NiNTAsuperflowcartridge中文手册.docx

1、NiNTAsuperflowcartridge中文手册Ni-NTA Superflow Cartridge 手册用于手动或FPLC纯化His-tag蛋白目录：包装内容物（4）贮存和稳固性（4）平安方法（4）介绍（7）Ni-NTA Superflow Cartridge说明书（7）QIA表达系统（7）Ni-NTA Cartirdge 接头（14）天然或变性条件下纯化蛋白（15）说明书天然条件下清澈的菌液的制备（16）变性条件下清澈的菌液的制备（18）从细胞制备6XHis-tag的胞质蛋白（19）天然条件下从昆虫细胞中制备细胞菌液（20）利用注射器手动纯化6XHis-tag蛋白（21）利用自动层析

2、系统纯化6XHis-tag蛋白（22）问题的解决（23）附录A：Buffer成份（25）附录B; Ni-NTA Superflow Cartridge的清洁与再生（27）包装包括物Cat no. Ni-NTA Superflow Cartridge（1） Ni-NTA Superflow Cartridge（5） 说明书30721 5 130725 100 130760 1 130761 5 130765 100 1技术支持在QIAGEN，咱们为咱们的技术支持的质量和有效性而感到自豪咱们的技术部门是由有普遍实验体会的技术人员和专家组成的，他们都从事分子生物学而且熟练利用QIAGEN的产品。若是

3、您有任何问题或实验中碰到困难关于Ni-NTA SuperflowCartridge或QIAGEN的产品，请尽快联系咱们。QIAGEN用户是咱们改良和专业化产品的要紧信息来源。这些信息关于咱们的科研人员与其他的科学家一样重要。因此您若是有什么关于产品的建议或新的需要和技术等等请尽快联系咱们。关于技术支持和更多的信息请联系QIAGEN的技术效劳部或本地经销商贮存和稳固性Ni-NTA Superflow Cartridge应该贮存在2-8度。不要冷冻。Cartridges在如此的条件下能够贮存一年而性能可不能发生任何改变。产品局限性Ni-NTA Superflow Cartridge仅供科研利用。没

4、有声明或表述是用来为诊断，预防或医治疾病而提供信息。所有预料到的麻烦和注意事项东应该利用中注意。关于重组DNA实验，咱们推荐所有效户参照NIH指导方式，或其他的可用性指导方针。产品授权和中意的保证QIAGEN保证产品的成效在咱们的产品文献中都有描述。顾客关于产品的特殊用途必需决定它的适用性。若是不是由于利用造成的产品性能问题，QIAGEN将会免费改换或退货。咱们有权改换、更改或是调整任何产品以增强性能和设计。若是QIAGEN产品没有达到您的要求，联系咱们的本地技术部门或是销售商。咱们将相信您的理由或互换产品-只要您情愿。分离条件应用于QIAGEN科学仪器，效劳产品，干冰用于产品运输。请询问更多

5、的信息你还能够要求取得QIAGEN的条款和条件的副本，他会在咱们的发票后提供给您。若是您有什么关于产品说明和性能的问题，请联系QIAGEN技术效劳和本地经销商。平安方法当工作时利用化学药品时，通常要穿实验服装，带一次性手套和护目镜。更多的信息请咨询MSDSs。您能够在网站下载PDF或打印QANGE kit 和kit 组成以下危险和平安性用语适用于Ni-NTA Superflow Cartridge。包括乙醇和镍铵酸。损害性的，感光的，易燃的。危险和平安用语：R10-22-40-42/43。S24小时紧急情形紧急医疗信息24小时内能够从Poison Information Center Main

6、z, Germany取得，有英语、法语和德语三种。：+49-6131-19240介绍QIAGEN Ni-NTA Superflow Cartridge是预先装好Ni-NTA Superflow的1ml和5ml柱子，用来纯化6XHis-tagged蛋白，能够利用注射器、蠕动泵，或液相层析系统（例如AKTA或FPLC）Ni-NTA Superflow Cartridge1ml Cartridge5ml Cartridge介质Superflow(6%高胶连琼脂糖)珠子直径60-169微米柱子体积28mm最大承受压5bar，5bar，典型背景压力（BufferNP-10,10%甘油），（1ml/min

7、），（5ml/min）推荐流速1ml/min（155cm/h）5ml/min（170cm/h）最大流速10ml/min（1560cm/h）40ml/min（1360cm/h）柱连接表3，14页表3，14页短期储存PH稳定值(2H)2-142-14长期储存PH稳定值(2H)3-123-12吸附能力至少20mg(1膜20KDa)至少100mg(5膜20KDa)系统兼容性自动层析系统（例如AKTA，FLPC，BioLogic，BioCAD，Vision workstation）Cartridge材料聚丙烯连接器1/16”(入口)；M6(出口)Superflow自身最大能够利用的压力是10Bar。可是

