污染。在食物链的生物放大作用下,它们成千百倍地富集,最后进入人体。如鱼类或贝类积累的重金属被人类所食,或重金属被稻谷、小麦等农作物吸收后被人类食用,重金属就会

19、进入人体,使人产生重金属中毒,轻则发生怪病(水俣病、骨痛病等) ,重则导致死亡。其次,重金属在人体内能和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用,使它们失去活性,也可在人体的某些器官中累积,造成慢性中毒,重金属超标引起的中毒事件不胜枚举。样品前处理在样品中,重金属一般以化合态形式存在。因此,在检测时需要对样品进行前处理,使重金属以离子状态存在于试液中才能进行客观准确地分析。此外,样品的前处理是为了去除干扰因素,保留完整的被测组分,或使被测组分浓缩。传统的方法主要有湿法消化和干法灰化。湿法消化是在适量的食品样品中加入硝酸、高氯酸、硫酸等氧化性强酸,结合加热来破坏有机物。由于高氯酸湿法消解便于普及,已被广泛

20、采用。但在消化过程中,该法易产生大量的有害气体,存在爆炸的潜在危险;同时,在消解过程中要消耗大量的酸而可能引起较大的空白值。干法灰化是在高温灼烧下使有机物氧化分解,剩余的无机物供测定。此法能降低污染,但消化周期长、耗电多、被测成分易挥发损失;坩埚材料有时对被测成分有吸留作用,致使回收率降低,因此又有很多改进的干法与湿法处理过程。微波消解作为样品分析的新技术,由于具有消化样品能力强、速度快、消耗化学试剂少、金属元素不易挥发损失、污染小及空白值低等优势,一次样品处理后就可同时测定几种元素。通常取很少量即可达到分析的灵敏度,如王国玲等人用微波消解结合原子荧光光谱法测定化妆品中的铅,方法简便快捷、精密

21、度和准确度好、灵敏度高、线性范围宽以及节省试剂等特点适用于各类化妆品中铅量的测定17。军国建立了一种梯度升压微波消解样品、氢化物原子英光光度法同时测定水样中的砷、汞方法。在优化条件下,水样中砷的回收率为95. 9 % 102 %、汞的回收率为98 % 105 %18,相对标准偏差为7 %。李俊玲等应用微波消解前处理测定保健食品中铅、砷和汞的含量。同时将本方法测定结果与国标法规定的方法进行比较,差异无显著性,但是本方法要简便得多,便于一般实验室进行保健食品的定量分析19。检测方法1、原子荧光光度法(AFS) 是通过测量待测元素的原子蒸汽在辐射能激发下所产生荧光的发射强度来测定待测元素的一种分析方

22、法。翟毓秀等人应用AFS 2201 型双道原子荧光光谱仪进行了氢化物发生原子荧光法测定食品和饲料中的铅。采用高氯酸做介质,并对各种最佳分析条件进行了探讨和验证。检出限为0. 3ug/L , 线性范围为1. 00 500ug/ L , 回收率为87 %98 %。原子荧光光度法的检出限低于原子吸收法,谱线简单且干扰少,但线性范围较宽,应用元素有限,仅用于砷、锑、秘、硒、磅、锗、锡、铅、锌、锡、汞的分析。2、火焰原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法是基于物质所产生原子蒸汽对特定谱线（通常是待测元素的特征谱线）的吸收作用来进行定量分析的一种方法。火焰原子化法是使试液变成原子蒸汽的一种理想方法。火焰原子

23、吸收分光光度法操作较简单，测试速度快，对大多数元素有较高的灵敏度和检测极限但检出限较高等优点，因而至今使用仍最广泛。3、石墨炉原子吸收分光光度法石墨炉原子吸收分光光度法与火焰原子吸收分光光度法同属原子吸收分光光度计法，只是两者使试样原子化的方法不同，石墨炉原子吸收分光光度法属于无火焰原子化。该方法具有较高的原子化效率、灵敏度高和低检出限，因而发展很快。4、电感藕合等离子体质谱( ICP MS) 分析技术将电感藕合等离子体与质谱联用,利用电感藕合等离子体使样品汽化,将待测金属分离出来,从而进人质谱进行测定。ICYMS 可通过离子荷质比进行无机元素的定性分析、半定量分析、定量分析,同时进行多种元素

24、及同位素的测定、可激光采样、氢化物发生、低压色谱、高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳等进样或分离技术联用,具有比原子吸收法更低的检测限,是痕量元素分析领域中最先进的方法,但其价格昂贵,易受污染,可用于除汞以外的绝大多数重金属的测定。5、电感藕合等离体原子发射光谱( ICP AES) 高频感应电流产生的高温将反应气加热、电离,利用元素发出的特征谱线进行测定谱线强度与重金属量成正比。ICP AES 具有灵敏度高,干扰小,线性宽,可同时或顺序测定多种金属元素,有对高温金属元素进行快速分析的特点。但检测灵敏度较ICP MS 略差,可用于除镉、汞等绝大部分金属元素的测定。近年来新发展的技术置矩端视ICP

