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1、枯草芽孢杆菌的发酵枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院 专业：生物工程 班级：生物 10-2 ：霞摘要枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的 15 种菌种之一 , 其已被 越来越多地制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染 的“绿色” 添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的 社会效益和生态效益。 通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基 配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始值、初始 接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。在摇瓶条件 下优化发酵培养基和发酵工艺后， 采用发酵罐进行发酵培养， 对枯草芽

2、孢杆菌在 液体发酵过程中的菌体数量、 值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变 化进行了观察。枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7 0.823 微米，着 色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌， 芽孢 0.6 0.9 1.0 1.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗 糙不透明， 污白色或微黄色。 枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、 多 粘菌素、制霉菌素、 短杆菌肽等活性物质， 这些物质对致病菌或源性感染的条件 致病菌有明显的抑制作用。 枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧， 造成肠道低 氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸

3、类，降低肠道 pH 值，间接抑制 其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成 - 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤 维素酶等酶类，在消化道中与动物体的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素 B1、B2、B6、烟酸等多种 B 族维生素，提高动物体干扰素和巨噬细胞的活性，在 饲料中应用广泛。 它还可以用来改善水质， 应用在污水处理和环境保护中。 和其 它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等关键词：枯草芽孢杆菌 生长 发酵 活菌数第一章 材料与方法1.1材料1.1.1菌种枯草芽孢杆菌1.1.2培养基（ 1） LB培养基：蛋白胨 10g，酵母膏 5g，NaCl10g，蒸馏水 1000ml，pH为 7，

4、（可溶性淀粉 20g）琼脂 20g。（ 2）筛选用培养基：含有 2%可溶性淀粉的 LB 培 养基。（3）种子培养基：豆饼粉 4%，玉米粉 3%，Na2 HPO4 0.8%，（NH4 ） 2 SO4 0.4%， NH4 Cl0.15%，H2 O。（4）发酵培养基：豆饼粉 5.6%，玉米粉 7.2%，Na2 HPO4 0.8%，（NH4 ） 2 SO4 0.4%， NH4 Cl0.13%，CaCl2 0.13%，淀粉酶 50g。1.1.3主要试剂 蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿 素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和 氯化钙。

5、1.1.4仪器设备 控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、 pH测定仪、无菌操作台和紫外分光光 度计。1.2方法1.2.1培养基的制备（1） 称量 按培养基配比依次准确地称取酵母膏、 NaCl、蛋白胨放入烧杯中， 并在烧杯 中加入少量蒸馏水。注：酵母膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用 热水溶化后倒入烧杯， 也可放在称量纸上， 称量后直接放入水中， 这时如稍微加 热，酵母膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。（2） 溶化 可溶性淀粉溶液的配制方法：将所需克数的可溶性淀粉放入一个小烧杯中， 加入少量蒸馏水， 搅拌成糊状， 然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的沸 水中，一边搅拌一边加热，

6、 待其溶化成透明状后继续在电炉上加热 5 分即制成可 溶性淀粉溶液。如果配制固体培养基时， 将已准备好的可溶性淀粉溶液倒入烧杯中， 将称好 的琼脂放入已溶的药品中， 再加热溶化， 补水到所需的总体积。 在制备用三角瓶 盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按 2%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中， 不必加热溶化， 而是灭菌和加热溶化同 步进行，节省时间。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需 不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不能用铜或铁锅加热溶化，以免 离子进入培 养基 中，影响细菌生长。(3)调 pH培养基配好以后，先用精密

7、pH 试纸测量培养基的原始 pH，如果偏酸，用滴 管向培养基中逐滴加 1mol/LNaOH，边加边搅拌， 并随时用 pH试纸测其 pH，直到 pH达 7为止；反之，用 1mol/LHCl 进行调节。 对于有些要求 pH 较精细的微生物，其 pH 的调节可用酸度计进行。注意： pH不要调过头，以避免回调而影响培养基各离子的浓度，配制 pH低的琼脂培养基时， 若预先调好 pH 并在高压蒸汽下灭菌， 则琼脂因水解不能凝固， 因此应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性 pH条件下灭菌，再调整 pH。(4)分装按照实验要求，可将配置的培养基分装入试管或三角瓶中。液体分装： 分装的高度以试管高度

