一步一步教你使用 NCBI 查找DNA.docx

1、一步一步教你使用 NCBI 查找DNA一步一步教你使用 NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列比对等2013-10-23 11:50阅读(97)转载自试剂达人 赞(1441) 评论(2) 转载(1.70万) 分享(1.03万) 复制地址 收藏夹按钮收藏 更多上一篇|下一篇：生物分子类实验室.一步一步教你使用 NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列比对等最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对，这些问题在 NCBI

2、 上都可以方便的找到答案。现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的

3、感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。第一部分 利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1 打开Map viewer 页面， 网址为：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/index.html在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。操作完毕如图所示：2点击“GO”出现如下页面：3 在步骤二图示的右下角

4、有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框， 在Gene前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。现在普遍采用的是最上面的那个序列，这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的一个序列。我也推荐大家使用这个序列。4点击上述三条序列第一条序列（即 reference）对应的Genes seq，出现新的页面，页面下方为：5点击上图出现

5、的“Download/View Sequence/Evidence ”，即下载查看序列等功能，结果如图所示：先对上面这张图做点简要的说明，在 Sequence Format（序列输出格式）后面是一个下拉式选择菜单，默认的为 FASTA 格式，还有一个是 GenBank 格式。我推荐大家选择 GenBnak格式，因为这个格式提供了很多该基因的信息，而 FASTA格式只有基因序列。6在 Sequence Format 后选择 GenBank，然后点击下面的 Display，目的基因的相关信息和序列就出现在眼前了。点击后如图所示（网页较大，只抓取一小部分以作示范） ：在上述打开的网页中，你可以看到基

6、因长度，基因序列，以及这个基因是如何被报道出来的等各种信息。你会看到: mRNA join(3598.3678,3841.4031,5090.5203,5911.6057, 7803.8394)这代表了从基因的 3598位开始就是转录区了， 即我们常说的 mRNA 片断， 由于内含子的存在，所以 mRNA 在DNA 序列上分成了几段。CDS join(3660.3678,3841.4031,5090.5203,5911.6057, 7803.7970)CDS 代表编码序列，即蛋白编码区是从 3660 开始的（ATG） ，由于剪接作用所以 CDS 区也是不连续的。说到这里，可能很多朋友都已经明白

7、了 promoter 即启动子区域在哪里了。但我还是再唠叨几句：转录起始位点前面是基因的调控区，启动子区没有明显的位置定义，大家也只是猜测它的大体位置，如果你要研究 promoter 区的话，建议你选择转录起始位点前的 2000个碱基进行研究，一般默认的是这样。当然你如果觉得长度太长不好研究的话，也可以只研究-1000 到0这一千个碱基，因为一般情况下，启动子区的变异都在这个区域内。这样大家就可以找到自己的目的基因序列和启动子了，这种方法可能使用的人不是很多，但我个人比较喜欢，因为它最大的优点是可以找到启动子区域和其他调控区域。希望大家可以发帖交流，让我们把 NCBI 用的更好！6第二部分 如

8、何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列（依然以人类的 IL6 为例）1进入NCBI 主页：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/在 search 后面选择 Gene，在 for 后面填写需要查找的基因的名字。如图所示：出现了很多基因序列，在每个序列的右边还有“Order cDNA clone” 的链接，这些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是别名（Other Aliases）与你的目的基因一致，根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。上图中我需要的 IL6 是标号为2的序列。2.1 查找 cDNA 序列2.1.1 点击Order cDNA clone, 出现目的页面如

9、图所示：2.1.2 点击Clone Sequence 后面的链接即可得到cDNA 序列。点击后如图所示（只抓取其中一部分）2.2 查找 mRNA、蛋白序列回到步骤 1 点击“Go”之后出现的页面，点击目的基因的名字，出现以下页面(只抓取相关部分)：页面的下半部分，即可以获取 mRNA和蛋白序列的部分：找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，它分为几个板块，第一个“mRNA andProtein ”区可以让我们找到连续的编码 mRNA 序列和蛋白序列。在 mRNA and Protein下面有两个序列代码（中间划有一个箭头） ，这代表了 mRNA序列和蛋白序列

10、。分别点击就可以得到相应的序列页面。点击后如图所示，mRNA 序列：NCBI Reference Sequences (RefSeq)的第二个板块是 Reference assembly，它下面显示的是 Genomic ，点击 Genomic 下面Reference assembly 对应的 Genbank 或 FASTA 即可出现编码的 DNA 序列（注意：只是编码序列，其中包括内含子，但一般没有 5非编码区） 。一步就不做贴图演示了吧， 呵呵。这样我们就可以找到基因的 cDNA 序列、连续的编码 mRNA 序列、蛋白序列以及含有内含子的编码DNA 序列了。相信这些操作对很多战友还是有用的。

11、如果大家有更好的方法，欢迎发帖交流！友情提示：在 NCBI 里打开的每一个页面都会给我们提供大量的信息，大家不妨好好看看，可能会有令我们惊喜的收获！最后唠叨一句： 最近我实验比较忙， 只能在深夜发帖， 可能要过几天再发第三部分Partthree 运用STS 查找已经公布的引物序列，希望“期待下集”的朋友可以理解。第三部分 运用STS 查找已经公布的引物序列STS，序列标签位点（Sequence Tagged Site）：一段短的DNA 序列（200500 个碱基对），这种序列在染色体上只出现一次，其位置和碱基顺序都是已知的。在PCR 反应中可以检测处STS 来，STS 适宜于作为人类基因组的一