8、，Cartridges的稳固性仅在小于5Bar保证高流速可能致使恢复6XHis-tagged蛋白减少蛋白不同吸附能力不同QIA表达系统QIA表达系统以6Xhis tag为基础，这是一个亲和标签由6个持续的His残基组成。那个亲和标能够被QIAGEN独特的专利产品Ni-NTA金属吸附层析柱显著的选择吸附。QIA表达系统那个独特的特性提供了大量的显著优势（表一）而并非适合其他亲和标签和层析方式表一：QIA表达系统的特点和优势特点优势在6XHis和Ni-NTA间高亲和性和选择性吸附在一步法标准纯化过程中的祷告纯度蛋白6XHis tag与Ni-NTA作用不受基质结构约束一步纯化能够在天然和变性条件下使

9、用温和的洗脱条件吸附、冲洗、洗脱失高度的可再生，对蛋白结构没有影响纯化蛋白可以直接应用于下游软件6XHis tag比其他常用标签小的多标签不会影响重组蛋白的结构和功能6XHis tag在生理PH不带电荷6XHis tag不会干扰分泌6XHis tag不会产生抗原性重组蛋白不用事先切除标签Ni-NTA SuperflowNi-NTA Superflow由连接Superflow树脂的Ni-NTA组成。它将出众的机械稳固性和显著的流动特性及高效的动力吸附能力相结合。吸附6XHis-tagged蛋白的能力是5-20mg/ml。这种树脂关于效率生产记录和FPLC的要求许诺利用一步法纯化6XHis-tag

10、蛋白。Ni-NTA能力出众，适应试剂范围普遍，例如2M NaCl，10mM DTT，8M尿素，及许多去污剂（表二）局限性Ni-NTA基质不要暴露在高浓度的还原剂中，例如DTT，DTE；高浓度下，这些试剂还原Ni离子还可能阻止吸附6XHIS-Tag蛋白。Ni-NTA基质在还原剂中会变成棕色。很多情形下，-巯基乙醇能够在浓度不高于20mM时利用，DTT兼容性证明浓度能够到10mM。EDTA，EGTA或其他任何强螯合剂吸附Ni离子并将他们从NTA上夺走。NTA基质缺乏NI时变白。利用任何还原剂或螯合剂都要当心，若是不确信，就在小量的Ni-NTA基质上作检测。高浓度的Buffer包括强的给电子集团或氨

11、基酸例如Arg、Glu、Gly、His，菌液中应该尽可能幸免。细胞应该被溶解。不要用强的螯合剂如EDTA，强的还原剂如DTT，或离子去垢剂如SDS。尽管有些例子说明这些试剂小剂量的应用没有问题，可是咱们仍是不推荐利用。更多的详细信息，见表二Ni-NTA Superflow试剂的兼容性试剂作用建议缓冲液试剂Tris，HEPES，MOPS二级胺或三级胺会还原Ni离子可以用低于100mM。推荐使用磷酸盐螯合剂EDTA，EGTA从基质螯和Ni离子低于1mM有成功的先例，但是应该小心使用硫化试剂-巯基乙醇DTT，DTE阻止二硫键形成。高浓度还原Ni离子高浓度（大于1mM）基质可逆的变棕，取决于Ni的还原

12、。低于10mM证明没有影响纯化和增加Ni的脱落低于20mM可以使用。还原条件下不要储存基质低于10mM DTT可以使用。还原条件下不要储存基质去垢剂非离子去垢剂（Triton，Tween，NP40）阳离子去污剂CHAPS阴离子去污剂（SDS、sarkosyl）TritonX-114去除背景蛋白和核酸去除内毒素低于2%可用低于1%低于1%不推荐，但是低于%有成功地先例低于2%变性剂盐酸胍尿素增溶蛋白低于6M低于8M氨基酸GlyGluArgHis与Ni-NTA吸附，并与6XHis tag 竞争不推荐不推荐不推荐低浓度可用（20mM）于阻止非特异性吸附，高浓度（大于100mM）从Ni-NTA基质洗脱

