pro260中文操作.docx

1、pro260中文操作Experion Pro260Analysis KitInstruction Manual1介绍11背景信息随着“lab-on-a-chip”微流技术的出现，全自动电泳方法为蛋白质组和基因组表达分析的发展提供了全新的有利条件。芯片由一个塑料盒和一个附在上面的小玻璃板组成。玻璃板上刻有许多的微通道，以优化过的网络模式排列。电泳工作站对整个通道网络上的电压和电流进行控制，引导样本通过这些微通道。这种在微流芯片上进行的操作，可在不需用户任何干涉的情况下，完成包括电泳，染色，脱色，检测及基础数据分析等几项连续的步骤。Experion系统(图1.1)采用LabChip微流技术对蛋白质

2、和RNA分析进行全自动电泳。图1 Experion系统包括下列配件：(1)自动电泳工作站，(2)制胶工作站，(3)用于RNA分析的涡旋工作站，(4)系统操作和数据分析软件，及(5)分析试剂盒(单独出售)，其包括(a)芯片和(b)用于蛋白质，标准灵敏度RNA，及高灵敏度RNA分析的试剂。12 产品描述12.1 电泳工作站电泳工作站(图1.2.1a和b)装有所有必需的电子，光学，及硬件配件，可在一个30分钟的步骤中自动完成包括电泳，染色，脱色，斑点检测，及图像获取等几个步骤的操作。图1。2。1a. 自动电泳工作站。(1)绿色盖子，(2)“开盖”托，(3)二极管电源状态指示，(4)电源按钮，(5)橡

3、胶底架。图1。2。1b. 开盖的电泳工作站。(1)电极部件，(2)电极线，(3)芯片平台。122 制胶工作站制胶工作站(图1.2.2a和b)用于制备样本分析的芯片。制胶工作站对芯片的装填孔施加压力，并使用预先测定的时间和压力设置将凝胶染色溶液注入到微通道的网格中。图1。2.2a. 制胶工作站(合盖)。(1)液晶显示屏(带有预设的时间和压力以及整合定时器)，(2)控制按钮，(3)开盖控制杆。图1。2.2b. 制胶工作站(开盖)。(1) 制胶密封设备，(2)整合活塞泵，(3)芯片平台。13. 涡旋工作站涡旋工作站(图1.3.)确保样本和用于RNA分析的加样缓冲液(试剂盒中配备)在芯片孔中完全混合。

4、图1.3. 涡旋工作站配有和未配有插入的芯片。(1)涡旋适配器，可安全的固定芯片，(2)1分钟计时器开关。1.4系统操作和数据分析软件软件程序包括对电泳工作站运转的控制和用来评测结果的数据分析工具。在运行期间，应用软件可监测运行进展或者回顾上次样本的结果。请参见软件提供的在线使用说明。Pro260 Analysis Kit中的试剂 ItemDescriptionVolume/Vial10-Chip Kit25-Chip KitPro260 gelpolymer sievingmatrix520 l3 vials5 vialsPro260 stainProprietary fluorescent

5、 dye45 l1 vial2 vialsSample bufferContains lower and upper400 l1 vial2 vialsPro260 ladderPrecision Plus Protein standard60 l1 vial2 vialsSpin filtersN/A35Pro260 Kit ChipsItem10-Chip Kit25-Chip KitPro260 chip10 chips25 chipsCleaning chip1 chip1 chip试剂盒注释:EXPERION Pro260KIT样品孔数10孔每孔样品孔所需样品量4ul实验所需时间-3

6、0分钟蛋白分子量检测范围10-260kd最先蛋白检测量10ng额外所需设备和试剂：Experion全自动电泳工作站置胶工作站移液器，0.5ml 离心管离心机95100水浴锅经过0.2ul膜过滤的去离子水BME（catalog# 161-0710）项目储存条件有效期Experion Pro260试剂49个月Experion Pro260 芯片室温9个月Gel-stain solution4自过滤起1个月Gel solution4自过滤起1个月2实验过程21实验程序简介1 gel-stain solution的准备和gel的过滤2样品buffer的准备3 Ladder和样品的准备4将gel-sta

