结核分枝杆菌与实验室生物安全.docx

1、结核分枝杆菌与实验室生物安全结核分枝杆菌与实验室生物安全广东省结核病防治研究所钟球 钱明附件广东省结核病防治研究所钟球 钱明 结核病的定义 结核病的疫情 结核病病原学 结核病的流行 结核病实验室生物安全 结核病实验室安全防护 结核病实验室废物处理 结核病职业暴露 结核病是由结核分枝杆菌（偶尔可由牛型或非洲型分枝杆菌）引起的一种细菌性疾病。结核病可累及全身各个器官，但以肺结核最为常见。该病具有传染性强，散播面广，不分地域均可发生。结核病可由呼吸道、消化道、皮肤等途径感染，但其主要传播途径是以空气为传播因子的呼吸道传染，而排菌的肺结核病人传染性更大，是传播感染的主要传染源。结核病的疫情n 感染人数

2、 约为20亿n 新发活动性肺结核病人 890万(141/10万)n 新发涂阳肺结核病人 390万 n 结核病发病率每年增加1%n 估计患病人数为1550万例（患病率为246/10万）其中包括HIV+TB38万例n 死于结核病为180万例，结核病死亡率为29/10万,其中包括HIV+TB死亡27万例 结核病病原学 结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原体。1882年由德国医生Koch发现。在微生物分类中，结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌。结核分枝杆菌的形态 结核分枝杆菌菌体具有

3、多形态特征，除正常典型形态外，受不良生长条件的影响。如物理因素、化学因素，特别是药物因素，而呈现异常变化，其各种形态可归纳为杆菌型（基本形态）、滤过型、颗粒型和球菌型（L型）4种类型。 1. 杆菌型（基本形态）结核分枝杆菌正常典型的形态是直或稍弯曲、两端钝圆的杆菌。菌体 长14m，宽0.30.6m，无芽胞、无荚膜、无鞭毛，生长发育期间有分枝生长倾向。 2. 滤过型 早在1901年，Foutes在检查细菌滤器滤过的结核分枝杆菌培养滤液时，在电子显微镜下观察到球状微粒体。1991年，Khomeko在豚鼠损坏性肺结核模型中证实了滤过型的存在。此球状微粒体可通过细菌滤膜，称为滤过型 。 3. 颗粒型

4、1907年莫赫(Much)在结核性冷性脓肿、浆液性渗出液、干酪性淋巴结等脓液中观察到革兰染色阳性颗粒，称为莫赫颗粒。莫赫颗粒的重要意义在于这些颗粒型体仍有生机与活力，在适宜的营养条件下，可重新获得增殖，发育生长出典型结核分枝杆菌。 4. 球菌型（L型） 结核分枝杆菌在体内外受物理、化学、免疫等因素的影响，维持菌体固有形态的细胞壁缺损或丧失，产生细胞壁缺陷型。细胞壁缺陷型细菌是1935年Kilienberger在英国Lister医学研究院研究念珠状链杆菌时首先发现的，故以Lister医学研究院的第一个字母，将细胞壁缺陷型细菌命名为L型菌。结核分枝杆菌的染色特性 结核分枝杆菌本身无颜色，观察结核分

5、枝杆菌必须染色后进行。结核分枝杆菌革兰染色阳性，但革兰染色不易着色。经苯胺染料着色后，能抵抗酸和酸乙醇脱色，此种特性称为抗酸性。Z-N染色法为最常用的一种抗酸染色方法，经此法染色后，分枝杆菌，包括结核分枝杆菌呈红色，而标本中其他细菌、细胞、杂质等均呈蓝色结核分枝杆菌的生长特性 结核分枝杆菌生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内约需要1520小时，在静脉感染未经免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬细胞内约需要1520小时，在家兔角膜中约需要2022小时。结核分枝杆菌的抵抗力 结核分枝杆菌因细胞壁含大量类脂质，尤其是腊样物质，具有疏水性，对物理和化学因素的作用均较一般致病菌抵抗力强。 1. 物理因素影响