25、 AES ,采用轴向测光,增强了取样信号量,提高了灵敏度和信噪比。而流动注入( FI HG) 进样技术与ICP AES 仪器联用,有效地解决了其试剂用量大、灵敏度低的问题。陈世忠采用该法测定黄姜中微量元素,获得砷、锑和铋的检出限分别为1. 810 - 9 、2. 4 10 - 9和3. 1 10 - 9 ,相对标准偏差(RSD)分别为3. 3 %、5. 4 %和4. 0 % , 回收率为90 % 108 %20 。6、高效液相色谱法痕量金属离子与有机试剂形成稳定的有色络合物,然后用HPLC 分离,紫外可见检测器检测,可实现多元素同时测定。卟啉类试剂具有灵敏度高,能和多种金属元素生成稳定的络合物

26、,目前已广泛用作HPLC 测定金属离子的衍生试剂。但络合试剂的选择有限,给HPCL 的广泛应用带来了局限性。7、酶抑制法随着人们对环境质量的要求不断提高,需要建立现场快速检测重金属的方法,因此环境污染物的快速检测技术应运而生。与传统检测技术相比,虽然对环境污染物的检测只能定性,灵敏度和准确性也低于传统检测技术,但是快速检测技术具有方便、快速、经济的优点,非常适合现场检测。酶抑制法测定重金属的基本原理就是重金属离子与形成酶活性中心的巯基或甲巯基结合后,改变了酶活性中心的结构与性质,引起酶活力下降,从而使底物酶系统中的显色剂颜色、pH、电导率和吸光度等发生变化,这些变化可直接通过肉眼或借助于电信号

27、、光信号等加以区别。与传统的重金属分析方法相比,酶抑制法具有快速、简便、对所分析的样品需要量少等优点,受到国内外学者的关注。目前用于痕量重金属测定的常用酶有脲酶、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶、丁肽胆碱脂酶和异柠檬酸脱氢酶等。由于脲酶廉价易得,故使用最广泛。脲酶抑制法也可与薄层色谱法联_合测定重金属含量,检测限可达0. 02 3ug/ L ,其中检测限较低的是Hg2 + ,Cu2 + 和Ag + ,分别为0. 02ug/ L 、0. 06ug/ L和0. 13ug/ L ,对氯化甲基汞和乙酸苯汞等有机汞化合物的检测限为0. 03ug/ L 。此外,脲酶测温滴定法和电势滴定法分别可以测定

28、浓度为1mg/ L 的Ag+和1 10mg/ L 的Cd2 + 。重金属对酶的抑制效应往往与它们的生物毒性相关,因此酶抑制法还可用于对污染环境重金属的风险评价。此外,使用传感器件还能放大重金属离子对酶的抑制效应,从而大幅度提高检测灵敏度。8、免疫分析法免疫分析法是一种具有高度特异性和灵敏度的分析方法,在环境分析领域中有着广泛的应用。用免疫分析法对重金属离子进行分析,首先必须进行两方面的工作:第一是选用合适的络合物或其它化合物与金属离子结合,使其获得一定空间结构,从而产生反应原性;第二是将结合了金属离子的化合物连接到载体蛋白上,产生免疫原性,其中与金属离子结合的化合物的选择是能否制备出特异性抗体

29、的关键。Wiley D E 等21最先用谷胱甘肽Hg 复合物免疫小鼠制备了2 株对Hg( ) 有特异性的单克隆抗4A10 和1F10。酶联免疫吸附实验( ELISA) 表明,对两株抗体汞的解离常数分别为2. 3nmol/ L 和3. 7nmol/ L ,谷胱甘肽、其它金属阳离子和抗体均不发生交叉反应。Blake D A 等22发现,金属络合物也可以被用来作免疫动物制备金属的特异性抗体,因此只要少数几种络和剂就可完成多数重金属离子单克隆抗体的制备和样品的免疫分析。但是,金属离子单克隆抗体的制备非常困难,而较容易制备的多克隆抗体又难以满足对金属离子的特异性要求,这在很大程度上限制了汞等重金属离子的

30、免疫分析方法的研究与发展。9、生物传感器近20 年来,人们不断开发多种生物传感器用于测定水溶液中的毒性化合物,因此研制酶传感器来检测环境重金属成为生物传感器研究热点。本研究的目的和意义虽然高效液相色谱法、共振瑞利散射法具有分离能力好、灵敏度高、分析速度快、操作方便等优点，但仪器过于昂贵、使用费用高。电感耦合等离子体发射光谱法虽具有检出限低，检出灵敏度高，分析精密度高，分析动态范围小，基体效应小等优点，但以ICP为原子化器的原子荧光光谱仪对难熔元素的测定灵敏度不高。若采取极谱法和比色法, 在分析测定过程中都需用硫酸、硝酸或高氯酸, 试剂用量大， 分析速度慢，手续沉长， 且污染环境1- 2。经过多种方法对比，本实验采用湿法消解-原子吸收光谱法测定转BT抗虫品种的转基因水稻中的铅、镉、铜、铬、铁五种重金属的含量，并做了加标回收实验。用相同的方法处理及测定非转基因水稻中五种重金属的含量，通过两者结果进行比较，分析它们积累重金属的能力差别，以此为转基因水稻的食用安全性提供基本的参考依据。1 实验部