24D和6BA对何首乌叶片愈伤组织诱导的影响.docx

1、24D和6BA对何首乌叶片愈伤组织诱导的影响2,4-D和6-BA对何首乌叶片愈伤组织诱导的影响摘 要何首乌不仅是传统中药植物，在食用和保健方面也具有很高的使用价值。随着人们对何首乌的研究不断深入，传统的繁殖方法已经不能满足市场的需求。采用组织培养快速繁殖繁技术不仅可以保护品种的遗传性，而且不受外界条件影响，可以在较短时间内繁育出上百万株种苗。很多研究学者已对何首乌的茎、叶等通过组织培养获得再生植株。本次研究取何首乌的幼嫩叶片为外殖体，以MS为基本培养基。通过调节培养基中2，4-D、6-BA的不同浓度，研究激素对何首乌叶片诱导分化的影响，结果表明外殖体的诱导分化以MS+2，4-D (1mg/L)

2、+6-BA(0.5mg/L)+蔗糖30g/L+琼脂20g/L组合的培养基最佳，出愈率最高。关键词 何首乌，组织培养，愈伤组织ABSTRACTPolygonum multiflorum is not only the traditional Chinese medicine plants ，also has a high value in the food and health care，With the deepening of Polygonum, traditional breeding methods have been unable to meet market demand. Usi

3、ng tissue culture rapid reproduction of complicated technology not only can protect a variety of hereditary and not subject to external conditions, breeding hundred ten thousand seedlings in a relatively short period of time. Many researchers have fleece-flower root, stem, leaf tissue culture to obt

4、ain regenerated plants. This study to take Polygonum young leaves of the explants, MS medium，By adjusting the medium 2,4-D,6-BA with different concentrations to study the hormone induced differentiation of Polygonum multiflorum leaves, the results show that the induction of differentiation of the ex

5、plants to MS +2, 4-D (1mg / L) +6-BA (0.5mg / L) + sucrose 30g / L + agar 20g / L, combination of best medium, the highest callus.Key words： Polygonum multiflorum, tissue culture, callus 目 录摘 要 IABSTRACT II1 绪 论 11.1何首乌 11.1.1何首乌生物学特性 11.1.2何首乌的分布与资源状况 11.2何首乌的药理效应及其综合利用 31.2.1何首乌的化学成分 31.2.2何首乌的药理作

6、用 31.2.3何首乌的营养保健功能 51.3实验理论基础 71.3.植物细胞全能性 71.3.2细胞分化、脱分化与再分化 71.3.器官发生和胚状体发生 81.4何首乌组织培养研究概况 81.5本次研究的内容、目的和意义 91.5.1 研究内容 91.5.2 研究目的 91.5.3 研究意义 92 材料与方法 102.1实验材料 102.1.1 实验用品 102.1.2 实验材料的采集 102.2实验方案 102.2.1外植体制备 102.2.2培养基配制 112.2.3 培养基灭菌 122.2.4 接种和培养 143 实验结果与分析 163.1实验结果 163.2 实验结果分析 163.2

7、.1实验结果出愈分析 163.2.2实验褐化分析 183.2.3染菌分析 194 实验讨论 214.1 实验结果讨论 214.1.1外植体 214.1.2培养基 214.1.3接种 224.1.4褐变 224.1.4 染菌 235 结论 245.结论 245.2建议 24参 考 文 献 25致 谢 271 绪 论1.1何首乌1.1.1何首乌生物学特性何首乌为多年生草本。喜阳，耐半阴，喜湿，畏涝。要求排水良好的土壤，块根肥厚，长椭圆形，黑褐色。茎缠绕，长2-4厘米，多分枝，具纵棱，无毛。微粗糙，下部木质化。叶卵形或长卵形，长3-7厘米，宽2-5厘米，顶端渐尖，基部心形或近心形，两面粗糙，边缘全缘