6、结核分枝杆菌生存能力较强，在温室和阴暗处干燥痰内可以存活68个月，粘附在飞扬的空气尘埃中可保持传染性810天。结核分枝杆菌一般较耐低温，在-68能存活45年。 干热对结核分枝杆菌杀伤力弱，痰内结核分枝杆菌在100下需要45小时被杀灭。湿热对结核分枝杆菌杀伤力强，在6030分钟、7010分钟、805分钟和901分钟可将其杀死，因此煮沸与高压蒸气消毒是最有效的方法之一。 结核分枝杆菌对光线和射线敏感，在太阳光直射下27小时死亡。病人用过的物品在强阳光下直晒半日，基本可达到消毒的目的。101mg/ml菌悬液，液层厚度3mm，用10W紫外线灯在距离确 0.5m处持续照射3分钟，在距离1m处持续照射 1

7、0分钟，经培养无细菌生长。但紫外线穿透力弱，难以透入固体物质内部和液体深层，因此紫外线通常用于空气和物体表面消毒。 2. 化学因素的影响 化学消毒剂的种类很多，其杀菌的机制因化学药物种类不同而异。乙醇使菌细胞蛋白质变性、凝固而产生杀菌作用。结核分枝杆菌直接接触70%75%乙醇530分钟可被杀死，因此可用于皮肤消毒。但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一层把菌体包裹起来的膜，短时间内不能杀死细菌，故乙醇不能用于痰的消毒。 苯酚主要通过破坏菌细胞膜而致细胞质内容物漏出，使菌体蛋白质变性、凝固，抑制菌体脱氢酶和氧化酶等酶系统杀死结核分枝杆菌。2%苯酚5分钟、5%苯酚1分钟能杀死结核分枝杆菌培养物。5%

8、苯酚与痰液等量混合，24小时才能杀死结核分枝杆菌。煤酚皂溶液作用机制与苯酚相似，0.5%煤酚皂60分钟，1%煤酚皂45分钟，2%煤酚皂10分钟，5%煤酚皂5分钟，即能杀死结核分枝杆菌培养物。5%10%煤酚皂等量混入痰标本，12小时可杀灭结核分枝杆菌。 甲醛使菌细胞蛋白质变性凝固，丧失代谢功能致细菌死亡。1%甲醛处理结核分枝杆菌5分钟，可使细菌死亡。5%甲醛和痰液等量混合，处理12小时以上才能达到杀菌作用。 “84”消毒液是以氯为主要成分的消毒剂。氯是一种氧化剂，能使菌体的酶失活，还能与蛋白质的氨基结合，使菌体蛋白氯化，代谢功能障碍，细菌死亡。0.5%“84”消毒液15分钟可杀死结核分枝杆菌培养

9、物，但对在蛋白质混合液中的结核分枝杆菌几乎无消毒效果。 结核分枝杆菌对酸、碱抵抗力强，在4%NaOH，3%HCL和6%H2SO4中30分钟仍能存活。临床应用酸或碱加入病人标本，消化蛋白质及杀灭杂菌，以此分离出结核分枝杆菌。结核分枝杆菌对染料，如113000孔雀绿和175000甲紫有抵抗力，通常在培养基内加入一定量的孔雀绿或甲紫抑制其他杂菌生长。对普通细菌有较强杀菌作用的新洁尔灭，对结核分枝杆菌几乎无消毒作用。 结核分枝杆菌的致病性 结核分枝杆菌不产生内、外毒素，也无侵袭性酶类。一般认为其致病作用可能与菌体表面结构及某些菌体成分，如脂质、某些菌体蛋白、多糖等多种物质有关，主要是有毒结核分枝杆菌菌

10、株在易感机体内顽强增殖和与机体相互作用的结果。结核病流行 结核病在人群中流行的三个生物学环节是： 1、传染源， 2、感染传播途径； 3、易感人群。影响结核分枝杆菌传播的主要因素 1、排菌量痰中结核分枝杆菌越多，传播的危险性越大。病人出现痰涂片阳性若1ml痰液中含菌量为1 00010 000，其痰涂片阳性率为 40%50%，痰液中含菌量低时，痰涂片阳性率亦低（表l）。 表1痰涂片与痰标本中结核分枝杆菌数 痰涂片阳性（涂阳）病人的排菌量大，其密切接触者的结核感染率明显高于痰涂片阴性（涂阴）病人的密切接触者，英国报告涂阴培阴病人的家庭儿童密切接触者结核感染率为17.6%；涂阴培阳病人的接触者结核感染