8、的 1/4 左右为宜；分装三角瓶的量则根据需要 而定，一般以不超过三角瓶的一半为宜。固体分装：分装于试管中的应不超过试管的 1/5 ，灭菌后制成斜面；分装三 角瓶的量以不超过一半为宜。(5)加塞培养基分装完毕后， 在试管口上塞上棉塞， 以阻止外界微生物进入培养基而 造成污染，并保证有良好的通气性能。(6)包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好， 再在棉塞外包一层牛皮纸， 以防止灭菌时 冷凝水润湿棉塞，外边再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称，组别，配 制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结扎好，使用时容易解开，同 样注明。(7)灭菌将配置好且包扎完毕的固体、 液体培养基及本实验涉及的试管

9、、 三角瓶等及 400ml 纯水于高压灭菌器中以 0.14Mpa，121条件下高压蒸汽灭菌 20分钟。(8)斜面搁置将培养基冷却至 50左右时放置斜面，斜面在试管的 1/2 处为宜，待斜面 凝固后，放置于冰箱中待用。1.2.2菌种的筛选与保藏(1)倒平板将实验配制好的培养基加热溶化，待冷却至 5560时，倒平板 9 皿。(2)稀释用接种环取菌种，放入盛 90ml 无菌水的三角瓶中，振摇。用一支 1ml 无菌 吸管吸取 1ml 菌液加入盛有 9ml 无菌水的大试管中充分混匀， 然后用无菌吸管从 此试管中吸取 1ml 加入另一盛有 9ml无菌水的试管中， 混合均匀，以此类推制成 10 -1 、10

10、 -2 、 10-3 、10 -4 、10-5、10-6 不同稀释度的菌液。(3)划线将平板底面分别用记号笔写上 10-4 、10-5、10-6 三种稀释度(共三组)然后 用接种环分别沾取浓度为 10-4、10-5、10-6 稀释液并对号在相应平板上划线，室 温下静止 510min，使菌液吸附进培 养基。(4)培养将培养基平板倒置于 37的培养箱中，培养 23 天，观察淀粉圈。对有淀 粉圈的菌落，测量淀粉圈的直径 D，菌落直径 ，计算 D 的比值，可进行拍照， 选择淀粉圈较大的菌落作为后续实验的菌种。(5)接种接种到斜面培养基中， 标注上日期等信息。 放入恒温培养箱中培养作为一级 种子。(6)

11、保藏斜面置于 37的培养箱中，培养 23 天，观察菌种长势好坏，若菌种长势 好则将其放入冰箱中保藏，若长势不好则需多次斜面转接。1.2.3枯草芽孢杆菌生长曲线测定(1)取 12支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间即12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22和 23h。(2)接种用 1ml 无菌吸管吸取 2ml 枯草芽孢杆菌培养液 (培养 10 12h)转入盛有 100mlLB 液的三角瓶，混合均匀。(3)培养将已接种的三角瓶放置 37振荡培养(振荡频率为 100r/min )分别在培养 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 和 23h 时，用

12、无菌吸管吸取 1ml菌液放入 标有相应时间的无菌试管中， 立即放入冰箱中储存， 最后一同比浊测定光密度值。(4)比浊测定用无菌水作空白对照， 选用 660nm波长进行光电比浊测定， 从早取出的培养液开 始依次测定，对细胞密度大的培养液用无菌水适当稀释后，使其光密度值在0.1 0.65 之的生长情况。 菌体进入对数生长期即可作为二级种子液用于分批培 养发酵实验。(测定 PH值前，将待测定的培养液震荡，使细胞均匀分布) 。PH值测定结果培养时间( h)12345678PH值6.56.76.97.17.37.06.86.41.2.4菌种摇瓶培养（1）称量 根据需要量计算并依此称取豆饼粉、 玉米粉、N

13、a2 HPO4 、（NH4 ） 2SO4、 NH4Cl 放入三角瓶中，配成 200ml溶液。（2）加塞包装。（3）灭菌 0.14Mpa ，121,20min 。（4）接种 接种前一级种子需先放在恒温培养箱活化（ 37、 12h），冷却后接 种。（5）培养 放入气浴恒温振荡器中 37,100r/min 培养 13h 后，镜检，观察菌 的生长情况。菌体进入对数生长期即可作为二级种子液用于分批培养发酵实验。1.2.5产淀粉酶枯草芽孢杆菌分批培养发酵（1）称量 根据需要量计算并依次称量豆饼粉、 玉米粉、Na2 HPO4 、（NH4 ） 2SO4、 NH4 Cl、CaCl2 、淀粉酶，放入发酵罐中加入蒸