7、in置入芯片5芯片加样6进行蛋白分析7清洗电泳工作站电极22注意事项1. 所有试剂须4储存2. 使用前，试剂应在室温平衡15-20分钟。Experion Pro260 Analysis Kit中所含的二甲基亚砜（DMSO）应在使用前完全溶解。3. 使用前所有试剂必须振荡悬浮。4. 避光保存Pro260stain，样品buffer，gel-stain solution5. 实验操作时须一次性手套，操作芯片时仅需接触辛片边缘，切勿接触芯片玻片。芯片仅当使用时才可从包装盒中取出。6. 在加样和样品制备时，应防止污染7. 样品加完后，应在5分钟内进行检测。时间放置过长，会使样品蒸发，导致实验结果错误。

8、8. 当电泳检测进行时，切勿打开全自动电泳工作站。9. 切勿将全自动电泳工作站放置于不稳的实验台面。10. 缓慢将试剂和样品垂直的加入芯片孔中，切勿将移液管中的气泡加入芯片孔中。11. 在样品准备和试剂准备时，切勿使用包被和处理过的管子，否则会导致错误结果。23gel-stain solution的准备和gel的过滤1将Pro260 gel（蓝色帽）和Pro260 stain（绿色帽）在使用前在室温避光平衡15分钟。2使用前振荡所有试剂并离心3-5秒钟，确保DMSO完全溶解3取Pro260 stain（绿色帽）20ul加入520ul Pro260 gel（蓝色帽）中，振荡混匀并离心几秒钟，即成

9、为gel-stain solution。4盖紧Pro260 stain（绿色帽）避光保存在4度。5将Pro260 gel-stain solution （步骤2.3中的3）加入spin-filter中，将Pro260 gel（蓝色帽）加入另一spin-filter离心管中，离心5分钟，10000g。6弃filter离心管，留下装有gel和gel-stain的管子，做好标记并标明时间。注意：准备好的Pro260 gel-stain solution和gel的使用有效期为4周。4周后须将这些这些准备好的试剂重新过滤，才可以使用。gel-stain solution须避光，4保存。4保存的Pro26

10、0 gel-stain solution和gel在使用前，须提前15钟取出24样品buffer的准备1从包装盒中取出样品buffer（sample buffer 黄色帽），室温平衡振荡并离心，避光保存2在还原状态下分析蛋白，须在30ul sample buffer中加1 ulBME；注意：在非还原状态下，须在30ul sample buffer 中加1 ul水。而后振荡混匀并离心。25样品和Ladder制备1 Pro260试剂盒使用前须在室温平衡，振荡并离心。2用2.4中所准备好的样品 buffer准备样品和Pro 260 Ladder（红色帽）。在0.5ul 离心管中加入4ul Ladder

11、和2ul sample buffer；振荡混匀并离心。在0.5ul 离心管中加入4ul sample和2ul sample buffer；振荡混匀并离心。注意：当准备空白样品时，许在在0.5ul 离心管中加入4ul空白样品溶液（如1XPBS）和2ul sample buffer；振荡混匀并离心。3将准备好的Pro 260 Ladder和样品（步骤2.5中的2）在95-100水浴3-5分钟。4冷却并离心15秒钟，而后在上述2管（步骤2.5中的3）中加入84ul的水，再次振荡并离心，准备加入芯片加样孔中。注意：实验中须使用蛋白级水。稀释好的样品和Pro 260 Ladder在避光，室温条件下仅在几

12、个小时内可以有效使用。26芯片置胶准备1打开置胶工作站（Experion priming station），并打开蛋白质芯片包装，取出芯片。2将过滤好的12ul gel-stain（步骤2。3中的6） 垂直加入gel-priming 孔（GS深色），防止产生气泡。3将加好的上述芯片嵌入置胶工作站的芯片平台，芯片上的箭头标记指示了该蛋白芯片在芯片平台上的嵌入位置，而后设置压力B和时间34按下start键，切勿在工作状态打开置胶工作站。5工作完毕后，打开置胶工作站取出芯片，翻转芯片检查芯片是否有气泡，如有则应重新准备另一芯片。27在芯片中加上样品和ladder1吸出gel-priming 孔（GS