8、；叶柄长1.5-3厘米；托叶鞘膜质，偏斜，无毛，长3-5毫米。花序圆锥状，顶生或腋生，长10-20厘米，分枝开展，具细纵棱，沿棱密被小突起；苞片内具2-4花；花梗细弱，长2-3毫米，下部具关节，果时延长；花被5深裂，白色或淡绿色，花被片椭圆形，大小不相等，外面3片较大背部具翅，果时增大，花被果时外形近圆形，直径6-7毫米；雄蕊8，花丝下部较宽；花柱3，极短，柱头头状。瘦果卵形，具3棱，长2.5-3毫米，黑褐色，有光泽，包宿花被内。花期8-9月，果期9-10月。1.1.2何首乌的分布与资源状况何首乌为蓼科多年生缠绕草本植物,其块根为我国名贵的中药材,主要分布在广西、广东、贵州、四川、湖北、江苏、

9、河南,此外,云、陕、陇、湘、赣、浙、闽等地也有分布。广西何首乌野生资源丰富,品种繁多,但是质量参差不齐,近几年来对野生何首乌掠夺性采挖现象非常严重,亟须进行人工栽培。何首乌在云南主要分布于昆明、曲靖、昭通、玉溪、楚雄、迪庆、丽江、临沧、思茅及红河、文山等地区。我国的主产区为河南嵩县、卢氏，湖北恩施、巴东、长阴、秭归、建始、咸丰，广西南丹、靖西，广东德庆，贵州铜仁、黔南，四川乐山、宜宾，江苏江宁、江浦等地。另外在我国华东、中南及河北、山西、陕西、甘肃、台湾等地也有分布。广东德庆何首乌的种植历史悠久，产量大，为何首乌的地道药材品种。常生于海拔16002800m的草坡、路边、山坡石隙及灌木丛中。何首

10、乌味苦、甘、涩，微温。为补益类中药。唐代李翱的何首乌传载：治五痔腰膝之病，冷气心痛，积年劳瘦痰癖，风虚败劣，长筋力，益精髓，壮气驻颜，黑发延年。妇人恶血痿黄，产后诸疾，赤白带下，毒气入腹，久痢不止，其功不可具述。日华子本草载：“治一切冷气及肠风”。宋开宝本草载：“主瘰疬，消痈肿，疗头面风疮”。宋重修政和经史证类备用本草在上述用途基础上增补了“止心痛、益血气，黑须发，悦颜色，久服长筋骨，益精髓，延年不老，亦治妇人产后及带下诸疾” 。明代兰茂滇南本草载：“久服延年耐寒”，“入肾为君，涩精，坚肾气，止赤白便浊，缩小便，入血分，消痰毒。治赤白癜风，疮疥顽癣，皮肤瘙痒”等疾病。明代李时珍本草纲目载：“汉

11、武时，有马肝石能乌人发，故后人隐此名。亦曰马肝石。赤者能消肿毒，外科呼为疮帚，红内消”。按中华人民共和国药典2000年版一部所述：何首乌性味归经为：苦、甘、涩，温。归肝、心、肾经。功能主治为：解毒，消痈，润肠通便。用于瘰疬疮痈，风疹瘙痒，肠燥便秘；高血脂。据本草及有关文献记载，古之“何首乌”药材有赤、白两种。经考证：赤者即现在全国使用的历版中华人民共和国药典一部收载品何首乌的干燥块根；其藤茎为中华人民共和国药典一部收载品首乌藤，又称夜交藤。白者即今我国北方各省习用的白首乌，其原植物为萝摩科鹅绒藤属植物白首乌的干燥块根。1.2何首乌的药理效应及其综合利用何首乌，是云台山盛产的药材之一，属蓼科多年

12、生草藤植物，其性微温，微苦，甘，涩。具益气血、黑须发、悦颜色、久服长筋骨、益精髓、延年不老等诸多功效。李时珍的本草纲目称其为“地精”，为古今中医界公认的“抗衰老中药”。何首乌是中国特有药材，其药用历史悠久，在临床有着广泛的应用。1.2.1何首乌的化学成分化学成分：块根含蒽醌类化合物，主为大黄素（emodin），大黄酚（chrysophanol）以及大黄素甲醚（physcion），大黄酸（rhein），大黄酚蒽酮（chrysophanol anthrone）。又含芪类化合物：白藜芦醇（resveratrol），云杉新甙（piceid），2，3，5，4-四羟基芪-2-O-D-葡萄糖甙（2，3，5，

