PCR技术检测金黄色葡萄球菌的研究.docx

1、PCR技术检测金黄色葡萄球菌的研究 计划编号： 国家质检总局科技计划项目 建 议 书项 目 名 称：PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌的研究专 业 类 别： 食 品 安 全 建 议 单 位： 内蒙古国际旅行卫生保健中心（盖章） 起 止 时 间： 2007 年 7月 2010 年 7 月 项目负责人： 孙 志 （签名） 填 表 日 期： 2007 年 3 月 12 日 填 报 说 明一、国家质检总局科技计划项目建议书各项内容要实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨。二、建议书原件一式三份，由项目建议单位填写并经各有关直属挂靠单位、直属检验检疫局及省质量技术监督局科技管理部门签署意见后，报送国家质

2、检总局科技司科技管理处。未盖公章者，不予受理。三、建议书中计划编号和国家质检总局科技主管部门审批意见由国家质检总局科技主管部门填写。四、“申请项目经费预算表”填写说明：1、 科研业务费：外单位的计算、测试分析费，国内调研费，本项目的资料、报告、论文印刷费，科技成果查新、验收（鉴定）费、申报专利费。2、 实验材料费：试验用动植物、原材料、试剂、药品等消耗性物品购置费。3、 仪器设备费：小型专用仪器设备购置费，自制仪器设备的材料、配件和外协加工费。4、 协作费：指给付外单位协作者的验证协作经费。5、 其他费用：其他需要支付的合理费用。一、研究的目的、意义食品安全是一个全球性重大问题。其中，食物中毒

3、是影响食品安全性的一个重要因素。据国内外统计，在各种食物中毒中，细菌性食物中毒最多。研究表明，金黄色葡萄球菌污染食品后可引起毒素型食物中毒。据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒居第一位，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则高达45%，由此造成的经济损失也相当惨重。我国是一个食品生产和消费大国，随着市场经济的快速发展和生活水平的提高，特别是加入WTO后，市场经济的多元化和进出口货物总量的扩张速度加快，消费者对食品安全更加关注，食品安全与食品贸易的关系更为密切，提高我国食品安全水平的要求越来越迫切，为确保食品安全与食品贸易，检验检疫系统需要大力加强食品检验的力度，建立快速

4、高效的检验运转机制。而传统的检验方法已不适合时代发展的要求，市场迫切需要建立快速、灵敏的金黄色葡萄球菌的检验方法。因此，改进检验检疫方法，提高检测水平和工作效率，缩短检验检疫流程，加快速度，是我国乃至国际检验检疫工作中的一个重要问题。本研究主要针对金黄色葡萄球菌的致病特点，根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（Tnase）的基因nuc序列设计引物，通过PCR反应条件的不断优化，建立起方便、快速、灵敏、实用的检测食品中金黄色葡萄球菌的PCR方法，以缩短食品中金黄色葡萄球菌引起食物中毒的检测时间，提高检测方法的灵敏性，为金黄色葡萄球菌引起食源性疾病的快速诊断提供技术支持。二、 内外同类研究现状分析及存在的

5、问题（含科技查新结果）金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，可以产生多种致病因子，包括溶血毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、脱氧核糖核酸酶、肠毒素及溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。它们通过损伤血小板，破坏溶酶体，破坏人的白细胞和巨噬细胞，阻碍吞噬细胞的吞噬作用及沉积或凝固血液或血浆中的纤维蛋白等方式，引起肌体局部缺血和坏死或急性胃肠炎等多种机体病变。引起金黄色葡萄球菌食物中毒的致病物质主要是肠毒素（enterotoxin）肠毒素根据抗原性分为A、B、C1、C2、D、E和F等8个血清型。肠毒素是蛋白质，溶于水，相对分子质量约为30000，耐热，食品中的毒素不因加工而灭活

6、；对蛋白酶也有耐性，故在消化道中不被破坏。此毒素还可引起猴、猫呕吐，可能是毒素作用于肠道神经受体后，刺激呕吐中枢所致。A型肠毒素是最常见的与疾病有关的毒素，B型次之，C型较少，D型主要存在于污染的乳制品中。B型毒素能引起金黄色葡萄球菌伪膜性肠炎。目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生法定检验项目。我国对金黄色葡萄球菌目前采用的方法是以国家标准GB4789-10-94及检验检疫系统行业标准SN0172-92作为依据。金黄色葡萄球菌肠毒素的检测主要有动物试验、血清学试验、免疫荧光试验及酶联免疫吸附等方法，其主要依赖于免疫学技术，由于食品卫生学和临床诊断的原始样品，一般不是纯菌株的培养物，且混有