14、馏水配制 2.5L 发酵液。（2）灭菌 0.14Mpa ，121,20min 。（3）接种（4）启动发酵罐，调节发酵系数，开始发酵。发酵参数：温度 37 转速 200r/min通气量 1.33VVm （012h）2.67VVm（12h发酵结束）pH值 6.5（ 5）测 PH值，绘制生长曲线，并进行镜检，观察菌体生长状况。（6）发酵结束，放罐。第二章 结果与分析2.1菌种筛选及保藏由于实验要筛选的菌种已经很纯了，所以此次实验所提到的“筛选” ，是要 筛选出有活力的、 生长状态良好的纯种枯草芽孢杆菌。 通过加入少量的可溶性淀 粉酶，可以使菌种进行选择性培养， 这样筛选出来的菌株可以更好地产淀粉 酶

15、。筛选出来的菌种要进行保藏，此实验的保藏方法是放在冰箱中保藏。2.2扩大培养此次实验采用一次扩大培养， 方法是摇瓶培养。 扩大培养用的培养基与发酵 培养基相似。在气浴恒温振荡器中，发现摇瓶中变浑浊，而且表面有很多气泡， 这说明菌体开始生长了。培养特定时间后，生长出来的菌种就可以用于发酵了。 2.3 发酵发酵采用的方式是分批培养发酵， 在一切做好准备后， 进行无菌操作， 把菌 体放入发酵罐中进行发酵。 整个过程都是需要时刻进行调节的， 主要的调节项目 为温度、 pH值，因为菌体在生长的各个阶段，温度和 pH都有所变化，而想要生 产出产品， 就要控制好这两个参数。 温度控制主要通过加冷却水来进行，

16、 但要注 意适量，不能太过。 pH值的控制主要通过加氨水来调节，因为随着菌体生长和 产物产生，环境 pH值会不断下降呈酸性，所以要不断加氨水来控制。第三章 结论 枯草芽孢杆菌在培养过程中，由于培养条件掌握不好，常出现活菌数量低， 芽孢形成率低等问题。本研究通过一系列单因素实验 , 确定了枯草芽孢杆菌的最 佳发酵条件。 通过对枯草芽孢杆菌进行筛选、 扩大培养和发酵的控制， 很好的了 解了生物产品生产的中游部分的各个步骤，初步学习了这几部分的主要注意事 项，尤其对发酵有了一个初步的认识，学会了控制发酵的相关参数。通过测量 PH值，也了解了菌体的生长趋势。培养基优化方法多是在单因素水平试验的基 础上

17、进行正交实验设计或是在正交试验基础上应用均匀设计理论， 或者采用通用 旋转组合设计， 均能对培养基优化取得较好的效果。 在工业化生产中， 还需要对 接种量、 pH、温度、转速、通风比、溶氧、以及消泡剂用量等一系列因素进行严 格控制，才能保证枯草芽孢杆菌发酵活菌数达到最高、 发酵效果最好、 在动物饲 料里的添加效果最理想。第四章 参考文献1吴玲, 何颖 . 瑞士乳杆菌增菌培养基的筛选 J. 工程职业技术学院学报 , Vol. 4 2007 December No.54.2西北农林科技大学学报(自然科学版) , Vol.38 No.7 Ju.1.2010.3宇，高年发，颖. 短乳杆菌生产 - 氨基丁酸培养基的优化 J. 现代食品科 技 , 2010, Vol.26, No.1.4蕾, 石新丽, 敏. 短小芽孢杆菌 TY079 产抗菌物质的发酵培养基研究 N. 省科学院学报 , Vol. 27 No. 2 Jun. 2010.5丁翠珍, 裘季燕, 伟成. 枯草芽孢杆菌 B02 产生拮抗物质培养基及发酵条 件优化J. 中国生物防治 , 2008 年5 月.6吴永平, 周景文 , 守文. 枯草芽孢杆菌 ME714产聚- -谷氨酸固态发酵培 养基的优化 J. 应用与环境生物学报 , 2007, 13 (5) : 713 716.