13、深色）中的残余gel-stain。2在4孔GS中加入12ul gel-stain（步骤2。3中的6）。3在G孔中加入已经过滤好的gel（步骤2。3中的6）。4确保上述4孔中没有气泡。5加入6ul样品于孔1-10中，在L孔中加入6ul Pro260 Ladder。6立刻进行电泳检测。28 Pro260电泳检测1按下Experion的绿色键，接通Experion的电源。2启动Experion软件3打开全自动电泳仪，将芯片嵌入芯片平台，关上电泳仪4选择NEW RUN和Experion Pro260操作系统5按下Start键，开始电泳。6电泳结束后，要及时将芯片从芯片平台中取出，以免污染电极。29实验

14、检测后的电极清洗1 在清洗芯片中加入800ul 去离子水（0.2ul膜过滤），轻轻拍击芯片，将加样孔中的气泡赶出。2 打开全自动电泳仪的盖子，将（2.9中步骤1）中的芯片放置进全自动电泳仪。3 关上盖子，让（2.9中步骤1）中的芯片停留在全自动电泳仪中1分钟。4 打开盖子，取出清洗芯片，倒出芯片中的去离子水水。5 让全自动电泳仪的盖子打开30秒钟，吹干电极，而后关上盖子。6 为防止污染电极，清洗芯片使用完后，重新用去离子水清洗该芯片。3数据分析31 Pro260 Ladder样品的分离每次电泳时，Experion软件就会运用Pro260 Ladder程序，显示Pro260芯片L孔中的Ladde

15、r样品的电泳图像。Pro260Ladder的电泳图像显示有9个峰。软件会识别并将最小的1.2KD设置为最低峰，260KD为最高峰。在最低峰1.2KD和10KD之间的峰，可以认为是Experion的“系统峰”。当分子量Ladder被清楚地分开的话，那么如（图3.1）所示，可以清晰地看见其九个峰电泳峰。图3.1 Pro260 Ladder的全自动电泳图谱显示了该Ladder所具有的9个峰，系统峰，最高峰（upper marker），和最低峰（Low marker）32蛋白质样品的分离如图3.2所示，为用Pro260 analysis kit分析的牛纤维素水解酶的电泳图像。电泳图像中最低和最高峰分别

16、对应对照MARKER的最低和最高峰。该对照MARKER用于校正Experion 样品buffer和Pro260 Ladder的误差。在最低和最高峰之间的峰为牛纤维素水解酶电泳所得到的峰。图3.2牛纤维素水解酶样品的全自动电泳图谱显示了，最低对照峰（low marker），系统峰，牛纤维素水解酶的峰和最高（marker）4常见疑难解答（troubleshooting）41电泳和priming station-屏幕显示“chip error”A 1个或多个孔加样不正确，电极没有完全浸没。所有的加样孔必须加样，没有样品的孔，要以空白样品代之。B 样品孔中的气泡会影响电极接触。轻拍芯片或用干净的枪头排

17、除气泡。必须垂直并缓慢地加样品到芯片的加样孔，枪尖须深入加样孔底部。切勿将枪头的空气加入样品孔，以防产生气泡。-“Check Seal”指示灯闪亮检查或重置置胶工作站中的O-型垫圈。检查芯片是否正确嵌入置胶工作站的芯片平台。检查gel-stain是否正确加入GS孔中42 Pro260分析-在电泳图上未能检测到条带错误的加样操作和芯片置胶操作会导致芯片加样孔底部含有气泡。所以在芯片置胶和加样之后，必须检查芯片加样孔中是不是有气泡。样品孔内的样品过少，检查是不是加样6ul。样品溶液中不含样品或者样品准备错误。请参阅2.4和2.5的样品制备。芯片的孔道被杂质所堵住。使用高质量的水（如去离子水的水）检

18、查gel和gel-stain是不是过滤干净。通过对样品进行离心最大可能的去处样品中的不容物和杂质。-在电泳图中的泳道中有小的杂峰。在样品中混有小气泡。在置胶完成后，检查在芯片中是不是有气泡。在置胶过程中，错将gel加到别的孔中。在置胶前确保gel-stain加入GS孔中。-置胶工作站显示“Replace Seal”，但是芯片仍在。检查或者重新放置O-型垫圈。试剂没有平衡至室温。确保试剂冷却至室温，并充分混合。确认试剂没有过期，光敏感试剂应避光保存。用Experion专用清洁剂清洗电极，去处电极上的污染物。在清洁芯片中加入800ul清洁剂，静置于Experion中2分钟，取出清洁芯片。放入另一加