7、大量的杂菌，常规鉴定方法通常要从样品中进行纯培养，步骤繁多，致使实验周期延长，整个检测过程获得最终结果需时5d左右，既费时又费力，并造成货物积压，也影响货物的及时出运，并使货主的仓储成本提高，造成较大经济损失，使其在食品卫生学鉴定时受到限制。近年来PCR技术的发展为食品中病原微生物的鉴定提供了新的途径。目前国外利用PCR法检测金黄色葡萄球菌已在医学上取得了很大成功。而在食品中对金黄色葡萄球菌检测起步较晚。我国已将PCR检测应用到了医学检测领域中，但PCR检测食品病原菌的研究工作起步较晚，还不成熟，至今国内极少有利用PCR技术检测食品（乳品）中金黄色葡萄球菌的研究。由于金黄色葡萄球菌外毒素基因位

8、于金黄色葡萄球菌基因组上，以制备的基因组DNA为模板，根据金黄色葡萄球菌外毒素基因序列设计引物，建立起金黄色葡萄球菌外毒素基因的PCR鉴定技术，在短时间内可以鉴定出食品中是否存在金黄色葡萄球菌。然而利用PCR法检测食品中的金黄色葡萄球菌所选取的靶基因主要为各型肠毒素的基因，而肠毒素分型较多，给实际检测工作带来不便。而利用其耐热核酸酶（Tnase）的基因nuc作为靶基因，则更有利于实际检测。注：科技查新结果见附件（查新报告）三、研究内容及预期达到的最终目标（主要技术、经济指标与研究结果）本研究主要包括以下几方面内容：1、探寻从乳样品中直接提取金黄色葡萄球菌DNA的有效方法，省略前增菌纯化步骤，并

9、消除PCR反应抑制因子，以缩短检测时间和提高检测的准确性。检测样品DNA模板的精确获取技术是食品中致病微生物快速检测研究的瓶颈，此项研究将为食品中致病微生物快速检测技术的发展提供有力支撑。2、采用编码产毒金黄色葡萄球菌共有的耐热核酸酶（Tnase）的基因nuc作为靶基因，设计引物，以提高此检测方法的通用性。耐热核酸酶（Tnase）为产毒金黄色葡萄球菌之典型特征，此酶非常耐热，在100加热30min，不易丧失活性。而编码耐热核酸酶的基因nuc为致病金黄色葡萄球菌所特有的并且是高度保守的基因，因而以耐热核酸酶的基因nuc为靶序列，进行PCR扩增是检测金黄色葡萄球菌的有效手段。3、摸索并优化PCR反

10、应条件，以建立一种适用于乳品等行业鉴定金黄色葡萄球菌的方便、可靠、快速的检测方法，制作出专适于乳品行业鉴定金黄色葡萄球菌的快速检测试剂盒。本研究预计取得以下研究结果：1、从乳样品中直接提取金黄色葡萄球菌DNA的有效方法。2、建立一种适用于乳品行业鉴定金黄色葡萄球菌的方便、可靠、快速的检测方法，制作出专适于乳品行业鉴定金黄色葡萄球菌的快速检测试剂盒。3、初步建立以乳源为主的金黄色葡萄球菌菌种数据库；4、在国内期刊发表文章3-4篇。项目完成后拟提交的样品(样机)、技术文件及相关资料清单1、从乳样品中直接提取金黄色葡萄球菌DNA模板的试剂配方及操作方法；2、专适于乳品行业鉴定金黄色葡萄球菌的快速检测

11、试剂盒的试剂配方及操作方法；3、以乳源为主的金黄色葡萄球菌菌种数据库的菌株清单；4、3-4篇国内期刊发表的文章清单。四、采用的研究、试验方法和技术路线（包括工艺流程）提取各个标准菌株的基因组DNA采用标准金黄色葡萄球菌菌株对设定引物的PCR反应条件进行选择和优化用表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、蜡样芽胞杆菌作对照进行PCR扩增检测引物对金黄色葡萄球菌特异性 采用标准金黄色葡萄球菌菌株 采用生理生化的方法探寻从乳样品中直接获取 乳中金黄色葡萄球菌分离鉴定金黄色葡萄球菌DNA模板 的有效方法 建立以乳源为主的 金黄色葡萄球菌菌种数据库 提取金黄色葡萄球菌各个菌株DN