13、6XHis-tagged蛋白其他添加剂NaClMgCl2CaCl2甘油乙醇BugBuster蛋白提取试剂咪唑碳酸氢钠血红蛋白铵柠檬酸酸盐阻止离子间互作阻止蛋白的疏水作用阻止蛋白的疏水作用与Ni-NTA吸附，并与6XHis tag 竞争300mM至2M都可以用小于4M小于5mM小于50%小于20%按推荐使用低浓度可用（20mM）于阻止非特异性吸附，高浓度（大于100mM）从Ni-NTA基质洗脱6XHis-tagged蛋白不推荐不推荐不推荐低于60mMCartridge连接器Ni-NTA Superflow Cartridge能够手动纯化蛋白（用注射器），也能够自动纯化（利用层析系统，例如AKAT

14、或FPLC系统）。Cartridge进样口和出样口的尺寸和要求的连接器及手动和自动纯化所需适配器详细情形如下表表三 Ni-NTA Superflow Cartridge所需连接器如样口出样口Ni-NTA Cartridge1/16” female(AKTA)M6 male(FPLC) 使用注射器手动纯化1/16”male/luer female(Amersham,code18-1112-51)自动纯化连接器（AKTA1/16”连接器）不需要Union M6 female/1/16” female(Amersham,code18-1123-94)自动纯化连接器(M6装置，FPLC) Union

15、M6 male/1/16” female(Amersham,code18-3858-01)SRTC-2，M6 female( .)(Amersham,code18-3856-01)天然或变性条件下的纯化在变性仍是天然条件下纯化6XHis-tagged蛋白取决于蛋白的位置和可溶性，6XHis-tag的特性，下游技术的要求和生物活性都必需要维持，因此若是复性进程是可用的，变性纯化和随后的蛋白折叠复性就要考虑全面天然条件下纯化若是纯化首选而且必需在天然条件下，那么6XHis-tagged蛋白必需要溶解。尽管如此，尽管有许多蛋白出此刻包涵体，一样仍是有一些可溶物质能够在天然条件下纯化。潜在的无关的阻碍

16、Ni-NTA基质的无标签蛋白一样在天然条件下要高于变性条件，那个反映在第一次的洗液中会显现大量的蛋白。能够用含有低浓度咪唑的裂解液（Lysis Buffer）和清洗液（Wash Buffer）冲洗减少非特异性吸附无特异。有时6XHIs-tag会被天然蛋白的三级结构包埋，因此可溶蛋白要求在能够被 Ni-NTA纯化之前要求变性。作为对照，在变性条件下的平行实验应该要实行：若是只能在变性条件下纯化，Tag能够容易的移到蛋白相反的另一端。变性条件下纯化许多表达系统表达出的高水平的重组蛋白都能够形成不溶的集合体；Ecoli中形成众所周知的包涵体。变性Buffer包括6M尿素或6M盐酸胍，通经常使用来完全

17、溶解包涵体和6XHis-tag蛋白。变性条件下，蛋白中的6XHis tag会完全暴露因此Ni-NTA基质吸附效率会提高，而且基质减少了非特异性吸附，纯化效率也会升高。变性条件下纯化的6XHis-tagged蛋白能够直接用来实验，或复性再折叠。蛋白复性和重折叠能够在Ni-NTA cartridge洗脱之前完成，或在溶液中也能够；建议参考QIAexpressionist说明书：天然条件下Ecoli菌液的制备材料和试剂细胞颗粒，Buffer NPI-10，溶菌酶，Benzonase核酸酶（一级纯度，25U/ml，Merck，）,2XSDS-PAGE样品Buffer，可选择仪器：超声仪Buffer组成

18、参见Appendix A步骤：1、冰上解冻细胞颗粒，用Buffer NPI-10重悬细胞，每克湿重用2-5ml需要多少细胞取决于6XHis-tagged蛋白的表达水平和利用的表达系统。Ni-NTA基质的吸附能力是蛋白依托性的，一样为20mg/ml。Buffer NPI-10包括10mM咪唑用来降低无标签蛋白和污染蛋白的吸附，并用少量Wash步骤后增加纯度。若是标签蛋白在这些条件下没有被吸附，咪唑的量因该减少到1-5mM。若是6XHis蛋白显示出高吸附亲和力，那咪唑的浓度能够增至20mM。二、加入溶菌酶终浓度1mg/ml（50000units/ml）和Benzonase核酸酶（3U/ml）冰上孵

19、化30Min选择性的，能够加入RNase A（10/ml）和DNase I（5/ml），冰上10-15分，或用小容量的钝的注射器的针头吸吹数次溶解。2a、(可选)冰上超声波破碎 用200-300W的six 10s的脉冲，每一个脉冲距离10S的冷却期。3、4度10000Xg离心菌液20-30分，沉淀细胞残基，搜集上清可能会有必然比例的细胞蛋白，包括6XHis-tagged蛋白，仍然未溶而存在于细胞沉淀。为了取得更多的标签蛋白，材料在变性条件下纯化之前必需在变性条件下溶解。4、加入5 2X SDS-PAGE样品Buffer于5上清中，-20度贮存以备SDS-PAGE五、纯化进程见说明书说明书：变性