19、好800ul水的清洁芯片，静置5分钟。换水后重新放入Experion静置5分钟，取出芯片。-Ladder和样品的电泳分离结果很差。Pro260 ladder和样品没有充分变性。确保Pro260 ladder和样品在95-100水浴中变性3-5分钟。样品中有污染物。查阅（section 4），有不明的污染物影响蛋白分析。切勿使用高压灭菌水稀释样品和LadderExperion Pro260 Analysis Kit 操作简介Pro260 Analysis Kit中的试剂 ItemVolume/Vial10-Chip Kit25-Chip KitPro260 gel520 l3 vials5 vi

20、alsPro260 stain45 l1 vial2 vialsSample buffer400 l1 vial2 vialsPro260 ladder60 l1 vial2 vialsSpin filtersN/A35Pro260 Kit ChipsItem25-Chip KitPro260 chip25 chipsCleaning chip1 chip试剂盒注释:EXPERION Pro260KIT样品孔数10孔每孔样品孔所需样品量4ul实验所需时间-30分钟蛋白分子量检测范围10-260kd最先蛋白检测量10ng额外所需设备和试剂：Experion全自动电泳工作站置胶工作站移液器，0.5

21、ml 离心管离心机95100水浴锅经过0.2ul膜过滤的去离子水BME（catalog# 161-0710）实验程序简介：一Gel-stain溶液和样品Buffer的准备1将20ul Pro260 stain（蓝色帽）和520ul gel（绿色帽）混合后，加入过滤离心管（spin filter）中，10000g 5分钟离心过滤，制成gel-stain。2将另外1管520ul gel（绿色帽）加入过滤离心管（spin filter）中10000g 5分钟离心过滤。注意：使用后余下的gel-stain和gel，须4避光保存，有效期为1个月。3当待检样品要在还原状态下检测，每块芯片的样品容液为：1u

22、l BME（-mercaptoethanol）+30ul样品buffer（黄色帽）；当待检样品要在非还原状态下检测，每块芯片的样品容液为：1ul 去离子水+30ul样品buffer（黄色帽）二样品和LADDER的准备1将蛋白样品4ul和2ul样品buffer混合。2将LADDER 4ul（红色帽）和2样品buffer混合。3将“1”和“2”2管在95加热3-5分钟变性，并离心。4在上述2管，蛋白样品管和LADDER管中各加84ul去离子水，制备好样品和LADDER。三芯片置胶1从包装中取出一块Pro 260芯片2在“GS”孔中加入12ul 过滤好的gel-stain溶液3将加好gel-stai

23、n溶液的芯片（步骤2）插入置胶工作站的芯片平台。4设置置胶程序：压力B，时间3，而后启动。5置胶完毕后，检查置胶是否完成，芯片的微管道内有否混有气泡。四样品和LADDER加样1吸出置胶后Pro 260芯片GS孔中多余的gel-stain。2重新在4孔标有“GS”的孔中加入12ul gel-stain；在标有“G”的孔中加入过滤好的胶。3在样品孔中加入6ul制备好的样品，在L孔中加入6ul制备好的LADDER，如果样品少于10个，须以水或样品Buffer代之。五样品电泳检测启动全自动电泳仪的检测程序。在工具栏中选择并按下键，找到蛋白电泳标识，而后按下旁边的箭头键，即开始检测。六注意事项1所有试剂

24、须4储存2使用前，试剂应在室温平衡15-20分钟。Experion Pro260 Analysis Kit中所含的二甲基亚砜（DMSO）应在使用前完全溶解。3使用前所有试剂必须振荡悬浮。4避光保存Pro260stain，样品buffer，gel-stain solution5实验操作时须一次性手套，操作芯片时仅需接触芯片边缘，切勿接触芯片玻片，在加样和样品制备时，应防止污染6样品加完后，应在5分钟内进行检测。时间放置过长，会使样品蒸发，导致实验结果错误。7当电泳检测进行时，切勿打开全自动电泳工作站。8切勿将全自动电泳工作站放置于不稳的实验台面。9缓慢将试剂和样品垂直的加入芯片孔中，切勿将移液管中的气泡加入芯片孔中。10在样品准备和试剂准备时，切勿使用包被和处理过的管子，否则会导致错误结果。11操作全自动电泳仪前3小时，须将空调打开，温度在15-25，空气湿度在60%以下。12操作全自动电泳仪前须接通电源，并确认和电脑操作无误。