11、率为26.8%；涂阳培阳病人的接触者结核感染率高达65.0%（表2）。 表 2不同传染源对 15岁以下密切接触者的感染率（%） 2排出飞沫的大小传染源排出的飞沫受压力和粘稠度的影响而大小不一，飞沬核直径110m者在空气中漂浮时间长，可进入人体末梢支气管内；飞沫核直径较大者，则受地心引力的影响而坠落。 3患者病变与症状病变广泛、损害严重的患者，尤其是病变急剧进展，干酪溶解形成空洞患者的痰中含有大量结核分枝杆菌，是主要的传染源。患者咳嗽、喷嚏或大声说话时都能产生飞沫，有报道，当人咳嗽时每次排出的飞沫数约为3500个，一次喷嚏则可排出飞沫达100万个；平常说话5分钟所排出的飞沫数相当于一次咳嗽，咳嗽

12、是肺结核病人产生飞沫的主要方式。 表3记录了病人每晚咳嗽次数，并观察其014岁家庭接触者的结核感染率每晚咳嗽48次以上患者的家庭接触者感染率为43.9%，而咳嗽12次以下患者的接触者感染率为27.5 %。 表3传染源咳嗽次数与接触者感染率 4接触的密切程度周围人群与传染源接触越密切，受感染的机会越多，涂片阳性病人的密切接触者感染率明显高于偶尔接触者（表4）。 表4不同接触程度儿童感染率 5环境因素与传染源病人同处于空气不流通的室内的密切接触者，受结核感染的可能性增大。第二次世界大战时期曾报道潜艇内官兵大批感染和发病，也有民航客机上结核病传染源使同机乘客受感染的报道。传播途径 呼吸道感染（res

13、pirator tract infection）是肺结核的主要传染途径（routes of infection），飞沬传染（droplet infection）为最常见的方式。传染源主要是排菌的肺结核患者（尤其是痰涂片阳性未经治疗者）。飞沬核（droplet nuclei） 10m时可被吸人呼吸道，健康人可因吸入患者咳嗽、打喷嚏时喷出的带菌飞沫而受感染。 易感者 结核分枝杆菌进人人体，引起易感者（susceptible）机体的复杂反应。 1人体的防御反应人体的防御反应（defense reaction）有物理、化学和生物学反应。进人呼吸道的结核分枝杆菌飞泳核可被鼻、咽、喉、气管和支气管的粘液吸

14、着、被酶杀灭并随纤毛运动经咳嗽、喷嚏和咳痰等动作排出体外，或被吞噬细胞吞噬杀灭。当防御功能（defense function）低下时，结核分枝杆菌进人下呼吸道，引起机体反应。 2人体的易感性未受结核感染的人是结核病的易感人群（susceptible population）一旦受到结核分枝杆菌传播，具有普遍的易感性（susceptibility），进入人体的结核分枝杆菌可在人体内繁殖，结核分枝杆菌的繁殖周期约为1020小时，一条结核分枝杆菌在体内繁殖1周可达128条菌，繁殖20天将超过100万条菌（表5），体内的大量结核分枝杆菌将使人体患病，引起机体的免疫与变态反应。 表5一条结核分枝杆菌在体内

15、的繁殖情况 3.免疫与变态反应人体对结核分枝杆菌的自然免疫力（natural immunity）（先天免疫力）是非特异性的。接种卡介苗（bacilli calmette gurin，BCG）或受结核分枝杆菌感染后所产生的获得免疫力（acquired immunity）（后天性免疫力）则具有特异性，能将入侵的结核分枝杆菌杀死或严密包围，制止其扩散，使病灶愈合。结核病的免疫主要是细胞免疫，表现为淋巴细胞的致敏与吞噬细胞功能的增强。化疗时代的结核病流行 化学疗法的流行病学效果 传染性肺结核病人接受抗结核药物化学治疗（chemotherapy）后，肺部病灶中的结核分枝杆菌被杀灭，传染性减小以至消失，传