20、条件下Ecoli菌液的制备材料和试剂细胞颗粒；2X SDS-PAGE样品Buffer；Buffer B；可选择：BufferB/7M尿素和Benzonase核酸酶（7M尿素不变性，8M尿素变性）Buffer组成参见Appendix A步骤：一、冰上15分溶解细胞颗粒，Buffer B重悬，每克湿重5ml1a、（可选）冰上15分钟溶解细胞颗粒，BufferB/7M尿素中重悬，每克湿重5ml，加入Benzonase核酸酶，室温（20-25度）孵育30分钟需要多少细胞取决于6XHis-tagged蛋白的表达水平和利用的表达系统。Ni-NTA基质的吸附能力是蛋白依托性的，一样为20mg/ml。二、室温

21、下窑洞细胞15-60分钟或用漩涡振荡器轻轻震荡，注意幸免泡沫当溶液为半透明时说明溶解完全。3、室温10000Xg离心菌液20-30分钟沉淀菌碎片搜集上清（清澈的菌液）4、加入5 2X SDS-PAGE样品Buffer于5上清中，-20度贮存以备SDS-PAGE五、纯化进程见说明书说明书：从Ecoli菌液中制备6XHis-tagged胞质蛋白胞质蛋白是蛋白分泌到了Ecoli内膜和外膜之间的胞质中的蛋白。适当的分泌物是可能的，当目的蛋白具有N端信号肽时，他可能在转移时被切掉。为了利用Ni-NTA纯化胞质空间的分泌蛋白，6XHis tag必需被加到目标蛋白的C结尾。N结尾的6XHis tag将会与转

22、移信号一路处置掉。材料和试剂30mM ；20%蔗糖，；500mM EDTA；5mM MgSO4；Buffer NPI-10Buffer成份参见附录A步骤：一、孵育诱导1升的Ecoli产物二、4000Xg离心20分搜集细胞产物。重悬沉淀于30mM ；20%蔗糖，；每克湿重80ml。维持冰上操作，逐滴加入500mM EDTA至1mM。冰上孵育细胞5-10分钟，轻轻震荡。3、细胞悬浮液在4度8000Xg离心20分钟，弃去上清，用一样体积的冰的5mM MgSO4重悬沉淀。冰盒中震荡或摇动10分钟。4、4度8000Xg离心20分钟上清现在为浓的渗出性液体，其中包括有胞质蛋白五、继续纯化之前需要对上清进行

23、透析除去裂解液。说明书：天然条件下从昆虫细胞制备细胞溶液以下步骤关于昆虫细胞内的6XHis tag蛋白表达的纯化能够作为一个起始的步骤。尽管如此，进一步的优化可能是必需的。肃然在昆虫中的表达效率一样高于哺乳动物的，可是用杆状病毒感染昆虫细胞进行表达仍是有必然的困难。表达蛋白水平比在细菌表达系统中取得的要显著的低，一样的少量的细胞材料就能够够了。昆虫细胞中总的蛋白含量约为20mg/107个细胞。重组蛋白的表达范围为%-50%，理论上的蛋白最大产量为10g/107个细胞.关于昆虫细胞的裂解，Buffer NPI-10中应该补充1%的LgepalCA-630（NonidetP40）材料和试剂细胞颗粒

24、；PBS，Buffer NPI-10（含有1%的LgepalCA-630（NonidetP40）Buffer组成参见附录A步骤：一、用PBS清洗感染的细胞，1000Xg离心5分钟搜集细胞二、用Buffer NPI-10（含有1%的LgepalCA-630（NonidetP40）溶解细胞，没1-2X107用4ml。冰上孵育10分钟。 裂解Buffer应该包括有咪唑。关于6XHis-tagged蛋白，小于20mM咪唑可不能阻碍吸附材料。尽管如此，若是标签蛋白在这些条件下没有被吸附，咪唑浓度就应该 降低到5-10mM3、4度10000Xg离心菌液10分钟沉淀细胞碎片和DNA，搜集上清 上清中包括6X