13、4tetrahydroxystilbene2O-D-glucopyranoside）、 2，3，5，4-四羟基芪-2O-葡萄糖甙-2-O-没食子酸酯（2，3，5，4tetrahydroxystilbene2O-DglucoPyranoside2-O-monogalloyl ester）、2，3，5，4-四羟基芪-2O-葡萄糖甙-3-O-没食子酸酯（2，3,5，4-tetrahydroxystilbene-2O-Dglucopyrano-side-3-monogalloyl ester)。还含没食子酸（gallic acid），右旋儿茶精（catechin），右旋表儿茶精（epicatechin

14、），3O-没食子酰（）-儿茶精3-O-galloyl(-）catechin， 3O-没食子酰（-）-表儿茶精3-O-galloyl(-)-epicatechin， 3O-没食子酰原矢车菊素（3-O-galloyl-procyanidin）B-2，3，3-二-O-没食子酰原矢车菊素（3，3- diOgalloylProcyanidin）B-2和-谷甾醇（-sitosterol），卵磷脂。1.2.2何首乌的药理作用（1）促进造血功能小鼠皮下注射首乌液0.2g，每日2次，连续给药3日，可使粒系祖细胞的产率明显高于生理盐水对照组。小鼠腹腔注射何首乌提取液50mg/kg连续给药3日，可使骨髓造血干细胞明

15、显增加，还可显著提高小鼠粒一单系祖细胞产生率，并使骨髓红系祖细胞值明显升高。 （2）增强免疫功能何首乌对强的松龙和环磷酰胺引起的老年小鼠脾、胸腺抑制性改变有明显对抗作用，使脾巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数明显提高。饲喂首乌乙醇浸膏能明显提高老年大鼠外周淋巴细胞DNA的损伤修复能力。小鼠灌服制首乌 6g/kg，连续给药 7日，能明显提高腹腔巨噬细胞的吞噬能力，对强的松龙引起的吞噬指数下降，有明显的对抗作用。 （3）降血脂与抗动脉粥样硬化高脂血症大鼠每日灌胃何首乌 4g/kg，连续 10日，能较显著地降低大鼠血清总胆固醇（TC）及血清甘油三酯（TG）的含量。对于高脂血症鹌鹑，连续灌胃首乌4周，可明显降

16、低血清TC含量和提高 HDL/TC比值。另有实验证明，高脂血症及动脉粥样硬化模型家兔，何首乌灌胃7日，不仅能降低TC含量，还能减轻动脉粥样硬化斑块形成。何首乌水提液 32g/kg喂养小鼠1个月，能明显提高 HDL- C水平。何首乌掺入到饲料中喂养大鼠，90日后，也可明显升高HDL-C，而TG和TC无明显变化，对脂蛋白有明显抑制作用。何首乌醇提取液给快速动脉粥样硬化鹌鹑灌胃，连续6周，血浆HDL-C/TC比值显著升高，大剂量组作用更为显著。各给药组均有延缓动脉粥样硬化的作用。何首乌降血脂与抗胆固醇作用的有效成分包括蒽醌类、二苯烯化合物以及卵磷脂等。 （4）保肝何首乌所含的二苯烯化合物对过氧化玉米

17、油所致大鼠脂肪肝和肝功能损害，肝脏过氧化脂质升高、血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶升高等均有明显对抗作用，并使血清游离脂肪酸及肝脏过氧化脂质含量下降。在体外能抑制由ADP、 NADPH引起的大鼠肝微粒体脂质过氧化。何首乌还有增加肝糖原作用。生首乌、黑豆汁制首乌和清蒸首乌水煎液对醋酸强的松所致肝脂蓄积有对抗作用，可降低 CCl4引起的肝肿大，使肝重系数降低。 （5）延缓衰老，现代调查有维生素E制止皱纹再生。何首乌水煎液喂服老年小鼠或青年小鼠，能使脑和肝中蛋白质含量明显增加，提高老年机体DNA修复能力。何首乌的醇提物及水提物能不同程度地增加老年大鼠胸腺胞浆蛋白和核酸含量。何首乌延缓衰老作用与抗氧化作用有