16、染源的流行病学作用随之消失。实验报告敏感菌在未治疗时相对传染性 100%，在治疗中只有25%，耐药病人未治疗时相对传染性为 100%。在治疗时则只有27.3%。结核分枝杆菌检查 一、结核分枝杆菌检查的意义 结核病是由结核分枝杆菌引起的可致全身器官或组织发生病变，而以肺部病变为常见的传染性疾病。因此，痰结核菌的检查是结核病流行病学、结核病诊断、确定化疗方案以及评价治疗效果的重要手段，在现代结核病控制工作中起着不可或缺的重要作用。 结核分枝杆菌检查 : 直接涂片 ; 结核分枝杆菌的分离培养和结核分枝杆菌的药物敏感性测定结核病实验室生物安全 一、生物安全的概念 实验室生物安全，是指在以微生物为对象的

17、实验工作中，预防生物危害，保障操作对象、操作者和环境的安全。合理的实验室建筑结构和布局、生物安全柜的正确使用，可以使操作对象和工作人员得到有效的保护，排出的空气经高效滤器滤过也可以保护邻近人员及环境的安全。在没有保证安全的实验室条件下，处理传染性强的实验材料时，防护服、预防免疫和药物预防是实验室生物安全的必要保证。 二、术语与定义 (一) 生物因子（ biological agents ） 一切微生物和生物活性物质。 (二) 病原体（ pathogens ） 可使人、动物或植物致病的生物因子（包括微生物、寄生虫等）。 (三) 危害废弃物（ hazardous waste ） 有潜在生物危险、可

18、燃、易燃、腐蚀、有毒、放射和起破坏作用的对人、环境有害的一切废弃物。 (四) 危险（ risk ） 伤害发生的概率及其严重性的综合。 (五) 气溶胶（ aerosols ） 悬浮于气体介质中的固态或液态微小粒子（粒径一般为 0.001-100m）形成的相对稳定的分散体系。 (六) 高效空气过滤器 high efficiency particulate air filter（HEPA ）通常以滤除0.3m 微粒为目的，滤除效率符合相关要求的过滤器。 (七) 安全罩（ safety hood ） 置于实验室工作台或仪器设备上的负压排风罩，以减少实验室工作者的暴露危险 ，排风经高效过滤。 (八) 缓

19、冲间（ buffer room ） 设置在清洁区、半污染区和污染区相临两区之间的缓冲密闭室，具有通风系统，其两个门具有互锁功能，且不能同时处于开启状态。 (九) 实验室分区（ laboratory area ） 按照生物因子污染概率的大小，实验室可进行合理的分区。(十) 气锁（ air lock ）气压可调节的气密室，用于连接气压不同的两个相邻区域，其两个门具有互锁功能，不能同时处于开启状态。在实验室中用作特殊通道。 (十一) 定向气流 （ directional airflow ） 在气压低于外环境大气压的实验室中，从污染概率小且相对压力高处向污染概率高且相对压力低处受控制流动的气流。 (十

20、二) 一级屏障（ primary barrier ） 是操作者和被操作对象之间的隔离，也称一级隔离 。如生物安全柜、个体防护装备等。(十三) 二级屏障（ secondary barrier ） 是生物安全实验室和外部环境的隔离，也称二级隔离。 (十四) 生物安全实验室（ biosafety laboratory ） 通过防护屏障和配套管理措施，达到生物安全要求的生物实验室和动物实验室。 三、微生物危害程度分级 微生物按其是否致病、致病力强弱、危害人体的严重性、传染性的大小、临近人群的抵抗力、有无免疫制剂和特效治疗药物等综合评价，可分为四个不同的危害等级。结核分枝杆菌属于3级危险。 3级危险（对