25、His-tagged蛋白4、加入5 2X SDS-PAGE样品Buffer于5上清中，-20度贮存以备SDS-PAGE五、纯化进程见说明书说明书：利用注射器人工纯化6XHis-tagged蛋白预先预备：利用柱子之前，滤膜过滤（或0345m）或离心菌液(大于10000Xg)保证无杂质材料和设备包括6XHis-tagged蛋白的清澈的细胞液。Buffer NPI-10，NPI-20，NPI-250（天然条件）或BufferB、C、E（变性条件）。所有的Buffe字利用前都因该过滤（或0345m）。 10ml注射器。连接适配器。步骤：一、用BufferNPI-10（天然条件）或Buffer B（变性

26、条件）吸满注射器，连接适合的适配器，推注射器排除气体直至液体从适配器底部流出。二、连接注射器与cartridge的入口，把出口的塞子拿掉3、10倍体积Buffer平稳cartridge 不要用高压强行使Buffer流出。理想流速是1ml/min（1ml cartridge）和5ml/min(5ml rtridgecat)4、移去注射器并填满清澈的菌液。菌液流速要求与步骤3相同五、用一个新的注射器和相同的流速（步骤3、4），10倍体积的Buffer NPI-20（天然条件）或Buffer C（变性条件）冲洗（Wash）cartridge。六、用Buffer-NPI 250（天然条件）或Buffe

27、r E（变性条件）填满注射器，利用推荐的流速从cartridge洗脱（Elute）蛋白。蛋白一样会被5-10倍柱体积液体洗脱说明书：利用自动层析系统纯化6XHis-tagged蛋白说明书适用于液体层析系统（如AKAT货FPLC系统）。在平稳，装载，冲洗，洗脱进程中的背景压力一样会由系统产生。不要让压力超过5Bar（）材料和仪器包括6XHis-tagged蛋白的清澈的细胞液。利用柱子之前，滤膜过滤（或0345m）或离心菌液(大于10000Xg)保证无杂质。Buffer NPI-10，NPI-20，NPI-250（天然条件）或BufferB、C、E（变性条件）。所有的Buffe字利用前都因该过滤（

28、或0345m）。连接适配器。步骤;1、用BufferNPI-10（天然条件）或Buffer B（变性条件）吸满系统泵，cartridge连接泵的出口，警惕操作，不要让气体进入系统。2、移去cartridge出口的塞子，连在系统的管子上3、10倍体积Buffer平稳cartridge 1ml/min（1ml cartridge）和5ml/min(5ml rtridgecat)4、利用系统泵或superloop载入清澈的细胞液进入cartridge。保证目标蛋白吸附在Ni-NTA基质上，保留流出的部份作为SDS-PAGE分析五、用Buffer-NPI 20（天然条件）或Buffer C（变性条件）

29、填满系统泵，冲洗（Wash）cartridge直至A280回到基础值 保留洗液用于SDS-PAGE分析六、用Buffer-NPI 250（天然条件）或Buffer E（变性条件）从cartridge洗脱（Elute）蛋白蛋白一样会被5-10倍柱体积液体洗脱。用超过20倍体积的平缓的线性梯度洗液有助于分离蛋白。问题解决方式背景压力超过5Bar（）a)柱子阻塞 实施定位清洗（附录B） cartridge吸附的菌液可能含有碎片。上柱前滤膜过滤或离心b)利用了高粘性 Buffer 有机溶剂或稳固装置例如甘油会致使背景压力的增大，降低流速 蛋白未被吸附a）6XHis tag没有显现 检查表达载体的结构。

30、保证阅读框的准确性 检查可能的转移起始端（N结尾 tag）或未成熟的终止端( C结尾)b) 6XHis tag量很少 变性条件下纯化。把标签转移到蛋白相反的结尾c）6XHis tag降解 检查6XHis tag是不是与蛋白相连接D）吸附条件不正确 检查Buffer的PH。尿素的裂解常常致使PH的不稳固。在利用前应该检查PH蛋白洗脱在wash BufferA）6XHis tag部份被隐藏 变性条件纯化B）Buffer成份不正确 检查变性Wash Buffer的PH纯化进程蛋白突然沉淀A）温度太低 室温下进行纯化操作B）蛋白形成聚合体加入促溶试剂如% Triton X-100或Tween-20，20mM-ME，2M NaCl，或稳固辅助因子如Mg离子。这些都是Buffer 必需的，能维持蛋白的溶解性蛋白未被洗脱（Elute）A）蛋白在cartridge中沉淀变性条件洗脱B）蛋白仍然吸附在cartridge上检查变性溶液的PH。若是需要调整到蛋白洗脱包括污染物 污染物是切去标签的蛋白 检查可能的转移起始端（N结尾 tag）或未成熟的终止端( C结尾) 纯化进程阻止蛋白的降解，4度操作并利用蛋白抑制剂附录A：Buffer 成份NP