18、关。老年小鼠灌服何首乌水煎浓缩液，能明显增强血中SOD活性。炮制对首乌抗氧化作用有一定影响，新法炮制品及老法炮制品均有明显提高小鼠全血及脑组织SOD活性作用，并能降低小鼠心、肝、脑组织中及血中LPO含量，生品对SOD和LPO无明显影响。首乌醇提液或水提提液均能不同程度地提高老年大鼠心、肝、脑的组织SOD含量和降低LPO含量。 （6）对内分泌的影响何首乌水煎浓缩液长期给小鼠灌胃，可使小鼠肾上腺重量明显增加。何首乌还有类似肾上腺皮质功能的作用，对摘除双侧肾上腺的小鼠，可使其应激能力明显提高，减少冷冻引起的小鼠死亡率。制首乌对去甲肾上腺素饥饿小鼠肝糖原积累，有促进作用，使肝糖原明显增加。何首乌对血糖

19、的影响有一定的时效关系，给家兔口服首乌煎剂后30、60分钟内血糖升高达峰值，之后逐渐下降，6小时后血糖比正常低。大鼠肝胰岛素受体具有高亲和力低容量，及低亲和力高容量两种受体，老年小鼠结合容量显著降低，但亲和力无变化。何首乌对容量和亲和力两个参数均无明显影响。 （7）润肠通便何首乌生用，润肠通便作用强，其有效成分大黄酚可促进动物肠管运动。部分高脂血症病人服用后，出现大便次数增加和腹泻现象。 （8）其他药理作用曾有报道，何首乌各种炮制品（生首乌、酒蒸首乌、黑豆汁蒸首乌、清蒸首乌）水煎液体外对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、宋内氏痢疾杆菌、伤寒杆菌901.副伤寒杆菌从白喉杆菌、乙型溶血性

20、链球菌等均有不同程度的。抑制作用，其中生首乌煎剂抗金黄色葡萄球菌作用比其他炮制品强，制首乌水煎剂对白色葡萄球菌，酒蒸首乌水煎剂和地黄汁蒸首乌水煎剂对白喉杆菌的抑制作用比其他首乌强。何首乌对流感病毒有一定抑制作用。此外，何首乌还有减慢心率、扩张冠脉、抗心肌缺血等作用。 综上所述，与何首乌补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨功效相关的药理作用是促进造血功能，提高机体免疫功能，降血脂，抗动脉粥样硬化，保肝，延缓衰老，影响内分泌功能，润肠通便等作用。何首乌功效作用的物质基础主要为磷脂、蒽醌类、葡萄糖苷类等成分。1.2.3何首乌的营养保健功能 ,据本草学记载白首乌是传统何首乌的正品之一，具有重要的送疗价值和食

21、用价值，作为补益药，始于唐代并沿用至今，在国内外享有盛名。为进一步利用何首乌资源，验证白首乌的传统功效，全面评价其价值，中华全国中医学会于1986年召开了“全国白首乌学术讨论会”。会上汇集了许多专家、教授的研究成果，其结果表明白首乌含有人体必需的各种氨基酸、微量元素、无机盐、维生素和其他营养成分，其营养保健作用可以与人参、西洋参相媲美。大量的临床实践亦证实，白首乌具有养血益肝、固肾益精、强筋健骨、乌须发等功效，一直被视为延年益寿、摄生防老的高级滋补品，具有良好的开发前景。( 一)补肝肾，乌须发，益精血白首乌所含谷氨酸、天门冬氨酸等多种氨基酸有重要的生理活性，临床可用于肝炎、肝昏迷的治疗，精氨酸