12、A(做模板) 用设计引物进行PCR扩增 检测引物对乳中分离出的金黄色葡萄球菌 不同菌株的普遍适用性 - 根据已总结出的从乳样品中直接获取金黄色葡萄球菌DNA模板的方法，对从乳中分离出的金黄色葡萄球菌各个菌株分别处理获取模板，进行PCR扩增,检测引物对金黄色葡萄球菌不同菌株的灵敏度五、项目年度计划内容及考核目标内容（每栏限125字）2008年度1、试验的准备：包括订购试剂、购买菌种和资料查新等。2、采用标准金黄色葡萄球菌菌株对设定引物的PCR反应条件的进行选择和优化。3、对表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌分别提取DNA进行PCR扩增，检

13、测引物对金黄色葡萄球菌特异性。2009年度1、采用标准金黄色葡萄球菌菌株探寻从乳样品中直接获取金黄色葡萄球菌DNA模板的有效方法。2、对乳中的金黄色葡萄球菌进行分离，采用生理生化的方法进行鉴定。3、发表论文2篇。2010年度1、对从乳中分离出的金黄色葡萄球菌各个菌株提取DNA进行PCR扩增，以检测引物对金黄色葡萄球菌不同菌株的普遍适用性2、根据已得出的从乳样品中直接获取金黄色葡萄球菌DNA模板的方法，对从乳中分离出的金黄色葡萄球菌各个菌株分别处理获取模板，进行PCR扩增，检测引物对金黄色葡萄球菌不同菌株的灵敏度。3、发表论文1-2篇，申请国家专利1-2项。4、总结实验资料，撰写结题报告。六、准

14、备工作情况（已有的工作基础、仪器设备及安全措施）1、 主持牛乳中芽孢杆菌的动态变化及部分生物学特性的研究；（自选项目，已完成）2、 主持马奶酒乳酸菌胞外多糖生物合成条件的研究；（自选项目，已完成）3、 主持内蒙古鄂尔多斯地区螺旋藻多糖生物活性作用的研究；（内蒙古自然科学基金项目，在研）4、 主持马奶酒生物活性的研究；（内蒙古自然科学基金项目，已完成）5、 主持PCR技术检测编码绿脓杆菌外毒素A基因；（自选项目，已完成）6、 主持鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌抑制作用及其抑菌机理的研究；（自选项目，已完成）7、 参加生物活性乳及其制品的研究（国家自然科学基金项目，已完成）8、 牛乳中金黄色葡萄球菌生物

15、学特性的研究”(自选在研项目)。如果项目活的资助，主要研究内容可在内蒙古农业大学乳品生物工程国家教育部重点实验室完成，并且具备具有雄厚实力的技术力量。七、经费预算申请资助总金额（万元）2008 年2009 年2010 年30101010其他经费来源及金额（万元）内蒙古农业大学食品科学与工程学院已资助1万元用于自选项目“牛乳中金黄色葡萄球菌生物学特性的研究”(在研课题)。经费支出明细金额（万元）计算根据及理由1、科研业务费；6.0国内调研费:1.5外单位的计算、测试分析费等:2.0验收（鉴定）费、申报专利费等:2.0资料、报告、论文印刷费及科技成果查新费等:0.52、实验材料费；17.5试验用动

16、植物、原材料等:2.0试剂、药品等消耗性物品:15.53、仪器设备费；1.5小型专用仪器设备购置费:1.0自制仪器设备的材料、配件和外协加工费等:0.54、协作费；1.5验证协作经费等5、其他费用3.5劳务费、津贴费等八、参加单位、人员及任务分工单位人员名称出生年月职称/职务专业特长任务分工内蒙古国际旅行卫生保健中心孙 志1962.03.01主管医师食品检验检疫项目主持内蒙古农业大学殷文政1959.03.23教 授食品安全及食品微生物的研究与应用项目负责内蒙古国际旅行卫生保健中心郭文绣1975.09硕士、工程师分子生物学主要参加内蒙古国际旅行卫生保健中心云华1962.09.24主管检验师医学检验主要参加内蒙古农业大学李少英1960.09博士、副教授微生物与免疫学主要参加内蒙古国际旅行卫生保健中心庞淑芳1958.3.副主任医师预防医学主要参加内蒙古农业大学于庆华1977.04.11硕士食品微生物的研究与利用主要参加项目负责人（签字） 年 月 日九、项目建议单位审查意见： 经办人： 负责人： （公 章） 年 月 日一十、 有关直属挂靠单位、直属检验检疫局、省质量技术监督局科技管理部门审查意见： （公 章）负责人： 年 月 日十一、国家质检总局科技主管部门审批意见： （公 章） 年 月 日