21、个体具有极大危害，对群体具有较大的危害性）：指有特殊危险的致病菌。感染后症状较重，并可能危及生命，或者缺乏有效的预防方法、发病后不易治疗的微生物。实验室感染的原因及预防 （一）技术操作可能导致的感染及其预防措施。 1. 接种：应使用无弹力的铂丝接种环，结核菌接种后接种环火焰灭菌易崩散，酒精灯烧灼时要特别注意。 2. 混匀：吸管吸吹菌液时不要产生气泡，应沿容器壁排出。 3. 研磨：最好使用组织研磨器，乳钵易产生气溶胶。4. 移液：吸管上端的棉花松紧要适度，吸液时要从管底吸取，吹出时要轻缓，不要全部吹净，以免产生气泡，形成气溶胶。5. 开封：要避免压力和气流的急剧变化。6. 离心：离心管套底垫要完

22、好，使用匹配的管、套、离心头，加盖。7. 注射：做好个人防护，正确使用注射器。8. 搬运：室内移动要避免滑落，移出室外要有坚实密闭的外包装。 （二）生物安全的制度措施 1. 无生物安全3级实验室，进行病原的实验操作，要在有缓冲间的无菌室内操作，并使用生物安全柜。 2. 工作前后要用紫外灯消毒。 3. 操作台面要铺湿消毒巾。 4. 按操作病原的危险等级和感染途径做好个人防护。 5. 操作台附近要常备消毒液，污染物要放入密闭容器及时灭菌。 6. 实验室内要严防虫、鼠进入。 7. 根据需要对实验室工作人员进行免疫接种和药物预防。 8. 有皮肤破损和疾患的人员不得操作3、4级危险性病原。 生物安全保障

23、 （一）建筑结构保障生物安全3级实验室 1. 结核分枝杆菌属于生物危害3级的微生物，进行活病原（培养物或感染标本）操作时，应使用本级别实验室。 2. 实验室建筑设备要求：双层门或有气幕的出入口；实验室表面可洗刷、消毒；由上至下的气流方向；排气经高效滤器；窗户密闭、工作区可防一切蚊虫进入。 3. 工作制度要求：非工作人员不得进入；使用实验室专用工作服、鞋；排水经无害化处理；搬出物品要求要灭菌或密闭包装；实验室内禁止进食饮水。 （二）装备保障 1. 生物安全柜 一级生物安全柜：由外向内的单向气流，只保护人体，不能保护实验材料。可用于痰涂片操作。 二级生物安全柜：有向内气流和经高效滤器的垂直气流，可

24、保护人体和实验材料不受污染。用于病原分离、培养。 2. 高压灭菌器：运行状态良好。 3. 消毒防护物品等。 （三）技术保障 1. 双人原则，不允许单人操作1、2类病原。 2. 入口处应有危险警示标识，并标明所操作的微生物的种类。 3. 培训考核上岗，掌握相关技术操作要领，熟悉规章制度，适应工作环境。 4. 完备的管理措施，技术操作规范。 5. 良好的工作行为可降低生物危害风险。 六、实验室生物安全水平分级 (一) 根据所操作的生物因子的危害程度和采取的防护措施，将实验室生物安全防护水平（biosafety level，BSL）分为4级，级防护水平最低，4级防护水平最高。 (二) 以BSL-1、

25、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示实验室的相应生物安全防护水平。 (三) 以ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表示动物实验室的相应生物安全防护水平。 七、实验室管理制度 (一) 实验室管理规章制度：包括培训制度、准入制度、健康监测报告制度、个人良好行为制度、意外事故报告制度等。 (二) 标准操作程序：包括实验废弃物处置标准操作程序、进出实验室标准程序、菌毒种使用标准操作程序、实验室消毒标准操作程序、意外事故处理标准操作程序及各种仪器设备和实验标准操作程序等。结核病实验室安全防护 各级结核病细菌学实验室必须对工作人员给予充分保护，同时控制对环境造成的污染。在实验室从事试验