22、则有一定的强精作用。白首乌富含的磷脂类物质，可提高机体免疫能力维持生物膜结构的完整，时具有促进毛发生长和减少白发之功效，其有效成 分能抑制胆固醇合成，降低血清总胆固醇含量，因而可以防止动脉硬化和冠心病的发生。( 二 ) 预防癌症、肿瘤维生素是人体内必需的一类化合物。白首乌所含的维生素A、B、C、E不但是其兹补作用的物质基础之一，同时能有效地预防癌症。体外细胞培养实验和体内实验结果显示，白首乌有效成分儿对癌细胞有直接杀伤作用，总之其能激发机体抗癌的潜在能力。 1.3实验理论基础1.3.植物细胞全能性植物细胞全能性是组织培养的理论基础。一个活的植物细胞,只要有完整的膜系统和细胞核,他就会有一整套发

23、育成一个完整植株的遗传基础,在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成一个完整植株。从理论上讲,只要一个活的植物细胞,都有再生出一个完整植株的潜力,但实际情况并非如此简单。就目前所知,细胞的再生潜力与分化程度成负相关,就是说细胞分化程度越高其再生能力越低,但也有人认为细胞的再生能力与其分化程度无关,只是人们现在还没有完全掌握细胞分化的机制。虽然还没有完全从理论上揭示其原因,但事实是越老的细胞,其基因的表达就越受到严格的制约,或者说丧失功能或不表现基因的功能越多,所以应尽量选取幼嫩的植物组织作为培养的研究材料。同时,还应该考虑到,一定的基因型或外殖体的表现不同,高度分化的细胞或组织只要条件合适,

24、也有产生再生植株的可能。1.3.2细胞分化、脱分化与再分化当把一个已经失去分裂能力,处于分化成熟和分裂静止状态的细胞置于特定的增殖培养基上时,它首先发生的变化是回复到分生性状态,这一状态包括由溶酶体的活动而将失去功能的细胞质组分降解,并产生新的细胞质组分,同时细胞内酶的种类与活性发生改变,蛋白质合成和细胞代谢过程也发生改变，最后引起基因表达改变，细胞的性质和状态发生了转变。由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞团即愈伤组织现象称为“脱分化”。经过脱分化的细胞如果条件合适，就可以长久保持旺盛的分裂状态而不发生分化。由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定

25、功能的细胞团和组织，构成一个完整的植株体或植物器官的现象，叫做“再分化”。一个以分化细胞要表达出其全能性，就要通过脱分化和再分化的过程，这就是植物组织和细胞培养所要达到的目的。设计培养基和创造合适培养条件的主要原则就是如何使植物组织和细胞完成脱分化和再分化，培养的主要工作就是设计和筛选培养基，探讨和建立合适的培养条件。植物激素在调节细胞脱分化和再分化中起主要作用。植物对激素的反应十分敏感，培养基中生长素类物质和细胞分裂素物质的种类、相对比例和绝对量都能直接影响到细胞脱分化与再分化过程，组织培养中常常通过调节激素种类、浓度和相对比例来达到脱分化和再分化的目的。1.3.器官发生和胚状体发生培养的植

26、物组织与细胞在经过脱分化和再分化再生成新的植物体过程中，特别是再分化时，可经过两个途径，一是由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一培养基上产生根（或芽），形成一个完整植株，因为芽和根都是植物的器官所以这一过程叫器官发生途径。另一个是在愈伤组织中产生一些与种子中胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，由于这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似，所以叫做胚状体发生或无性胚胎发生。组织培养中，植物走器官发生途径还是胚状体途径，随植物不同而不同，也随培养基的不同而变化，有时甚至同一种植物在同一种条件下，即存在细胞胚胎发生

27、途径，也存在器官发生途径，这都是自然现象，是正常的，只是两种发育途径的频率随着基因型不同和培养条件不同而有显著的差异。何首乌作为古老的稀有物种和重要经济植物，需要得到很好的保护。真正要保护一物种，不是保护一定数量的该物种就达到目的，而是要尽可能多保护该物种的遗传变异。然而，对于何首乌的遗传变异水平和群落结构却一无所知，何首乌变异的研究仍停留在形态上的描述，要确定形态上的差异是由于生态条件造成的还是遗传性所决定的，就必须研究种内的遗传变异，分子生物学的方法将是有力的工具，如采用同工酶、RAPD技术等，只有在确定了遗传多样性和变异类型的基础上，才能有效而全面保护何首乌，同时，采用迁地保护的办法复壮