12、种地标，据此可以判定DNA 的方向和特定序列的相对位置。以上内容基本是STS 的定义，我主张活学活用，下面就介绍一下我个人用STS 数据库查找引物的一点经验。还是使用人的IL6 基因为例，呵呵1 打开 NCBI 主页，在 Search 后面的下拉菜单选择 UniSTS，在 FOR 后面填写目的基因。操作完毕如图所示这是你会发现 NCBI 又提供了很多序列，下面我们还是要初步筛选我们需要的序列。2根据物种、目的引物所在染色体的位置等选择相应序列（可能不只一个） ，点击。下面以点击第一个进入的画面为例。你会发现这个页面直接就给出了引物序列，PCR之后的片段长度也是给了的（247bp） 。下面还有很

13、多相关的信息3点击GeneBank Accession 后面的代码，进入下一个页面。啊！前后引物都呈现在眼前了，还有反应体系和反应条件！其中 Primer A 是前引物序列，Primer B 则是后引物序列，并且给出了他们在 DNA 序列中的位置。有兴趣的朋友可以在序列中找一下，是可以找到的， 不过要注意，PCR 是双链扩增，在序列中可以直接找到的是 Primer A 的原序列 和 Primer B的互补序列。在步骤二里面我只点开了一个序列，继续打开其他的可能还会有对自己有用的引物，不过这要你自己慢慢发掘了。这种寻找引物的方法有点投机取巧的味道，实用程度不是很高，但如果这里面恰好有你想 P 的

14、片段的话，恭喜你，这些引物都是很成熟的引物，可以直接拿过来使用了。如果想寻找引物，大家可以查阅相关论文，已经报道的引物我们为什么不用呢？！既省时间，可靠性又强。如果这两种方法都不能找到你需要的引物的话， 那就自己设计吧， 建议使用 Primer 5 和Oligo。引物设计的详细内容我在这里就不多说了，推荐两个帖子给大家看一下，第一个是本版版主 liuzeyi2002 发起的，内容很丰富，很值得学习，另一个则是我发的。第四部分 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性提到序列比对，绝大多数战友都会想到 BLAST，但 BLAST 的使用确实又是一个很大的难题， 因为他的功能比较强悍，

15、里面涉及到的知识比较多， 而且比对结束后输出的结果参数 （指标）又很多。如果把 BLAST 的使用详细的都讲出来，我想我发帖发到明天也发不完，更何况我自己也不是完全懂得 BLAST 的使用。 所以我在这里也就“画龙点睛”以比对核酸序列为例来给大家介绍一下 BLAST 的使用， 也算是 BLAST 的入门课程吧。 请看帖的战友好好体会，如果你用心看，在看帖完毕之后 BLAST 的基本使用（包括其他序列的比对）应该没有问题了。1打开BLAST 页面，http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/打开后如图所示：对上面这个页面进行一下必要的介绍：BLAST 的这个页面主体部分（左

16、面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、BasicBLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂这三个短语的意思，我就不多说了；我要说的是，可以认为这是三种序列比对的方法，或者说是 BLAST 的三条途径。第一部分 BLAST Assembled Genomes 就是让你选择你要比对的物种，点击相应物种之后即可进入比对页面。第二部分 Basic BLAST 包含了 5 个常用的 BLAST，每一个都附有简短的介绍。第三部分 Specialized BLAST 是一些特殊目的的 BLAST，如 IgBLAST、SNP 等等，这个时候你就需要在 Spec

17、ialized BLAST部分做出适当的选择了。总之， 这是一个导航页面， 它的目的是让你根据自己的比对目的选择相应的 BLAST 途径。下面以最基本的核酸序列比对来谈一下 BLAST的使用， 期间我也会含沙射影的说一下其他序列比对的方法。2 点击Basic BLAST部分的nucleotide blast 链接到一个新的页面。打开后如图所示：介绍一下上述页面：Enter Query Sequence 部分是让我们输入序列的，你可以直接把序列粘贴进去，也可以上传序列，还可以选择你要比对的序列的范围（留空就代表要比对你要输入的整个序列） 。Job Title 部分还可以为本次工作命一个名字。Ch

18、oose Search Set 部分是让我们选择要与目的序列比对的物种或序列种类（genomeDNA、mRNA 等等） 。如果是人或老鼠的话，就可以直接选择了如果是其他物种就要选择“others”了，这时候网页会主动跳出一个下拉对话框和一个输入式对话框，你可以分别选择和输入要跟你的序列比对的序列种类和物种。下面的 Entrez Query 可以对比对结果进行适当的限制。Program Selection 部分其实是让我们选择本次比对的精确度，种内种间等等。在 BLAST 按钮下面有一个“Algorithm parameters” ，这是参数设置选项，一般用户使用不到此项，所以它比较隐蔽，点击，

19、原网页下方即可增加了 Algorithm parameters 的内容。大部分战友都用不到更改这里面的选项，我也不多说了，有兴趣的朋友可以自己研究一下。3依次填写上述网页必须部分，点击 BLAST 按钮后，出现如下界面（只截取其中一部分） ：出现的这个结果页面信息含量非常大，如果我们用心观察，还是可以发现其中的一些主要指标的。列举上图也是为了给大家展示一下这些评价标准。其中 Description 部分推荐大家详细看一下，另外说一下“E value” 这个指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如 Totle score）都是数值越高相似度越高。在这个图示的表格下方就是具体的相似性的核酸序列了，还配合着各种参数的得分。好了，各位亲爱的战友，我的 BLAST 就发到这里为止了，更具体的东西有待大家一起去努力研究。伴随着 BLAST 的终结，我的“一步一步教你使用 NCBI”也要暂时告一段落了，很高兴自己发第一个帖子时说的话今天终于做到了。 以后如果我有新的 NCBI 使用方法的话，我还会添加到这里来，但我想这一阵子是不会接着发了，呵呵。原始版本下载：