26、或工作的人员，应当了解可能接触到的各类危险物品的种类和性质，明确这些危险物对自身和他人及环境具有的潜在威胁。应严格按照实验室操作规程做好安全防护。 一、实验室中的分枝杆菌及分枝杆菌气溶胶 结核病实验室工作人员，在分枝杆菌检验过程中，会接触到各种潜在感染源标本和各种危险物，特别是许多操作易产生分枝杆菌气溶胶。含有结核分枝杆菌的微滴核（1-5微米）通过呼吸进入人体肺泡，可以黏附在肺泡内生长繁殖。因此，首先要对实验室中生物危险物产生的途径和存在的地点有充分的认识，以便明确生物安全防护的环节。 (一) 分枝杆菌存在的地点 1、各种临床标本，通常是痰，胃或支气管灌洗液、脑脊液、尿液等。 2、被污染的操作

27、台、器械、仪器、试剂等。 3、收集的结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌菌株等。 4、细菌学实验室的部分区域。 (二) 产生分枝杆菌气溶胶 1、实验室内可疑肺结核患者痰标本的采集。 2、样本的制备和涂片的火焰固定。 3、分离培养或接种培养物。 4、用火焰烧灼接种环。 5、使用移液器混合培养物。 6、培养管或培养瓶中含有培养物的滴落物。 7、溢出的分枝杆菌悬浮液。 8、高速混合含有分枝杆菌的液体。 9、转移液态培养物和上清液，或培养液、上清液的倾倒。 10、离心过程中离心管的破碎。 11、用做原代培养所需的组织匀浆。 二、安全防护 (一) 严格遵守实验室安全操作规程，任何时侯都要警惕分枝杆菌气溶胶的产生

28、。实验室的技术人员必须经过生物安全培训后方可上岗。 (二) 实验室应严格限制非实验人员进入，减少实验室内外交叉生物污染。完成实验工作离开实验室，要关好门窗。 (三) 进入实验室应避免携带非必需物品。 (四) 进入实验室，工作人员应穿着工作服，操作时应穿戴防护隔离衣、口罩、帽子和手套，长发者应将头发装束在帽子内。 (五) 实验过程中绝对禁止吸烟、饮食等，不要以手抚头面部等。 (六) 试验前须开启紫外线灯对实验室和操作区域进行照射消毒1小时以上；试验结束后，立即开启紫外灯进行照射消毒2小时以上。 (七) 任何试验的开始和结束后，操作人员要用70%酒精浸泡双手或仔细擦后，用清洁剂或清水洗净。 (八)

29、 每次试验结束后，必须清理好实验台，并用70%酒精液或3-5%石炭酸擦洗实验台面。 (九) 实验室中的生物危险品要根据检查项目和性质不同，局限在相应的试验区间，不得随意将其带到其它的实验室。 (十) 实验室内任何微生物的样本，废弃物都必须经高温高压灭菌后，方可按一般垃圾处理。 三、安全保障 (一) 首先各级实验室应按等级要求完善实验设施，如简易安全柜内的抽气排风功能、紫外灯消毒功能，生物安全柜维护与除菌滤膜定期更换等。 (二) 实验室采集病人痰标本时应在户外进行，避免因病人咳漱造成室内气溶胶污染。 (三) 普通实验室应注意气流方向，实验过程中尽量避免强气流变化而产生气溶胶（如涂片、染色过程中）

30、。 (四) 细菌的分离培养、菌种开封、转种、研磨、稀释等操作，各级实验室均应在简易安全柜或生物安全柜中进行。 (五) 使用接种环进行操作时，接种环应在工作灯的内焰中燃烧，以避免菌液或菌块飞溅。 (六) 稀释菌液时，吸管、针管要缓慢插入试管或烧瓶底部，小心操作避免产生气泡或气溶胶。 (七) 使用注射器加样时，用过的针头切勿再重新入套或拔开注射器与针头，应直接放入锐器收集器，以免划破皮肤造成接种感染。(八) 菌株库要设专人管理，并按照国家微生物菌毒种管理办法执行。 (九) 进行毒菌操作过程中，不要穿戴巳经污染的防护性手套触摸门柄、仪器或毒菌区以外区域，避免由于粗心扩大污染范围。 (十) 试验结束后，操作过程中所有可能与生物危险物接触或被污染的试验器