28、那些频率低、稀有的基因。1.4何首乌组织培养在研究概况植物组织培养是20世纪发展起来的一门新技术.本世纪初(1902 年)，德国植物学家GHaberlandt 最早开始植物组织培养的研究，至今已有90余年, 随着生产和科学水平的提高，植物组织培养技术已达到了一定的精确度。研究的领域从植物生理学科逐渐扩展到细胞生物学、分子生物学、遗传学、园艺学、育种学等学科。特别是近20 年来，在理论与应用上的重要性日益显著发展到细胞器培养，原生质融合培养以及当前迅猛发展的DNA重组技术。从理论上可以研究探讨细胞生长、分化的机理及其有关的细胞生理学和遗传学等问题。同时,由于生产实践不断提出新的要求，又促使了理论

29、研究与生产有机地结合起来，更使植物组织培养成为一项大有发展前途的技术。何首乌极高的药用、食用、保健医疗价值，引发人们滥采滥挖，以采集野生为主供应市场。盲目采挖之风使野生资源廖廖无几，难觅踪迹，几近灭绝，更显珍贵。近年何首乌市场价格一直稳中有升，供不应求，很多地方出现了有价无货的局面。因此，发展人工栽培何首乌前景看好。通过组织培养等手段进行何首乌的栽培与繁殖，能达到快速繁殖的目的，以满足市场上的需要。1.5本次研究的内容、目的和意义1.5.1 研究内容本次研究取何首乌的幼嫩叶片为外殖体，通过调节培养基中2，4-D、6-BA的不同浓度，研究激素配比对何首乌叶片诱导分化的影响，以期能得到较优化的诱导

30、分化培养基配方。1.5.2 研究目的本课题研究目的主要有以下几方面：（1）、通过对何首乌幼嫩叶片组织培养中不同浓度配比，得到最佳的诱导分化培养基配方。（2）、掌握组织培养相关知识，熟悉相关操作。1.5.3 研究意义何首乌，是云台山盛产的药材之一，属蓼科多年生草藤植物，是中药材中用量较大的品种之一，多年来一直是受关注的品种。鉴于其起源古老，在科学上具有重要研究价值及其重要的药用价值，被列为国家重点保护的稀有植物。何首乌传统用药的经验是用其块根，其功效有补肝、益脾、养血祛风，常用于肝肾阴亏，须发早白，血虚头晕等症，亦能治疮痒、疥癣等皮肤病。何首乌大部分为野生，由于该产品多为块根繁殖，是一种生长周期

31、较长的草藤植物,一般需要34年才能采挖。近年来， 随着科学进步的不断发展，何首乌的用途迅速拓宽，该品不但被众多中成药企业看好，同时亦是化工和保健品的重要生产原料。据悉，目前市场上80%以上的洗发液、洗发膏均含有何首乌成分；50%以上的护肝、补肾中成药及保健产品含有何首乌原料。随着国内国际市场对何首乌的需求逐年增加，产区群众在利益的驱动下，一哄而起，连年采取地毯式的滥采滥挖，掘地三尺，甚至连幼根也不放过，使野生资源遭到严重破坏，野生何首乌的产量每年递减20%左右。何首乌产量的逐年下滑，库存空虚及市场需求的有增无减，使得“物以稀为贵”，造成何首乌价格暴涨。由于何首乌用量逐年增大，但资源却日趋枯竭，

32、濒临绝迹。因此保护何首乌资源已迫在眉睫。而植物组织培养具有生长周期短，繁殖率高，成本低，利于工厂化等诸多优点，因此利用现代生物工程技术植物组织培养，能够很好的保护何首乌资源。2材料与方法2.1实验材料2.1.1 实验用品材料：初生23周何首乌幼嫩叶片；药品：硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA器皿和工具：刀，培养皿，锥形瓶，托盘天平，分析天平，烧杯，电炉，玻棒，试管，酒精灯，长柄镊子，贴标纸，记录笔，牛皮纸，细绳。主要设备：手提式不锈钢蒸汽灭菌锅 型号：YX280B 接种